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Bioengineering

Primärklärung der CHO geernteten Zellkulturflüssigkeit mittels eines akustischen Separators

Published: May 14, 2020
doi:
10.3791/61161
, , ,
1Center for Drug Evaluation and Research, Office of Product Quality, Office of Biotechnology Products, Division of Biotechnology Review and Research II,U.S. Food and Drug Administration

Summary

Hier wird ein Protokoll zur Primärklärung der CHO-Zellkultur mittels eines akustischen Separators vorgestellt. Dieses Protokoll kann für die primäre Klärung von Schüttelkolbenkulturen oder Bioreaktorernten verwendet werden und hat die potenzielle Anwendung für die kontinuierliche Klärung des Zellentlüftungsmaterials während des Perfusionsbioreaktorbetriebs.

Abstract

Die Primärklärung ist ein wesentlicher Schritt in einem Bioproduktionsprozess für die initiale Entfernung von Zellen aus therapeutischen Produkten innerhalb der geernteten Zellkulturflüssigkeit. Während traditionelle Methoden wie Zentrifugation oder Filtration für die Zellentfernung weit verbreitet sind, haben die Geräte für diese Prozesse große Stellflächen und der Betrieb kann Kontaminationsrisiken und Filterverschmutzung beinhalten. Darüber hinaus sind traditionelle Methoden möglicherweise nicht ideal für kontinuierliche Bioprozessschemata zur Primärklärung. So wurde eine alternative Anwendung unter Verwendung akustischer (Schall-) Wellen untersucht, um Zellen kontinuierlich von der Zellkulturflüssigkeit zu trennen. In dieser Studie wird ein detailliertes Protokoll für die Verwendung eines akustischen Wellenseparators (AWS) im Bench-Scale-Bereich für die primäre Trennung von Kulturflüssigkeit vorgestellt, die einen monoklonalen IgG1-Antikörper aus einer CHO-Zell-Bioreaktorernte enthält. Repräsentative Daten werden aus dem AWS präsentiert und zeigen, wie eine effektive Zellklärung und Produktwiederherstellung erreicht werden kann. Abschließend werden mögliche Anwendungen für AWS in der kontinuierlichen Bioprozesstechnik diskutiert. Insgesamt liefert diese Studie ein praktisches und allgemeines Protokoll für die Implementierung von AWS in der Primärklärung für CHO-Zellkulturen und beschreibt dessen Anwendungspotenzial in der kontinuierlichen Bioprozessierung weiter.

Introduction

Ein kritischer Schritt in einem Bioproduktionsprozess mit sezernierten therapeutischen Proteinen ist die Entfernung von Biomasse aus geernteter Zellkulturflüssigkeit (HCCF). Traditionell haben Biohersteller die Zentrifugation gefolgt von der Tiefenfiltration als primäre Klärungsmethode bei der Herstellung monoklonaler Antikörper übernommen1. Die Zentrifugation kann jedoch zu einer hohen Scherbelastung der Zellen führen, was zu erhöhten Zelltrümmern im HCCF führt. Dies kann möglicherweise zu Filterverschmutzung während der Filtration führen und zu zusätzlichen Verunreinigungen nach der Filtration führen, die anschließend die nachgeschaltete Chromatographieeffizienz verringern können1,2,3. Darüber hinaus kann die Anpassung der Zentrifugen für einen bestimmten Prozess kostspielig sein und zusätzliche Verbindungen zu Clean-in-Place- und Sterilize-in-Place-Systemen erfordern, die auch ein limitierender Faktor für die Skalierbarkeit sein können. Der Einsatz von Tiefenfiltern kann die Einschränkungen der Zentrifugation ausgleichen und auch die Vorteile der Einwegtechnologienutzen 4. Tiefenfilter werden jedoch in erster Linie als Sekundärklärung eingesetzt, da sie hohen Zellkulturdichten nicht standhaltenkönnen 5. Alternativ wurden Tangential Flow Filtration (TFF) Zellretentionsgeräte eingesetzt, um Scherstress zu mildern, können jedoch Herausforderungen wie Membranpolarisation und schlechte Ernteerträge erfahren6. Die oben genannten Probleme, die sich aus dem Einsatz von Zentrifugation plus Tiefenfiltration oder TFF ergeben, schaffen eine Möglichkeit zur Verbesserung des Primärklärungsprozesses von HCCF.

Die akustische Trennung wurde als eine Technologie eingeführt, die für die Gewinnung sezernierter Proteine aus Zellkulturen mit hochwertigen Proteinprodukten verwendet werden kann7,8. Die akustische Trennung wird durch die Ausbreitung und Reflexion von mehrdimensionalen stehenden Wellen erreicht, die mit suspendierten Flüssigkeiten und zurückgehaltenen Partikeln interagieren9,10. Diese Partikel erfahren drei Kräfte: Flüssigkeitswiderstand, Schwerkraft und akustische Strahlung. Wenn jede der Kräfte einander gleich entgegengesetzt ist und ein Gleichgewicht erreicht, werden die Partikel suspendiert und in der stehenden Ultraschallwelle10gefangen. In einer Zellkultursuspension werden Zellen innerhalb dieser Druckknotenebene stehender Wellen gehalten, der Knoten wächst, wenn Zellen verschmelzen, und schließlich fallen diese Cluster von Zellknoten von der Gravitationskraft9. Diese sedimentierten Zellen werden dann aus dem Medium entfernt, wodurch die geklärten Medien zur weiteren Weiterverarbeitung abgepumpt werden können. Die Verwendung von Ultraschallwellen als Trennmethode hat begonnen, sich in biologische Anwendungen zu übersetzen, die von der Trennung von Lipidpartikeln und roten Blutkörperchen11 bis zur Perfusionszellkultur von Säugetieren12reichen. Mit seinen relativen Fähigkeiten, Kosten, Arbeit und zellulären Stress durch Vermeidung von Zentrifugation, Tiefenfiltration oder TFF zu reduzieren, erforschen Biohersteller die potenziellen Anwendungen der Verwendung von akustischer Trennung.

Diese Studie bietet ein allgemeines Protokoll für den Betrieb eines akustischen Wellenseparators (AWS) zur Klärung der CHO-Zellkultur, präsentiert repräsentative Daten und zeigt, wie eine effektive Zellklärung und Produktrückgewinnung erreicht werden kann.

Protocol

1. Vorbereitung von AWS HINWEIS: Dieses Protokoll wurde unter Verwendung einer akustophoretischen Kammer entwickelt. Die Bench-Scale-AWS verfügt jedoch über fünf Trübungssonden, die bei Bedarf 4 akustophoretische Kammern in Reihe betreiben können. Schließen Sie die Trübungskabel an ihre jeweiligen Ports an, die als F, 1, 2, 3, 4 gekennzeichnet sind (z. B. Trübungssonde 1 in Abbildung 1c und Port 1 in Abbildung 2a)und die BNC-Kabel der Kammer mit der Rückseite des AWS-Systems, die als 1, 2, 3, 4 gekennzeichnet sind (Abbildung 2b).HINWEIS: Schließen Sie das andere Ende des BNC-Kabels ( Abbildung 3c ) erst nach Schritt2.6an die Rückseite der akustophoretischen Kammer (Abbildung 3d) an, wenn die Kammer mit Flüssigkeit gefüllt ist. Wenn die Kammerstromversorgung eingeschaltet wird, ohne dass flüssigkeit in der Kammer ist, wird der Piezowandler in der Kammer beschädigt und funktioniert nicht mehr. Setzen Sie die Trübungssonden in das Trübungsmessgerät und das Thermometergehäuse ein und ziehen Sie die Schrauben fest (Abbildung 1c und Abbildung 3). Schließen Sie den Futterschlauch über die Förderpumpe ( Abbildung 1b bis 1c) an den Eingang des Einspeisetrübungsanschlusses ( Abbildung4a) an. Schließen Sie den Y-Schlauch vom Ausgang des Zufuhrtrübungsanschlusses (Abbildung 4b) an die Einlassöffnungen der akustophoretischen Kammer an (Abbildung 4c). Verbinden Sie den Stufe1-Schlauch vom Abfallanschluss der akustophoretischen Kammer (Abbildung 4d) über die Stufe1-Pumpe mit einem Zellsammelgefäß (Abbildung 1d über 1e bis 1f). Verbinden Sie den Schlauch vom Permeatanschluss der akustophoretischen Kammer (Abbildung 4e) mit dem Eingang des Trübungsports der Sonde1 (Abbildung 4f). Schließen Sie den Ernteschlauch von außerhalb des Trübungsanschlusses der Sonde1 (Abbildung 4g) an ein Produktsammelgefäß an (Abbildung 1c bis 1g). 2. Bereiten Sie das System mit HCCF vor HINWEIS: Dieses Protokoll wurde unter Verwendung von CHO-K1-Zellen entwickelt, die in chemisch definiertem Medium (ActiCHO P mit 6 mM L-Glutamin) kultiviert wurden und den monoklonalen IgG1-Antikörper VRC0113 produzieren, und muss möglicherweise für andere Zelllinien und Produkte angepasst werden. Die in diesem Protokoll verwendete HCCF wurde am Ende von 7-8 Tagen CHO-K1-Kulturen aus einem Schüttelkolben oder Bioreaktorprozess gewonnen. Schalten Sie AWS ein, indem Sie die Netzschalter auf der Rückseite und Vorderseite des AWS einschalten. Schalten Sie den Computer ein und doppelklicken Sie auf das Schreibtischsymbol für die zugehörige Software (siehe Tabelle der Materialien). Drücken Sie im Bereich “Messwerte” die Taste “Test starten”, um die Datenaufzeichnung zu starten (Abbildung 5). Sobald die Datenaufzeichnung initiiert wurde, werden alle gesammelten Daten in einer exportierbaren Tabelle aufgezeichnet, bis der Test gestoppt wird. Verbinden Sie das Futterschlauchende mit dem zu rührenden HCCF-Behälter. Starten Sie die Förderpumpe, indem Sie die Pumpenrate auf dem Bildschirm “Steuerungen” innerhalb des “Feed Pump Image” eingeben und “Enter” auf der Tastatur drücken. Stellen Sie sicher, dass das”Pump Direction Arrow Icon”(im Uhrzeigersinn oder gegen den Uhrzeigersinn) im grauen Feld rechts neben dem Feed Pump Image korrekt ausgewählt ist, um HCCF aus dem Behälter in die akustophoretische Kammer zu pumpen. Klicken Sie auf das “Dreieckssymbol” neben den Worten “Einschalten” innerhalb des grauen Feldes unter dem Bild der Einspeisepumpe, um die Pumpe zustarten(Abbildung 6a).HINWEIS: Die maximale Pumpleistung beträgt 10 l/h (167 ml/min), es wird jedoch empfohlen, für diesen Schritt den Nenndurchfluss von 60 ml/min zu verwenden, um den Schlauch und die Kammer schnell zu füllen, ohne die Kammer vor Beginn der Trennung zu überfüllen. Überwachen Sie die Trübungsmessungen des Futters, indem Sie das “Percent Reduction Panel” ( Abbildung5c) während der Befüllung der akustophoretischen Kammer beobachten. Die Trübungswerte bleiben während der Beladung der Kammer konstant, wenn der HCCF im HCCF-Behälter ausreichend gemischt wird. Sobald sich die Flüssigkeit über dem Piezowandler auf der Rückseite der akustophoretischen Kammer befindet, drücken Sie “Ausschalten” in der grauen Box unter dem Bild der Zufuhrpumpe, um die Pumpe anzuhalten. Schließen Sie das BNC-Netzkabel (Abbildung 3c) an die akustophoretische Kammer an (Abbildung 3d).HINWEIS: Das Stauvolumen jeder akustophoretischen Kammer beträgt etwa 190 ml. 3. Betrieb von AWS Sobald die akustophoretische Kammer gefüllt und das BNC-Stromkabel an der Rückseite der akustophoretischen Kammer angeschlossen ist, ändern Sie die Rate der Speisepumpe auf die gewünschte Betriebsrate (Abbildung 6a und Tabelle 1). Mehrere Förderpumpenraten sollten getestet werden, um die idealen Betriebsparameter für einen bestimmten Prozess zu identifizieren. Schalten Sie die Piezoleistung der Stufe1 ein, indem Sie die Leiste im Leistungsmodul auf 10 W(Abbildung 6d)verschieben und das Symbol “Einschalten” auf der rechten Seite des Felds “Stufe 1” drücken (Abbildung 6c). Wie vom Hersteller empfohlen, verwenden Sie 10 W, die empfohlene Leistungseinstellung für CHO-Zellen. Dadurch wird eine feste Frequenz von 2 MHz für den Betrieb erzeugt. Nach einigen Sekunden beginnen die Zellen sichtbar an den Wellenknoten in der akustoretischen Kammer zu verklumpen (Abbildung 7a). Sobald sich die Zellen am Boden der akustophoretischen Kammer absetzen ( Abbildung 7b ), starten Sie dieStufe1-Pumpemit einer geeigneten Rate basierend auf der Zelldichte und der Zufuhrpumpenrate (Abbildung 6b). Basierend auf der Optimierungs- und Steady-State-Betriebstabelle des Herstellers kann die Pumprate der Stufe1 basierend auf der Masse der verpackten Zelle und dem Durchfluss der Zufuhr mit der folgenden Gleichung berechnet werden Um die gepackte Zellmasse zu berechnen, taran Sie eine Skala mit einem leeren 15-ml-Röhrchen (oder einem anderen Röhrchen, das mit der Zentrifugation kompatibel ist). Füllen Sie das Röhrchen mit Aufgabematerial und erfassen Sie das Gesamtgewicht des Röhrchens mit Futter. Zentrifugieren Sie das Röhrchen für 10 min bei 3.700 x g. Dekantieren Sie den Überstand in einen separaten Behälter. Messen Sie das Gewicht des Röhrchens mit dem Zellpellet. Der Prozentsatz der verpackten Zellmasse des Aufgabematerials = (Gewicht des dekantierten Röhrchens/Gewicht des gefüllten Rohrs) x 100%. Überwachen Sie das Trübungsprofil der Trübung des Stadiums1, wenn der Überlauf aus der akustophoretischen Kammer in die Trübungssonde1 eintritt (Abbildung 8). Wenn die Zelltrennung fortschreitet, wird die Effizienz der Zellentfernung zunehmen. Überwachen Sie außerdem die Temperaturdifferenz zwischen Feed und Stufe1, da sie mit fortschreitender Zelltrennung zunimmt (Abbildung 9). Die Temperatur kann ansteigen, wenn eine höhere Zelldichte verwendet wird, kann aber im Allgemeinen durch Änderung der Vorschubflussrate reduziert werden.HINWEIS: Bei Verwendung mehrerer akustophoretischer Kammern kann man den Schlauch aus der vorherigen akustophoretischen Kammer über Trübungssonden sequentiell mit dem Eingang der aktuellen akustophoretischen Kammer verbinden. Darüber hinaus kann man Bühnenschläuche vom Boden der akustophoretischen Kammern über Stufenpumpen mit Zellsammelgefäßen verbinden. Insgesamt vier akustophoretische Kammern können bei Bedarf für eine optimale Zellentfernungseffizienz in Reihe geschaltet werden. 4. Beenden von AWS Wenn der Lauf vorbei ist, stoppen Sie die Zufuhr und die Stufe1-Pumpe, indem Sie in der grauen Box unter der Zufuhrpumpe bzw. den Stufe1-Pumpenbildern auf Ausschalten drücken, um die Pumpen anzuhalten. Schalten Sie die Kammer aus, indem Sie auf der rechten Seite des Stage 1-Kastens auf Ausschalten klicken und das BNC-Netzkabel trennen. Nehmen Sie das gesammelte Produkterntematerial für weitere Klärungs- und Reinigungsverfahren wie Tiefenfiltration und Chromatographiemethoden. Entsorgen Sie das Zellerntematerial. Lassen Sie die verbleibende Flüssigkeit in der akustophoretischen Kammer ab, indem Sie den Abfallschlauch in ein leeres Gefäß legen, den Schlauch vom Einlass der akustophoretischen Kammer und den Permeatkanälen trennen und den Abfallschlauch vom Pumpenkopf lösen. Schließen Sie den Schlauch wieder an, legen Sie den Abfallschlauch wieder in den Pumpenkopf und fließen Sie durch DI-Wasser vom Ende des Zufuhrschlauchs mit einer Förderpumpenrate von 60 ml / min und einer Pumpenrate der Stufe1 von 60 ml / min. Fahren Sie 15–20 Minuten weiter. Verwerfen Sie den Durchfluss. Pumpen Sie 70% Isopropylalkohol (IPA) durch den Schlauch und die Kammer mit der Förderpumpe für 15-20 min. Verwerfen Sie den Durchfluss. Wiederholen Sie den Reinigungsvorgang mit DI-Wasser, um die Rohre und die Kammer zu reinigen, indem Sie die Zufuhrpumpe für 15-20 Minuten verwenden. Verwerfen Sie den Durchfluss. Zerlegen Sie den Schlauch von den Trübungssonden und akustophoretischen Kammern und reinigen Sie den Bereich mit 70% IPA. Zerlegen Sie die Trübungssonden und reinigen Sie die Trübungssonden mit 70% IPA. Lassen Sie alle Teile an der Luft trocknen und bauen Sie sie dann für den nächsten Gebrauch wieder zusammen.HINWEIS: Die akustophoretischen Kammern werden für den einmaligen Gebrauch hergestellt, können aber wiederverwendet werden, wenn sie ordnungsgemäß gehandhabt und gereinigt werden, wie in diesem Protokoll beschrieben.

Representative Results

Wie im Protokoll beschrieben, wurde die AWS verwendet, um HCCF bei einer Dichte von 12,4 x 106 Zellen/ml zu klären, wie in Abbildung 1gezeigt. Die Förderpumpe wurde auf 3,5 ml/min (5 l/Tag) eingestellt, was einer Zellentlüftungsrate innerhalb des vermuteten geeigneten Bereichs für eine 10–20 l Kultur entspricht. Als der HCCF in die AWS-Kammer eindrang, blieben die Trübungsmessungen der Futtertrübungssonde konsistent, etwa 1.000–1.100 NTU, und die Messungen der Trübungssonde Sonde1 blieben bei etwa 40–50 NTU(Abbildung 8). Mit den beiden Messungen, Zellentfernungseffizienz wurde berechnet und durchschnittlich 95%. Es wurde festgestellt, dass eine Trübungsmessung von 40–50 NTU der erreichbare Mindesttrübungswert war und somit keine weitere Trennung von einer zusätzlichen AWS-Kammer in Reihe möglich war. Während sich der AWS mit hoher Effizienz bei niedrigeren Durchflussraten trennen konnte, führte die längere Aufbewahrung des HCCF in der Kammer zu Temperaturerhöhungen, was bei der Auswahl niedrigerer Durchflussraten eine Überlegung sein sollte. Abbildung 9 ist ein Beispiel für die Temperaturdifferenz des HCCF vor dem Eintritt in die akustophoretische Kammer und nach der akustischen Trennung bei einem Zufuhrdurchfluss von 3,5 ml/min, der aufgrund längerer Zeit in der Akustikkammer einen Temperaturanstieg von >6 °C zeigte. Eine weitere wichtige Überlegung bei Ernten mit hoher Zelldichte (d. H. >20 x 106 Zellen / ml) ist die Sättigung der Trübungssonden. Die Trübungsmessungen für die Futtertrübungssonde wurden über 4.400 NTU gesättigt (Abbildung 10), was zu einer Unterschätzung bei der Berechnung der Zellentfernungseffizienz führen kann. Um den Effekt unterschiedlicher Vorschubgeschwindigkeiten auf die Zellklärung zu testen, wurde die Zellentfernungseffizienz bei unterschiedlichen Vorschubgeschwindigkeiten gemessen. Wie in Abbildung 11gezeigt, sank die Zellentfernungseffizienz signifikant von ~ 100% auf 57%, da die Förderpumpenrate zunahm. Generell gilt: Je langsamer die Förderpumpenrate, desto besser die Zellklärung. Für jede Anwendung wird jedoch eine Optimierung der Vorschubgeschwindigkeit empfohlen. Abbildung 1: AWS-Einrichtung. Sobald die Pumpen mit der Software (a) eingeschaltet wurden, wurde der HCCF über eine Förderpumpe (b) durch die Futtertrübungssonde (c) und dann in die AWS-Kammer (d) geleitet. In der Kammer fesselten akustische Kräfte Zellen aus dem Fluss in Wellenknoten und verursachten Verklumpungen. Ein verminderter Auftrieb führte dazu, dass zellen durch gravitative Kraft abfielen, und Zellen wurden aus dem Abfallhafen der akustophoretischen Kammer über stufe1 Pumpe (e) zu einer Zellernteflasche (f) entfernt, während das geklärte Material durch den Permeatanschluss der Kammer zu einer Produkternteflasche (g) zur Sonde1 Trübungssonde (c) gelangte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 2: Rückseite des AWS-Systems. Die Trübungssonden und die Kammern sind über Trübungssonden-Ethernet-(a)und BNC(b)-Kabel mit der Kammerleistung an ihre jeweiligen Ports auf der Rückseite des AWS-Systems angeschlossen. Außerdem ist der Computer über ein PC-Ethernet-Kabel (c) angeschlossen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 3: Trübungssonden und Gehäuse. Jede Trübungssonde (a) muss ordnungsgemäß in das jeweilige Trübungsmessgerät und Thermometergehäuse (b) eingeführt und mit den Schrauben festgezogen werden. Das BNC-Kabel (c) der Kammerleistung sollte erst dann an die Rückseite der akustophoretischen Kammer (d) angeschlossen werden, nachdem der Piezoaufnehmer in der Kammer mit Flüssigkeit gefüllt wurde. Die Sonden sind wie folgt angegeben: F = Futtertrübung, 1 = Trübung der Sonde1 und 2, 3 und 4 sind nicht verwendete Sonden (oder können zur Serialisierung des Verfahrens verwendet werden). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 4: Zusammenhang zwischen dem Trübungsgehäuse und der akustophoretischen Kammer. Der Futterschlauch ist über die Förderpumpe mit dem Eingang des Futtertrübungsports(a)verbunden. Der Ausgang des Futtertrübungsports (b) ist über einen y-Schlauch mit den Einlassöffnungen der akustophoretischen Kammer (c) verbunden. Der Stufe1-Schlauch wird vom Abfallanschluss der akustophoretischen Kammer(d)über die Stufe1-Pumpe mit einem Zellsammelbehälter verbunden. Der Permeatport der akustophoretischen Kammer (e) ist mit dem Eingang des Trübungsports der Sonde1 (f) verbunden. Der Ernteschlauch wird von außerhalb des Trübungsanschlusses der Sonde1 (g) mit einem Produktsammelbehälter verbunden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 5: Messwerte in der Acoustic Separator-Software. Das Programm hat zwei Panels, “Readings” und “Controls”. Innerhalb des Panels “Messwerte” werden Trübung (a), Temperatur (b) und prozentuale Reduktion (c) überwacht. Um die Datenaufzeichnung zu starten, muss die Schaltfläche “Test starten” (d) angeklickt werden, wodurch die Farbe der Schaltfläche in Grün geändert wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 6: Bedienfeld im Programm. Innerhalb des Panels “Controls” können die Pumpen ein- oder ausgeschaltet werden, und die Pumprate kann für die Zufuhr (a) und andere Stufen (b) geändert werden. Auch die Kammerleistung am Piezowandler kann ein- oder ausgeschaltet werden (c) und mit einem Schieberegler (d) geändert werden. Die Experimente verwendeten 10 W, da dies die empfohlene Leistungseinstellung für CHO-Zellen ist, wie vom Hersteller empfohlen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 7: AWS Chamber. Sobald sich die Zellen in der Kammer befanden, fingen die akustischen Kräfte die Zellen in Wellenknoten ein und veranlassten die Zellen, sich zu gruppieren (a). Diese Zellhaufen nahmen an Größe zu, bis sie ihren Auftrieb verloren und sich schließlich durch die Gravitationskraft absetzten (b). Als nächstes wurden die abgesetzten Zellen aus dem Abfallport der akustophoretischen Kammer über eine Stufe1-Pumpe zu einer Zellernteflasche (c) entfernt. Das Produkt verließ die Kammer durch permeaten Anschluss (d), während HCCF die Kammer kontinuierlich über Einlassöffnungen (e) füllte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 8: Trübungsmessungen für eine 12 x 106 Zellen/ml CHO-Zellkultur mit einer Förderpumpenrate von 3,5 ml/min. Die Futtertrübung (blau) betrug ungefähr 1.000 NTU und das Permeat, das das Trübungsmessgerät der Stufe 1 (orange) verließ, betrug 40-60 NTU. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 9: Temperaturmessungen für eine 12 x 106 Zellen/ml CHO-Zellkultur mit einer Förderpumpenrate von 3,5 ml/min. Die Futtertemperatur (blau) betrug ca. 21 °C und das Permeat, das aus dem Trübungsmesser der Stufe 1 (orange) austritt, betrug ca. 27 °C. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 10: Beispiel für eine Trübungsmessung für eine Probe mit hoher Zelldichte. Wenn die Zelldichte >20 x 106 Zellen/ml betrug, wurde die Futtertrübungsmessung mit dem Maximalwert von 4.400 NTU gesättigt, was zu einer Unterschätzung der Zellentfernungseffizienz führte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 11: Vergleich der Effizienz der Zellentfernung. Mit zunehmender Vorschubgeschwindigkeit nahm die Zelltrennung ab. Mit zunehmender Vorschubgeschwindigkeit nahm die Effizienz der Zellklärung ab. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Parameter Spezifikation Durchfluss 0 – 10 l/h Druckbereich 0 – 2 bar (0 – 30 psi) Temperatur der Zufuhrflüssigkeit 0 – 40 °C (32 – 104 °F) Betriebstemperatur 0 – 40 °C (32 – 104 °F) Tabelle 1: Betriebsbedingungen. Die vom AWS-Hersteller empfohlenen Betriebsbedingungen für Durchfluss, Druckbereich, Zufuhrflüssigkeit und Betriebstemperatur.

Discussion

Beschrieben ist ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Implementierung eines Bench-Scale-AWS zur Primärklärung eines monoklonalen Modellantikörpers aus HCCF einer CHO-Zelllinie. Wie die repräsentativen Ergebnisse zeigen, führte der Einsatz der AWS in der Primärklärung zu einer effektiven Zellklärung und Produktwiederherstellung. Darüber hinaus ermöglichen der geringe Wartungs- und Betriebsaufwand sowie die Scale-up-Fähigkeit ein breiteres Anwendungspotenzial in der Primärklärung.

Wichtig ist, dass die repräsentativen Ergebnisse darauf hindeuten, dass die Förderpumpenrate für die Trennung der Zellen entscheidend ist. Darüber hinaus ist die Arbeitszelldichte aufgrund von Einschränkungen bei der Erkennung einer hohen Zelldichte bei der Trübungsmessung ein weiterer Faktor, der bei der Verwendung eines AWS-Systems zu berücksichtigen ist. Da die Trübungssonde beim Betrieb von Futtermittelmaterial mit hoher Zelldichte gesättigt ist, ist es möglicherweise am besten, die Zelltrenneffizienz zu berechnen, indem die Zelldichten des Einzelfuttermaterials gemessen und die Zellkulturflüssigkeit offline geklärt werden. Mit einer genauen Offline-Messung der Klärung ist eine Prozessstrategie, die bei der Lösung dieser Probleme in Betracht gezogen werden kann, die Verwendung mehrerer Kammern in Reihe. Obwohl sich dieses Protokoll in erster Linie auf die Verwendung einer einzigen Kammer konzentriert, kann dieses System drei zusätzliche Kammern zur sequentiellen Klärung der Zellen betreiben, die den Zustand der Zellen minimal beeinflussen und zu einer hohen Produktrückgewinnung führen können. Darüber hinaus können andere Parameter, wie z. B. die Leistung für AWS und die Durchflussraten der Zellentfernung, für bestimmte Zelltypen oder Betriebsarten weiter optimiert werden. Insgesamt wird vor der Implementierung von AWS eine Optimierung der Betriebsparameter und der Strategie unter Verwendung dieser Überlegungen empfohlen.

Neben vielen Anwendungspotenzialen ist der Einsatz von AWS in der kontinuierlichen Bioprozesstechnik vielversprechend. Da AWS die Zentrifugation ersetzen und die Filteroberfläche drastisch reduzieren kann14,würde die Verwendung von AWS einen konstanten Fluss von zellfreiem Material für nachfolgende Filtrations- und Chromatographieprozesse ermöglichen, die mit der kontinuierlichen Bioproduktion kompatibel sind. Aufgrund dieser Kompatibilität und der Verfügbarkeit der Perfusionstechnologie für eine hohe Zelldichte (z. B. >50 x 106 Zellen/ml) und eine längere Kulturdauer (z. B. >14 Tage) hat AWS das Potenzial, zusätzlich zur primären Klärung eine neuartige kontinuierliche Zellblutungsstrategie zu entwickeln.

In einigen Fällen werden bis zu 30% des produzierten Proteintherapeutikums während des Steady-State-Betriebs im Zellblutungsmaterial15,16entfernt. Darüber hinaus müssen für die Bündelung der entfernten monoklonalen Antikörper mit dem Standard-Erntegut bestimmte Qualitätsmerkmale erfüllt sein. Wenn diese Spezifikationen nicht erfüllt werden, kann das Ergebnis eine Ablehnung von Material sein, die sich auf die Produktausbeute auswirken kann. Um einen solchen Produktverlust auszugleichen, kann eine kontinuierliche Klärung des Zellentlüftungsmaterials mit AWS in einem stationären Zustand während eines langfristigen Perfusionsprozesses implementiert werden17. Diese Strategie kann den Produktverlust im Blutgut reduzieren und mehr von dem produzierten Protein verwenden. Darüber hinaus könnten Zellen nach der kontinuierlichen Klärung mit AWS möglicherweise wieder in den Bioreaktor aufgenommen werden, wenn dies für eine höhere Zelldichte und Produktivität gewünscht wird. Daher kann die kontinuierliche Klärung von Zellentlüftungsmaterial mit AWS die Möglichkeit bieten, die Ausbeute zu erhöhen und/oder die Sekundärfilteroberfläche in einem bestimmten Prozess zu verringern.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der Nutzen von AWS nicht auf eine einfache primäre Klärung beschränkt ist, sondern für Anwendungen in der kontinuierlichen Bioverarbeitung nützlich sein kann, die die Fertigungsrate und die betriebliche Flexibilität verbessern können.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken Nilou Sarah Arden und Zhong Zhao für ihre konstruktive Begutachtung dieses Manuskripts. Die Autoren danken auch Lindsey Brown für den wesentlichen Input während dieses Projekts. Teilweise interne Finanzierung und Unterstützung für diese Arbeit wurde durch das CDER Critical Path Program (CA #1-13) und das CDER Manufacturing Science, Innovation Center of Excellence Program (Berilla-CoE-19-49) bereitgestellt. Dieses Projekt wurde zum Teil durch das Internship/Research Participation Program im Office of Biotechnology Products, U.S. Food and Drug Administration, unterstützt, das vom Oak Ridge Institute for Science and Education durch eine behördenübergreifende Vereinbarung zwischen dem US-Energieministerium und der FDA verwaltet wird.

Diese Veröffentlichung spiegelt die Ansichten des Autors wider und sollte nicht so ausgelegt werden, dass sie die Ansichten oder Richtlinien der FDA darstellt.

Materials

Acoustophorectic chamber Pall CAS-AC-K1 Cadence acoustic chamber kit
ActiCHO P GE SH31025.01 powder medium
AWS Pall CAS-SYS (60500101-SP)
Cadence Acoustic Separator Software Pall Cadence Acoustic Separator Interface Ver. 1.0.4
CHO-K1 cells VRC VRC01
Computer Dell Latitude 3470 Windows 7, 64 bit OS
Isopropanol (70%) LabChem LC157605 20L prepped 70% IPA
L-glutamine Corning 25-005-CV 200 mM stock solution
Masterflex L/S 14 tubing Cole-Parmer 96400-14 peroxide-cured silicone tubing, 25ft
Masterflex L/S 16 tubing Cole-Parmer 96400-16 peroxide-cured silicone tubing, 25ft
Tubing set Pall CAS-FP-K1 Tubing set
Turbidity probe Pall CAS-TS-S1 (60500106)
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References

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CHOHarvested Cell Culture FluidAcoustic Wave SeparatorPrimary ClarificationTurbidityCell-freeContinuous BioprocessingFiltrationChromatography

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Hong, J. S., Azer, N., Agarabi, C., Fratz-Berilla, E. J. Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator. J. Vis. Exp. (159), e61161, doi:10.3791/61161 (2020).
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