Clarification primaire du fluide de culture cellulaire récolté par CHO à l’aide d’un séparateur acoustique

1. Préparation d’AWS NOTE: Ce protocole a été développé à l’aide d’une chambre acoustophorétique. Cependant, l’AWS à l’échelle du banc dispose de cinq sondes de turbidité qui peuvent faire fonctionner 4 chambres acoustophorétiques en série si nécessaire. Connectez les câbles de turbidité à leurs ports respectifs étiquetés F, 1, 2, 3, 4 (par exemple, sonde de turbidité 1 dans la Figure 1c et port 1 dans la Figure 2a) et les câbles BNC d’alimentation de la chambre à l’arrière du système AWS étiquetés comme 1, 2, 3, 4 (Figure 2b).REMARQUE: Ne connectez pas l’autre extrémité du câble BNC d’alimentation de la chambre (Figure 3c) à l’arrière de la chambre acoustophorétique (Figure 3d) jusqu’à l’étape 2.6 lorsque la chambre est remplie de liquide. Si l’alimentation de la chambre est allumée sans fluide dans la chambre, elle endommagera le transducteur piézoélectrique dans la chambre et ne fonctionnera plus. Insérez les sondes de turbidité dans le boîtier du turbidimètre et du thermomètre et serrez les vis(Figure 1c et Figure 3). Raccorder le tuyau d’alimentation à l’entrée de l’orifice de turbidité d’alimentation (Figure 4a) via la pomped’alimentation( Figure 1b à 1c). Raccorder le tube en Y de la sortie de l’orifice de turbidité d’alimentation (Figure 4b) aux orifices d’entrée de la chambre acoustophorétique (Figure 4c). Raccorder le tube de l’étage 1 de l’orifice de décharge de la chambre acoustophorétique (Figure 4d) via la pompe de l’étage 1 à un récipient de collecte cellulaire (Figure 1d via 1e à 1f). Raccorder le tube à partir de l’orifice de perméat de la chambre acoustophorétique (Figure 4e) à l’entrée de l’orifice de turbidité de la sonde1 (Figure 4f). Raccorder le tube de récolte à l’extérieur de l’orifice de turbidité de la sonde1 (Figure 4g) à un récipient de collecte de produits (Figure 1c à 1g). 2. Amorcer le système avec HCCF REMARQUE: Ce protocole a été développé à l’aide de cellules CHO-K1 cultivées dans un milieu chimiquement défini (ActiCHO P avec 6 mM de L-glutamine) produisant le modèle d’anticorps monoclonal IgG1 VRC0113 et peut devoir être ajusté pour d’autres lignées cellulaires et produits. Le HCCF utilisé dans ce protocole a été obtenu à la fin de 7 à 8 jours de cultures CHO-K1 à partir d’une fiole agitée ou d’un procédé de bioréacteur. Activez AWS en allumant les interrupteurs d’alimentation à l’arrière et à l’avant de l’AWS. Allumez l’ordinateur et double-cliquez sur l’icône de bureau du logiciel associé (voir Tableau des matériaux). Dans le panneau “Lectures« , appuyez sur le bouton “Démarrerle test ” pour lancer l’enregistrement des données (Figure 5). Une fois l’enregistrement des données lancé, toutes les données collectées seront enregistrées dans une feuille de calcul exportable jusqu’à ce que le test soit arrêté. Raccordez l’extrémité du tuyau d’alimentation dans le récipient HCCF agité. Démarrez la pompe d’alimentation en entrant le débit de la pompe sur l’écran “Commandes” dans l’image de lapompe d’alimentation” etappuyezsur ” Entrée ” sur le clavier. Assurez-vous que l’icône de flèchede directionde la pompe (dans le sens des aiguilles d’une montre ou dans le sens inverse des aiguilles d’une montre) est correctement sélectionnée dans la case grise à droite de l’image de la pompe d’alimentation pour pomper le HCCF du récipient dans la chambre acoustophorétique. Cliquez surl’icône« Triangle » à côté des mots «Allumer» dans la case grise sous l’image de la pompe d’alimentation pour «Démarrer» la pompe (Figure 6a).REMARQUE: Le débit maximal de la pompe est de 10 L / h (167 mL / min), mais il est recommandé d’utiliser le débit nominal, 60 mL / min, pour cette étape afin de remplir rapidement le tuyau et la chambre sans risquer de surcharger la chambre avant de commencer la séparation. Surveillez les mesures de turbidité d’alimentation en observant le «Percent Reduction Panel»(Figure 5c)pendant le remplissage de la chambre acoustophorétique. Les valeurs de turbidité resteront constantes pendant le chargement de la chambre si le HCCF est suffisamment mélangé dans le récipient HCCF. Une fois que le liquide est au-dessus du transducteur piézoélectrique à l’arrière de la chambre acoustophorétique, appuyez sur “Éteindre” dans la boîte grise sous l’image de la pompe d’alimentation pour arrêter la pompe. Connectez le câble d’alimentation BNC (Figure 3c) à la chambre acoustophorétique (Figure 3d).REMARQUE: Le volume de retenue de chaque chambre acoustophorétique est d’environ 190 mL. 3. Fonctionnement d’AWS Une fois que la chambre acoustophorétique est remplie et que le câble d’alimentation BNC est connecté à l’arrière de la chambre acoustophorétique, modifiez le taux d’alimentation de la pompe à la vitesse de fonctionnement souhaitée(Figure 6a et Tableau 1). Plusieurs débits de pompe d’alimentation doivent être testés pour identifier les paramètres de fonctionnement idéaux pour un processus donné. Allumez la puissance piézoélectrique stage1 en faisant glisser la barre du module d’alimentation sur 10 W(Figure 6d)et en appuyant sur l’icône «Allumer» sur le côté droit de la case Stage 1(Figure 6c). Comme suggéré par le fabricant, utilisez 10 W, le réglage d’alimentation recommandé pour les cellules CHO. Cela générera une fréquence fixe de 2 MHz pour le fonctionnement. Après plusieurs secondes, les cellules commenceront à s’agglutiner visiblement au niveau des nœuds d’onde dans la chambre acoustophorétique (Figure 7a). Une fois que les cellules commencent à se déposer au fond de la chambre acoustophorétique (Figure 7b), démarrez la pompe de stade 1 avec un taux approprié basé sur la densité de la cellule et le taux de la pompe d’alimentation (Figure 6b). Sur la base de la feuille de calcul d’optimisation et de fonctionnement à l’état d’équilibre du fabricant, le débit de la pompe stage1 peut être calculé en fonction de la masse de la cellule emballée et du débit d’alimentation à l’aide de l’équation suivante Pour calculer la masse de la cellule emballée, tare une balance avec un tube vide de 15 mL (ou un autre tube compatible avec la centrifugation). Remplissez le tube avec du matériel d’alimentation et enregistrez le poids total du tube avec l’aliment. Centrifuger le tube pendant 10 min à 3 700 x g. Décantez le surnageant dans un récipient séparé. Mesurez le poids du tube avec la pastille de cellule. Le pourcentage de masse de la cellule emballée de la matière première = (poids du tube décanté/poids du tube rempli) x 100%. Surveiller le profil de turbidité de la turbidité de stade 1 lorsque le débordement de la chambre acoustophorétique pénètre dans la sonde de turbidité1(Figure 8). Au fur et à mesure que la séparation des cellules se poursuit, l’efficacité de l’élimination des cellules augmentera. De plus, surveillez la différence de température entre l’alimentation et l’étape 1, car elle augmentera à mesure que la séparation des cellules se poursuivra (Figure 9). La température peut augmenter lorsque des aliments à densité cellulaire plus élevée sont utilisés, mais peut généralement être réduite en modifiant le débit d’alimentation.REMARQUE: Lors de l’utilisation de plusieurs chambres acoustophorétiques, on peut connecter séquentiellement le tube de la chambre acoustophorétique précédente via des sondes de turbidité à l’entrée de la chambre acoustophorétique actuelle. En outre, on peut connecter des tubes d’étage du fond des chambres acoustophorétiques via des pompes d’étage à des récipients de collecte de cellules. Au total, quatre chambres acoustophorétiques peuvent être connectées en série pour une efficacité optimale d’élimination des cellules si nécessaire. 4. Fin d’AWS Lorsque l’exécution est terminée, arrêtez l’alimentation et la pompe stage1 en appuyant sur Éteindre dans la boîte grise sous les images de la pompe d’alimentation et de la pompe stage1, respectivement, pour arrêter les pompes. Coupez l’alimentation de la chambre en appuyant sur Éteindre sur le côté droit du boîtier Stage 1 et débranchez le câble d’alimentation BNC. Prenez le matériel de récolte du produit collecté pour d’autres procédures de clarification et de purification, telles que les méthodes de filtration en profondeur et de chromatographie. Jetez le matériel de récolte cellulaire. Égoutter le liquide restant dans la chambre acoustophorétique en plaçant le tuyau de déchets dans un récipient vide, en déconnectant le tube des orifices d’entrée et de pénétration de la chambre acoustophorétique et en libérant le tuyau de déchets de la tête de pompe. Reconnectez le tube, replacez le tube de déchets dans la tête de la pompe et faites couler de l’eau DI à partir de l’extrémité du tube d’alimentation à l’aide d’un débit de pompe d’alimentation de 60 mL / min et d’un débit de pompe de stade 1 de 60 mL / min. Continuer pendant 15–20 min. Jetez le flux à travers. Pomper 70% d’alcool isopropylique (IPA) à travers le tube et la chambre à l’aide de la pompe d’alimentation pendant 15 à 20 min. Jetez le flux à travers. Répétez la procédure de nettoyage avec de l’eau DI pour dégager les tubes et la chambre en utilisant la pompe d’alimentation pendant 15 à 20 minutes. Jetez le flux à travers. Démontez le tube des sondes de turbidité et des chambres acoustophorétiques et nettoyez la zone avec 70% d’IPA. Démontez les sondes de turbidité et nettoyez l’intérieur des sondes de turbidité avec 70% d’IPA. Laissez toutes les pièces sécher à l’air libre, puis remontez-les pour la prochaine utilisation.REMARQUE: Les chambres acoustophorétiques sont fabriquées pour un usage unique, mais peuvent être réutilisées si elles sont manipulées et nettoyées correctement comme décrit dans ce protocole.