Primaire verduidelijking van CHO-geoogste celkweekvloeistof met behulp van een akoestische separator
Summary
Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de primaire verduidelijking van CHO-celkweek met behulp van een akoestische separator. Dit protocol kan worden gebruikt voor de primaire klaring van schudkolfculturen of bioreactoroogsten en heeft de potentiële toepassing voor continue zuivering van het celbloedingsmateriaal tijdens perfusiebioreactoroperaties.
Abstract
Primaire klaring is een essentiële stap in een biomanufacturingproces voor de eerste verwijdering van cellen uit therapeutische producten in de geoogste celkweekvloeistof. Hoewel traditionele methoden zoals centrifugeren of filtratie op grote schaal worden geïmplementeerd voor celverwijdering, heeft de apparatuur voor deze processen grote voetafdrukken en kan de werking verontreinigingsrisico’s en filtervervuiling met zich meebrengen. Bovendien zijn traditionele methoden mogelijk niet ideaal voor continue bioprocessingschema’s voor primaire zuivering. Zo werd een alternatieve toepassing met behulp van akoestische (geluids)golven onderzocht om cellen continu te scheiden van de celkweekvloeistof. In deze studie wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd voor het gebruik van een bench-scale akoestische golfscheider (AWS) voor de primaire scheiding van kweekvloeistof die een monoklonaal IgG1-antilichaam bevat uit een CHO-celbioreactoroogst. Representatieve gegevens worden gepresenteerd vanuit de AWS en laten zien hoe effectieve celverheldering en productherstel kan worden bereikt. Tot slot worden mogelijke toepassingen voor AWS in continue bioprocessing besproken. Over het algemeen biedt deze studie een praktisch en algemeen protocol voor de implementatie van AWS in primaire verduidelijking voor CHO-celculturen en beschrijft het verder het toepassingspotentieel in continue bioprocessing.
Introduction
Een cruciale stap in een biomanufacturing-proces met uitgescheiden therapeutische eiwitten is de verwijdering van biomassa uit geoogste celkweekvloeistof (HCCF). Traditioneel hebben biofabrikanten centrifugering gevolgd door dieptefiltratie aangenomen als hun primaire zuiveringsmethoden bij de productie van monoklonale antilichamen1. Centrifugeren kan echter leiden tot hoge schuifspanning op de cellen, wat resulteert in verhoogd cellulair puin in de HCCF. Dit kan mogelijk leiden tot filtervervuiling tijdens filtratie en resulteren in extra verontreinigingen nafiltratie die vervolgens de stroomafwaartse chromatografie-efficiëntie1,2,3kunnen verminderen. Bovendien kan het aanpassen van de centrifuges voor een bepaald proces kostbaar zijn en kan het extra verbindingen vereisen om systemen ter plaatse te reinigen en te steriliseren, wat ook een beperkende factor kan zijn voor schaalbaarheid. Het gebruik van dieptefilters kan de beperkingen van de centrifugatie compenseren en ook profiteren van technologie voor eenmalig gebruik4. Dieptefilters worden echter voornamelijk gebruikt als secundaire klaring omdat ze niet bestand zijn tegen hoge celkweekdichtheden5. Als alternatief zijn tangentiële stroomfiltratie (TFF) celretentie-apparaten gebruikt om schuifstress te verminderen, maar kunnen uitdagingen ondervinden zoals membraanpolarisatie en slechte oogstopbrengsten6. De bovenstaande problemen die voortvloeien uit het gebruik van centrifugatie plus dieptefiltratie of TFF creëren een mogelijkheid voor de verbetering van het primaire zuiveringsproces van HCCF.
Akoestische scheiding werd geïntroduceerd als een technologie die kan worden gebruikt voor het oogsten van uitgescheiden eiwitten uit celculturen met hoogwaardige eiwitproducten7,8. Akoestische scheiding wordt bereikt door de voortplanting en reflectie van multidimensionale staande golven die interageren met gesuspendeerde vloeistoffen en vastgehouden deeltjes9,10. Deze deeltjes ervaren drie krachten: vloeistofweerstand, zwaartekracht en akoestische straling. Wanneer elk van de krachten even tegengesteld aan elkaar is en een evenwicht bereikt, worden de deeltjes gesuspendeerd en gevangen in de ultrasone staande golf10. In een celkweeksuspensie worden cellen binnen dit drukknoopvlak van staande golven gehouden, het knooppunt groeit als cellen samensmelten en uiteindelijk vallen deze clusters van cellulaire knooppunten uit de zwaartekracht9. Deze gesedimenteerde cellen worden vervolgens uit de media verwijderd, waardoor de geklaarde media kunnen worden weggepompt voor verdere downstream-verwerking. Het gebruik van ultrasone golven als scheidingsmethode is begonnen zich te vertalen in biologische toepassingen, variërend van scheiding van lipidedeeltjes en rode bloedcellen11 tot perfusiecelcultuur bij zoogdieren12. Met zijn relatieve mogelijkheden om kosten, arbeid en cellulaire stress te verminderen door centrifugatie, dieptefiltratie of TFF te vermijden, onderzoeken biofabrikanten de mogelijke toepassingen van het gebruik van akoestische scheiding.
Deze studie biedt een algemeen protocol voor het bedienen van een benchtop akoestische golfscheider (AWS) voor verduidelijking van CHO-celcultuur, presenteert representatieve gegevens en laat zien hoe effectieve celverheldering en productherstel kunnen worden bereikt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Beschreven is een stap-voor-stap protocol voor de implementatie van een bench-scale AWS in primaire klaring van een model monoklonaal antilichaam van HCCF van een CHO cellijn. Zoals te zien is in de representatieve resultaten, resulteerde het gebruik van de AWS in primaire klaring in effectieve celverheldering en productherstel. Bovendien maken het lage niveau van onderhouds- en operationele vereisten en opschalingscapaciteit een breder toepassingspotentieel in primaire verduidelijking mogelijk.
Belangrijk is dat de representatieve resultaten suggereren dat de voedingspompsnelheid van cruciaal belang is voor de scheiding van de cellen. Bovendien is, vanwege beperkingen bij het detecteren van hoge celdichtheid in de troebelheidsmeting, werkende celdichtheid een andere factor om te overwegen bij het gebruik van een AWS-systeem. Omdat de troebelheidssonde verzadigd zal zijn bij het uitvoeren van voedermiddel met hoge celdichtheid, kan het het beste zijn om de celscheidingsefficiëntie te berekenen door de celdichtheden van het voedermiddel en de geklaarde celkweekvloeistof offline te meten. Met nauwkeurige offline meting van verduidelijking, is een processtrategie die kan worden overwogen bij het oplossen van deze problemen het gebruik van meerdere kamers in serie. Hoewel dit protocol voornamelijk gericht is op het gebruik van een enkele kamer, kan dit systeem drie extra kamers bedienen voor sequentiële verduidelijking van de cellen die de toestand van de cellen minimaal kunnen beïnvloeden en resulteren in een hoge productterugwinning. Bovendien kunnen andere parameters, zoals vermogen voor AWS en celverwijderingsdebieten, verder worden geoptimaliseerd voor specifieke celtypen of werkingsmodus. Over het algemeen wordt een optimalisatie van de operationele parameters en strategie met behulp van deze overwegingen aanbevolen voorafgaand aan de implementatie van AWS.
Onder de vele toepassingsmogelijkheden is het gebruik van AWS in continue bioprocessing veelbelovend. Omdat AWS centrifugatie kan vervangen en het filteroppervlak drastisch kan verminderen14,zou het gebruik van AWS een constante stroom van celvrij materiaal mogelijk maken voor daaropvolgende filtratie- en chromatografieprocessen die compatibel zijn met continue biomanufacturing. Vanwege deze compatibiliteit en de beschikbaarheid van perfusietechnologie voor hoge celdichtheid (bijv. >50 x 106 cellen / ml) en langere kweekduur (bijv. >14 dagen), heeft AWS het potentieel om naast de primaire verduidelijking een nieuwe strategie voor continue celbloedingen te ontwikkelen.
In sommige gevallen wordt tot 30% van het geproduceerde eiwit therapeutisch verwijderd tijdens steady-state operatie in het celbloedingsmateriaal15,16. Bovendien moet aan bepaalde kwaliteitskenmerken worden voldaan om de verwijderde monoklonale antilichamen te bundelen met het standaard geoogste materiaal. Wanneer niet aan deze specificaties wordt voldaan, kan het resultaat een afwijzing van materiaal zijn dat van invloed kan zijn op de productopbrengst. Om dergelijk productverlies te compenseren, kan een continue opheldering van celbloedingsmateriaal met behulp van AWS worden geïmplementeerd bij een steady-state conditie tijdens een langdurig perfusieproces17. Deze strategie kan het productverlies in het bloedingsmateriaal verminderen en meer van het geproduceerde eiwit gebruiken. Bovendien kunnen cellen na de continue zuivering met behulp van AWS mogelijk weer in de bioreactor worden toegevoegd indien gewenst voor een hogere celdichtheid en productiviteit. Continue zuivering van celbloedingsmateriaal met AWS kan dus een mogelijkheid bieden om de opbrengst te verhogen en /of het secundaire filteroppervlak in een bepaald proces te verkleinen.
Kortom, het nut van AWS is niet beperkt tot eenvoudige primaire verduidelijking, maar kan ook nut hebben voor toepassingen in continue bioprocessing die de productiesnelheid en operationele flexibiliteit kunnen verbeteren.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen Nilou Sarah Arden en Zhong Zhao bedanken voor hun constructieve beoordeling van dit manuscript. De auteurs willen ook Lindsey Brown bedanken voor de essentiële input tijdens dit project. Gedeeltelijke interne financiering en ondersteuning voor dit werk werd geleverd door het CDER Critical Path Program (CA # 1-13) en het CDER Manufacturing Science, Innovation Center of Excellence Program (Berilla-CoE-19-49). Dit project werd gedeeltelijk ondersteund door het Internship / Research Participation Program bij het Office of Biotechnology Products, U.S. Food and Drug Administration, beheerd door het Oak Ridge Institute for Science and Education via een interagency-overeenkomst tussen het Amerikaanse ministerie van Energie en de FDA.
Deze publicatie weerspiegelt de opvattingen van de auteur en mag niet worden opgevat als een weergave van de standpunten of het beleid van de FDA.
Materials
| Acoustophorectic chamber | Pall | CAS-AC-K1 Cadence acoustic chamber kit | |
| ActiCHO P | GE | SH31025.01 | powder medium |
| AWS | Pall | CAS-SYS (60500101-SP) | |
| Cadence Acoustic Separator Software | Pall | Cadence Acoustic Separator Interface Ver. 1.0.4 | |
| CHO-K1 cells | VRC | VRC01 | |
| Computer | Dell | Latitude 3470 | Windows 7, 64 bit OS |
| Isopropanol (70%) | LabChem | LC157605 | 20L prepped 70% IPA |
| L-glutamine | Corning | 25-005-CV | 200 mM stock solution |
| Masterflex L/S 14 tubing | Cole-Parmer | 96400-14 | peroxide-cured silicone tubing, 25ft |
| Masterflex L/S 16 tubing | Cole-Parmer | 96400-16 | peroxide-cured silicone tubing, 25ft |
| Tubing set | Pall | CAS-FP-K1 Tubing set | |
| Turbidity probe | Pall | CAS-TS-S1 (60500106) |
References
- Roush, D. J., Lu, Y. Advances in primary recovery: centrifugation and membrane technology. Biotechnology Progress. 24 (3), 488-495 (2008).
- Hutchinson, N., Bingham, N., Murrell, N., Farid, S., Hoare, M. Shear stress analysis of mammalian cell suspensions for prediction of industrial centrifugation and its verification. Biotechnology and Bioengineering. 95 (3), 483-491 (2006).
- Shukla, A. A., Suda, E. . Harvest and recovery of monoclonal antibodies: cell removal and clarification. Second ed. 2, 55-79 (2017).
- Felo, M., Christensen, B., Higgins, J. Process cost and facility considerations in the selection of primary cell culture clarification technology. Biotechnology Progress. 29 (5), 1239-1245 (2013).
- Singh, N., et al. Clarification of recombinant proteins from high cell density mammalian cell culture systems using new improved depth filters. Biotechnology and Bioengineering. 110 (7), 1964-1972 (2013).
- Liu, H. F., Ma, J., Winter, C., Bayer, R. Recovery and purification process development for monoclonal antibody production. MAbs. 2 (5), 480-499 (2010).
- Ryll, T., et al. Performance of small-scale CHO perfusion cultures using an acoustic cell filtration device for cell retention: characterization of separation efficiency and impact of perfusion on product quality. Biotechnology and Bioengineering. 69 (4), 440-449 (2000).
- Gorenflo, V. M., Smith, L., Dedinsky, B., Persson, B., Piret, J. M. Scale-up and optimization of an acoustic filter for 200 L/day perfusion of a CHO cell culture. Biotechnology and Bioengineering. 80 (4), 438-444 (2002).
- Chitale, K., Lipkens, B., Presz, W., Desjardins, O. Understanding the fluid dynamics associated with macro scale ultrasonic separtors. 169th Meeting of the Acoustical Society in America. , (2015).
- Dionne, J., McCarthy, B., Ross-Johnsrud, B., Masi, L., Lipkens, B. Large volume flow rate acoustophoretic phase separator for oil water emulsion splitting. The Journal of the Acoustical Society of America. 133 (5), 3237 (2013).
- Dutra, B., et al. A Novel Macroscale Acoustic Device for Blood Filtration. Journal of Medical Device. 12 (1), 0110081-0110087 (2018).
- Lipkens, B. E. M., Ross-Johnsrud, B., Presz, W. M., Chitale, K., Kennedy, T. J., Winiarski, L. Acoustic perfusion devices. US patent. , (2017).
- Wu, X., et al. Rational design of envelope identifies broadly neutralizing human monoclonal antibodies to HIV-1. Science. 329 (5993), 856-861 (2010).
- Shirgaonkar, I. Z., Lanthier, S., Kamen, A. Acoustic cell filter: a proven cell retention technology for perfusion of animal cell cultures. Biotechnology Advances. 22 (6), 433-444 (2004).
- Wolf, M. K. F., et al. Improved Performance in Mammalian Cell Perfusion Cultures by Growth Inhibition. Biotechnology Journal. 14 (2), 1700722 (2019).
- Lin, H., Leighty, R. W., Godfrey, S., Wang, S. B. Principles and approach to developing mammalian cell culture media for high cell density perfusion process leveraging established fed-batch media. Biotechnology Progress. 33 (4), 891-901 (2017).
- Emily, B., et al. Primary clarification of very high cell density cell culture harvest by enhanced cell settling. BioProcess International. 8, 32-39 (2010).
