التوضيح الأولي لسائل زراعة الخلايا المقطوعة CHO باستخدام فاصل صوتي
Summary
يقدم هنا بروتوكول للتوضيح الأولي لثقافة خلية CHO باستخدام فاصل صوتي. يمكن استخدام هذا البروتوكول للتوضيح الأولي لثقافات قارورة الاهتزاز أو محاصيل المفاعل الحيوي ولديه التطبيق المحتمل للتوضيح المستمر لمواد نزيف الخلية أثناء عمليات المفاعل الحيوي للتشويش.
Abstract
التوضيح الأولي هو خطوة أساسية في عملية تصنيع الكتلة الحيوية لإزالة الخلايا الأولية من المنتجات العلاجية داخل سائل زراعة الخلايا المحصود. في حين أن الأساليب التقليدية مثل الطرد المركزي أو الترشيح يتم تنفيذها على نطاق واسع لإزالة الخلايا ، فإن معدات هذه العمليات لها آثار أقدام كبيرة ويمكن أن تنطوي العملية على مخاطر التلوث وتصفية قاذورات. وبالإضافة إلى ذلك، قد لا تكون الأساليب التقليدية مثالية لمخططات المعالجة البيولوجية المستمرة للتوضيح الأولي. وهكذا، تم التحقيق في تطبيق بديل باستخدام الموجات الصوتية (الصوتية) لفصل الخلايا باستمرار عن سائل زراعة الخلايا. يقدم في هذه الدراسة بروتوكول مفصل لاستخدام فاصل الموجات الصوتية على نطاق مقاعد البدلاء (AWS) للفصل الأساسي بين سائل الثقافة الذي يحتوي على جسم مضاد IgG1 أحادي النسيلة من حصاد المفاعل الحيوي لخلايا CHO. يتم تقديم بيانات تمثيلية من AWS وتوضح كيفية تحقيق توضيح فعال للخلية واستعادة المنتج. وأخيرا، تناقش التطبيقات المحتملة ل AWS في المعالجة الحيوية المستمرة. عموما، توفر هذه الدراسة بروتوكولا عمليا وعاما لتنفيذ AWS في التوضيح الأولي لثقافات خلايا CHO وتصف كذلك إمكانات تطبيقها في المعالجة الحيوية المستمرة.
Introduction
خطوة حاسمة في عملية تصنيع الكتلة الحيوية التي تنطوي على البروتينات العلاجية المفرزة هي إزالة الكتلة الحيوية من سائل زراعة الخلايا المحصودة (HCCF). تقليديا، اعتمدت الأجهزة الحيوية الطرد المركزي تليها الترشيح العمق كطرق التوضيح الأولية في إنتاج الأجسام المضادة أحادية النسيلة1. ومع ذلك، قد يؤدي الطرد المركزي إلى إجهاد القص العالي على الخلايا، مما يؤدي إلى زيادة الحطام الخلوي في HCCF. وهذا يمكن أن يؤدي إلى تصفية قاذورات أثناء الترشيح ويؤدي إلى ملوثات إضافية بعد الترشيح التي يمكن أن تقلل في وقت لاحق كفاءة الكروماتوغرافيا المصب1،2،3. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يكون تخصيص أجهزة الطرد المركزي لعملية معينة مكلفا وقد يتطلب اتصالات إضافية بنظم نظيفة في المكان وتعقيم في المكان قد تكون أيضا عاملا مقيدا للتوسع. استخدام مرشحات العمق يمكن أن تعوض عن القيود المفروضة على الطرد المركزي وأيضا الاستفادة من تكنولوجيا الاستخدام الواحد4. ومع ذلك، يتم استخدام عوامل تصفية العمق بشكل أساسي والتوضيح الثانوي لأنها لا تستطيع تحمل الكثافات عالية زراعة الخلايا5. بدلا من ذلك، تم استخدام أجهزة الترشيح العرضي للتدفق (TFF) للاحتفاظ بالخلايا للتخفيف من إجهاد القص ولكنها قد تواجه تحديات مثل الاستقطاب الغشائي وضعف غلة الحصاد6. 10- إن المسائل المذكورة أعلاه الناشئة عن استخدام الطرد المركزي بالإضافة إلى الترشيح العميق أو TFF تهيئ فرصة لتحسين عملية التوضيح الأولية لقوة تثبيت الطبيعة.
تم تقديم الفصل الصوتي كتكنولوجيا يمكن استخدامها لحصاد البروتينات المفرزة من ثقافات الخلايا مع منتجات البروتين عالية الجودة7،8. يتم تحقيق الفصل الصوتي من خلال انتشار وانعكاس موجات دائمة متعددة الأبعاد تتفاعل مع السوائل المعلقة والجسيمات المحتفظ بها9،10. هذه الجسيمات تجربة ثلاث قوى: سحب السوائل، والجاذبية، والإشعاع الصوتي. عندما تعارض كل من القوى على قدم المساواة مع بعضها البعض، والوصول إلى التوازن، يتم تعليق الجسيمات والمحاصرين داخل الموجات فوق الصوتية الدائمة10. في تعليق ثقافة الخلية ، يتم عقد الخلايا داخل هذه الطائرة عقدة الضغط من الموجات الدائمة ، وتنمو العقدة مع تجمع الخلايا ، وفي نهاية المطاف تقع هذه المجموعات من العقد الخلوية من قوة الجاذبية9. ثم تتم إزالة هذه الخلايا المترسبة من الوسائط، مما يسمح بضخ الوسائط الموضحة لمزيد من المعالجة في المصب. وقد بدأ استخدام الموجات فوق الصوتية كوسيلة فصل لترجمة إلى تطبيقات بيولوجية تتراوح بين فصل جزيئات الدهون وخلايا الدم الحمراء11 إلى الثدييات خلية التروية الثقافة12. مع قدراتها النسبية على خفض التكاليف والعمالة والإجهاد الخلوي من خلال تجنب الطرد المركزي ، والترشيح العمق ، أو TFF ، تقوم وحدات تصنيع الكتلة الحيوية باستكشاف التطبيقات المحتملة لاستخدام الفصل الصوتي.
توفر هذه الدراسة بروتوكولا عاما لتشغيل فاصل موجة صوتية على سطح المقعد (AWS) لتوضيح ثقافة خلايا CHO ، وتقدم بيانات تمثيلية ، وتوضح كيفية تحقيق توضيح فعال للخلية واستعادة المنتج.
Protocol
Representative Results
Discussion
وصف هو بروتوكول خطوة بخطوة لتنفيذ AWS على نطاق مقاعد البدلاء في التوضيح الأولي للأجسام المضادة أحادية النسيلة نموذج من HCCF من خط الخلية CHO. وكما هو مبين في النتائج التمثيلية، أدى استخدام AWS في التوضيح الأولي إلى توضيح فعال للخلية واستعادة المنتج. وعلاوة على ذلك، فإن انخفاض مستوى الصيانة والاحتياجات التشغيلية والقدرة على توسيع نطاقها يتيح إمكانية تطبيق أوسع نطاقا في التوضيح الأولي.
الأهم من ذلك، تشير النتائج التمثيلية إلى أن معدل مضخة التغذية أمر بالغ الأهمية لفصل الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، بسبب القيود المفروضة على الكشف عن كثافة الخلايا العالية في قياس العكر ، فإن كثافة الخلايا العاملة هي عامل آخر يجب مراعاته عند استخدام نظام AWS. لأن المسبار العكر سوف تكون مشبعة عند تشغيل مواد تغذية كثافة الخلية العالية، قد يكون من الأفضل لحساب كفاءة فصل الخلية عن طريق قياس كثافات الخلية من المواد تغذية وأوضح السائل ثقافة الخلية حاليا. مع قياس دقيق حاليا من التوضيح ، واحدة استراتيجية العملية التي يمكن النظر فيها في حل هذه المشاكل هو استخدام غرف متعددة في سلسلة. على الرغم من أن هذا البروتوكول يركز في المقام الأول على استخدام غرفة واحدة، يمكن لهذا النظام تشغيل ثلاث غرف إضافية لتوضيح تسلسلي للخلايا التي يمكن أن تؤثر على الحد الأدنى من حالة الخلايا ويؤدي إلى استرداد المنتج عالية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تحسين المعلمات الأخرى، مثل الطاقة ل AWS ومعدلات تدفق إزالة الخلايا، لأنواع خلايا محددة أو طريقة التشغيل. بشكل عام، يوصى بتحسين معلمات التشغيل والاستراتيجية باستخدام هذه الاعتبارات قبل تنفيذ AWS.
ومن بين العديد من إمكانات التطبيق، يعد استخدام AWS في المعالجة الحيوية المستمرة واعدا. لأن AWS يمكن أن تحل محل الطرد المركزي والحد بشكل كبير من مساحة سطح المرشح14، فإن استخدام AWS سيمكن من تدفق مستمر من المواد الخالية من الخلايا لعمليات الترشيح والترشيح اللوني اللاحقة التي تتوافق مع الكتلة الحيوية المستمرة. بسبب هذا التوافق وتوافر تقنية التشوه لكثافة الخلايا العالية (على سبيل المثال، >50 × 106 خلايا / مل) ومدة الثقافة الأطول (على سبيل المثال، >14 يوما)، لدى AWS القدرة على تطوير استراتيجية جديدة نزيف الخلايا المستمرة بالإضافة إلى التوضيح الأولي.
في بعض الحالات، تتم إزالة ما يصل إلى 30٪ من البروتين العلاجي المنتج أثناء عملية ثابتة الحالة في الخلية تنزف المادة15،16. وبالإضافة إلى ذلك، لكي تجمع الأجسام المضادة أحادية النسيلة المزالة مع المادة الموحدة المحصودة، يجب الوفاء بسمات نوعية معينة. عندما لا يتم استيفاء هذه المواصفات، قد تكون النتيجة رفض المواد التي يمكن أن تؤثر على إنتاج المنتج. للتعويض عن فقدان المنتج هذا ، يمكن تنفيذ توضيح مستمر لمواد نزيف الخلية باستخدام AWS في حالة ثابتة أثناء عملية التشوه طويلة الأجل17. هذه الاستراتيجية قد تقلل من فقدان المنتج في المواد تنزف والاستفادة من أكثر من البروتين المنتجة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن إضافة الخلايا بعد التوضيح المستمر باستخدام AWS مرة أخرى إلى المفاعل الحيوي إذا رغبت في زيادة كثافة الخلايا وإنتاجيتها. وبالتالي، قد يوفر التوضيح المستمر للمواد نزيف الخلية مع AWS فرصة لزيادة العائد و / أو تقليل مساحة سطح مرشح الثانوية في عملية معينة.
وباختصار، فإن فائدة AWS لا تقتصر على التوضيح الأولي البسيط ولكن قد يكون لها فائدة للتطبيقات في المعالجة الحيوية المستمرة التي قد تحسن معدل التصنيع والمرونة التشغيلية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود المؤلفان أن يعترفا بنيلو سارة أردن وزاونغ جاو لمراجعتهما البناءة لهذه المخطوطة. كما يود المؤلفون أن يشكروا ليندسي براون على المدخلات الأساسية خلال هذا المشروع. تم توفير التمويل الداخلي الجزئي والدعم لهذا العمل من خلال برنامج المسار الحرج CDER (CA # 1-13) وبرنامج علوم التصنيع والابتكار في CDER (Berilla-CoE-19-49). وقد تم دعم هذا المشروع جزئيا من خلال برنامج التدريب الداخلي / المشاركة في البحوث في مكتب منتجات التكنولوجيا الحيوية، إدارة الغذاء والدواء الأمريكية، الذي يديره معهد أوك ريدج للعلوم والتعليم من خلال اتفاق مشترك بين الوكالات بين وزارة الطاقة الأميركية وهيئة الغذاء والدواء الأمريكية.
يعكس هذا المنشور آراء المؤلف ولا ينبغي تفسيره على أنه يمثل وجهات نظر أو سياسات إدارة الأغذية والعقاقير.
Materials
| Acoustophorectic chamber | Pall | CAS-AC-K1 Cadence acoustic chamber kit | |
| ActiCHO P | GE | SH31025.01 | powder medium |
| AWS | Pall | CAS-SYS (60500101-SP) | |
| Cadence Acoustic Separator Software | Pall | Cadence Acoustic Separator Interface Ver. 1.0.4 | |
| CHO-K1 cells | VRC | VRC01 | |
| Computer | Dell | Latitude 3470 | Windows 7, 64 bit OS |
| Isopropanol (70%) | LabChem | LC157605 | 20L prepped 70% IPA |
| L-glutamine | Corning | 25-005-CV | 200 mM stock solution |
| Masterflex L/S 14 tubing | Cole-Parmer | 96400-14 | peroxide-cured silicone tubing, 25ft |
| Masterflex L/S 16 tubing | Cole-Parmer | 96400-16 | peroxide-cured silicone tubing, 25ft |
| Tubing set | Pall | CAS-FP-K1 Tubing set | |
| Turbidity probe | Pall | CAS-TS-S1 (60500106) |
References
- Roush, D. J., Lu, Y. Advances in primary recovery: centrifugation and membrane technology. Biotechnology Progress. 24 (3), 488-495 (2008).
- Hutchinson, N., Bingham, N., Murrell, N., Farid, S., Hoare, M. Shear stress analysis of mammalian cell suspensions for prediction of industrial centrifugation and its verification. Biotechnology and Bioengineering. 95 (3), 483-491 (2006).
- Shukla, A. A., Suda, E. . Harvest and recovery of monoclonal antibodies: cell removal and clarification. Second ed. 2, 55-79 (2017).
- Felo, M., Christensen, B., Higgins, J. Process cost and facility considerations in the selection of primary cell culture clarification technology. Biotechnology Progress. 29 (5), 1239-1245 (2013).
- Singh, N., et al. Clarification of recombinant proteins from high cell density mammalian cell culture systems using new improved depth filters. Biotechnology and Bioengineering. 110 (7), 1964-1972 (2013).
- Liu, H. F., Ma, J., Winter, C., Bayer, R. Recovery and purification process development for monoclonal antibody production. MAbs. 2 (5), 480-499 (2010).
- Ryll, T., et al. Performance of small-scale CHO perfusion cultures using an acoustic cell filtration device for cell retention: characterization of separation efficiency and impact of perfusion on product quality. Biotechnology and Bioengineering. 69 (4), 440-449 (2000).
- Gorenflo, V. M., Smith, L., Dedinsky, B., Persson, B., Piret, J. M. Scale-up and optimization of an acoustic filter for 200 L/day perfusion of a CHO cell culture. Biotechnology and Bioengineering. 80 (4), 438-444 (2002).
- Chitale, K., Lipkens, B., Presz, W., Desjardins, O. Understanding the fluid dynamics associated with macro scale ultrasonic separtors. 169th Meeting of the Acoustical Society in America. , (2015).
- Dionne, J., McCarthy, B., Ross-Johnsrud, B., Masi, L., Lipkens, B. Large volume flow rate acoustophoretic phase separator for oil water emulsion splitting. The Journal of the Acoustical Society of America. 133 (5), 3237 (2013).
- Dutra, B., et al. A Novel Macroscale Acoustic Device for Blood Filtration. Journal of Medical Device. 12 (1), 0110081-0110087 (2018).
- Lipkens, B. E. M., Ross-Johnsrud, B., Presz, W. M., Chitale, K., Kennedy, T. J., Winiarski, L. Acoustic perfusion devices. US patent. , (2017).
- Wu, X., et al. Rational design of envelope identifies broadly neutralizing human monoclonal antibodies to HIV-1. Science. 329 (5993), 856-861 (2010).
- Shirgaonkar, I. Z., Lanthier, S., Kamen, A. Acoustic cell filter: a proven cell retention technology for perfusion of animal cell cultures. Biotechnology Advances. 22 (6), 433-444 (2004).
- Wolf, M. K. F., et al. Improved Performance in Mammalian Cell Perfusion Cultures by Growth Inhibition. Biotechnology Journal. 14 (2), 1700722 (2019).
- Lin, H., Leighty, R. W., Godfrey, S., Wang, S. B. Principles and approach to developing mammalian cell culture media for high cell density perfusion process leveraging established fed-batch media. Biotechnology Progress. 33 (4), 891-901 (2017).
- Emily, B., et al. Primary clarification of very high cell density cell culture harvest by enhanced cell settling. BioProcess International. 8, 32-39 (2010).
