בדיקת אלקטרוכמילומינסנציה בתפוקה גבוהה של 7 פלקס לבדיקה בו-זמנית של סוכרת מסוג 1 ומחלות אוטואימוניות מרובות

ניתוח תוצאות הבדיקה הוצג בטבלה 1, טבלה 2 וטבלה 3. ערכי הקריאה מגיעים מהנתונים מ-10 הנקודות בתוך אותה באר. ערכי האינדקס עבור כל מדגם חושבו כנגד הבקרות החיוביות והשליליות הפנימיות המתאימות להם, כמתואר בפרוטוקול הבדיקה. דוגמאות לכפילויות שגויות מוצגות בטבלה 1 וגרמו לשגיאת חישוב האינדקס הסופי בטבלה 3. יש לבדוק את כל ערכי הספירה הגולמית כדי להימנע מתוצאות חיוביות כוזבות או שליליות שגויות. בדיקת ה-ECL בעלת 7 המולטיפלקסים אומתה באמצעות קבוצה גדולה של דגימות מ-1026 מטופלים שאובחנו לאחרונה עם T1D ו-1022 נבדקי בקרה בריאים שהתאימו לגיל ולמין. רמות הנוגדנים העצמיים מבדיקת ECL 7-Plex עבור 1026 חולי T1D הושוו לרמות מכל אחד ממבחני ה-ECL היחידים המקבילים שלנו, כפי שמוצג באיור 2 , ומכל RBA ו-ELISA סטנדרטיים יחידים, כפי שמוצג באיור 3. מאפייני הבדיקה הוגדרו זהים באחוזון99 עבור כל מבחני הנוגדנים העצמיים למעט נוגדנים עצמיים של בלוטת התריס (שם נעשה שימוש באחוזון ה-95), מתוך 1022 בקרות בריאות עבור כל שלוש שיטות הבדיקה (7-Plex ECL, ECL יחיד, RBA או ELISA) כמפורט בטבלה 4. קורות החיים הבין-מבחנים של GADA, IA-2A, IAA, TPOA, ThGA, TGA ו- IFNαA הם 6.4%, 4.5%, 9.1%, 4.9%, 5.7%, 11.3% ו- 5.9%, בהתאמה. מספר קטן של דגימות סותרות עבור כל אחד מ-7 הנוגדנים העצמיים נמצאו סביב קו הגבול של חתכים עבור כל בדיקה (איור 2 ואיור 3). 11 דגימות בקרה (11/1022, 1.1%) נמצאו נוגדנים עצמיים מרובים חיוביים רק במבחן 7-Plex ושליליים בכל בדיקה בודדת מקבילה. באופן דומה, זה קרה ב 9 דגימות של חולי T1D (9/1026, 0.9%). בנוסף, 10 TPOA חיוביים גבוהים ו- ThGA אחד בקבוצת המטופלים שנראו הן במבחן ECL יחיד והן ב- RBA הוחמצו במבחן 7-Plex. דגימות אלה הומרו חיוביות במבחן 7-Plex כאשר הן דוללו עוד יותר. באופן כללי, 100% מהחיוביות במבחן ECL יחיד או RBA כוסו במבחן ECL 7-Plex, עם אותה ספציפיות בדיקה כפי שמודגם בטבלה 4. איור 1: איור של בדיקת Mutiplex ECL.נוגדנים עצמיים בסרום יגשרו בין האנטיגן Ru Sulfo-NHSged לאנטיגן הביוטינילציה. זה יחד עם מקשר ספציפי כדי ליצור קומפלקס של אנטיגן-נוגדן-אנטיגן-מקשר. הקומפלקסים נלכדים על הצלחת ומרוסנים לנקודות הספציפיות שלהם דרך כל מקשר ספציפי. מספרי המקשרים המצומדים באופן ספציפי, עבור 7 חלבוני האנטיגן השונים, מודגמים. זיהוי אותות נוגדנים מתבצע באמצעות אנטיגנים מסומנים Ru Sulfo-NHS עם אלקטרוכמילומינסנציה. האיור הוא מתוך גו, י’ ואח’. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. איור 2: השוואה של 7 רמות נוגדנים עצמיים ב-1026 מטופלים חדשים עם T1D בין בדיקת ECL יחידה לבדיקת ECL 7-Plex.לוחות a, b, c, d, e, f ו- g מציגים השוואות של רמות נוגדנים עצמיים עבור GADA, IA-2A, IAA, TGA, TPOA, ThGA ו- IFNαA, בהתאמה. הקווים המקווקווים מייצגים את חתכי הבדיקה עבור כל בדיקת נוגדנים עצמיים. החתכים נקבעו לאחוזון ה-99 של 1022 בקרות בריאות תואמות גיל עבור כל בדיקה (למעט TPOA ו-ThGA שנקבעו לאחוזוןה-95), כפי שמוצג בטבלה 4, מ-1022 הבקרות הבריאות התואמות גיל הן עבור מבחני ECL בודדים והן עבור מבחני ECL מרובים. יהלומים סגורים אדומים מסומנים כחיוביים ‘כוזבים’ בבדיקת 7-Plex ECL, <1% מהקבוצה שנחקרה, והם אומתו כשליליים הן ב-ECL יחיד והן ב-RBA. ריבועי סגירה אדומים מסומנים כשליליים 'כוזבים' בבדיקת 7-Plex ECL הנגרמת על ידי תופעת ה'פרוזון', המתרחשת בעיקר בבדיקת TPOA ב-<1% מהקבוצה שנחקרה. שתי התוצאות החיוביות הכוזבות והשליליות הכוזבות הללו נדונות בחלק הדיון. האיור הוא מתוך גו, י' ואח’. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. איור 3: השוואה של 7 רמות נוגדנים עצמיים ב-1026 מטופלים חדשים עם T1D בין ה-RBA (ELISA עבור IFNαA) לבין בדיקת 7-Plex ECL.פאנלים a, b, c, d, e, f ו-g מציגים השוואות של רמות נוגדנים עצמיים עבור GADA, IA-2A, IAA, TGA, TPOA, ThGA ו- IFNαA, בהתאמה. הקווים המקווקווים מייצגים את חתכי הבדיקה עבור כל בדיקת נוגדנים עצמיים, אותה ספציפיות שנקבעה הן עבור RBA והן עבור בדיקת ECL 7-Plex, כפי שמוצג בטבלה 4, מ-1022 בקרות בריאות תואמות גיל. יהלומים סגורים אדומים וריבועים מייצגים תוצאות חיוביות ‘כוזבות’ ושליליות ‘כוזבות’ המופיעות במבחן 7-Plex ECL, כפי שניתן לראות באיור 2. האיור הוא מתוך גו, י’ ואח’. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. 1 2 3 4 5 6 A 5580 5674 105 117 125 139 מקשר-1 100 108 102 102 3956 3745 מקשר-2 115 124 107 116 113 124 מקשר-3 67 64 68 61 65 69 מקשר-4 89 87 98 92 90 80 מקשר-5 87 71 89 87 61 72 מקשר-6 94 82 79 85 2154 2280 מקשר-7 75 66 1628 1594 81 83 מקשר-8 98 103 71 84 69 85 מקשר-9 102 118 93 98 113 99 מקשר-10 B 324 337 147 148 5426 5366 מקשר-1 101 102 93 88 86 74 מקשר-2 111 119 119 123 66 72 מקשר-3 72 65 59 68 74 67 מקשר-4 81 98 83 92 79 72 מקשר-5 90 84 93 86 70 76 מקשר-6 101 105 101 97 956 944 מקשר-7 82 83 189 204 97 90 מקשר-8 92 83 78 64 82 78 מקשר-9 83 79 88 93 4722 4965 מקשר-10 C 110 110 87 81 2114 2365 מקשר-1 5526 5680 88 70 86 93 מקשר-2 114 132 67 71 3326 3284 מקשר-3 64 62 88 74 64 80 מקשר-4 94 82 86 75 89 76 מקשר-5 77 87 75 63 70 86 מקשר-6 77 86 71 84 138 121 מקשר-7 73 86 80 79 59 73 מקשר-8 86 74 5064 4923 88 86 מקשר-9 105 113 85 80 124 114 מקשר-10 D 98 88 92 84 136 127 מקשר-1 288 291 86 86 558 564 מקשר-2 109 101 74 73 141 127 מקשר-3 78 66 66 55 74 66 מקשר-4 79 83 79 86 96 91 מקשר-5 83 86 96 89 86 73 מקשר-6 87 89 77 87 841 855 מקשר-7 74 72 60 72 90 95 מקשר-8 68 75 331 328 2460 2580 מקשר-9 86 98 80 75 123 133 מקשר-10 E 101 114 101 106 532 548 מקשר-1 101 96 110 104 682 675 מקשר-2 6015 5988 124 126 101 98 מקשר-3 66 71 82 71 80 62 מקשר-4 102 97 99 80 83 110 מקשר-5 82 67 81 80 60 85 מקשר-6 85 95 52 84 245 221 מקשר-7 72 78 82 74 486 503 מקשר-8 77 97 97 77 56 66 מקשר-9 114 104 5726 5814 259 253 מקשר-10 F 119 120 133 118 112 96 מקשר-1 101 91 100 95 96 82 מקשר-2 406 395 111 123 2127 101 מקשר-3 72 60 86 72 79 83 מקשר-4 76 85 96 99 89 103 מקשר-5 88 78 91 83 89 95 מקשר-6 104 97 87 102 56 66 מקשר-7 76 77 79 93 69 75 מקשר-8 85 71 95 100 83 71 מקשר-9 131 131 358 364 92 86 מקשר-10 G 90 95 85 82 105 107 מקשר-1 99 86 77 76 1250 1174 מקשר-2 119 123 120 118 112 108 מקשר-3 76 83 77 80 86 76 מקשר-4 88 86 86 93 107 92 מקשר-5 73 73 71 82 84 75 מקשר-6 5210 5173 72 69 76 85 מקשר-7 80 81 79 82 100 101 מקשר-8 96 97 89 83 65 83 מקשר-9 98 103 86 88 1933 1979 מקשר-10 H 114 124 81 86 299 295 מקשר-1 107 92 69 72 4256 4388 מקשר-2 114 123 125 129 501 536 מקשר-3 77 70 67 64 74 62 מקשר-4 92 110 81 84 77 71 מקשר-5 87 79 72 76 83 81 מקשר-6 328 341 84 80 88 97 מקשר-7 75 84 75 90 74 83 מקשר-8 73 79 78 76 84 70 מקשר-9 113 120 81 76 2372 2350 מקשר-10 טבלה 1: ניתוח של בדיקת ECL 7-plex: ספירות CPS גולמיות (מחצית שמאלית של הצלחת). ספירות CPS גולמיות נרכשות מצלחת בדיקה (החצי השמאלי של הצלחת) וכל דגימה מבוצעת בשכפול. מתחת לכל שורה בלוחית (A-H), יש 10 שורות של ערכי קריאה המייצגות את הנתונים מ-10 הנקודות בתוך אותה באר, המתאימות לכל מספר מקשר כפי שסומן. דוגמאות לכפילויות פגומות מודגשות באפור, כפי שניתן לראות בשורה F-linker 3 עמודות 5 ו-6. שורה של טבלה 1A עמודה של טבלה 1A מקשר 1 מקשר 2 מקשר 3 מקשר 7 מקשר 8 מקשר 9 מקשר 10 A 1-2 מחשב גאדה 5627 104 120 88 71 101 110 B 1-2 גדה מחשב נמוך 331 102 115 103 83 88 81 C 1-2 מחשב TPOA 110 5603 123 82 80 80 109 D 1-2 TPOA מחשב נמוך 93 290 105 88 73 72 92 E 1-2 מחשב TGA 108 99 6002 90 75 87 109 F 1-2 TG מחשב נמוך 120 96 401 101 77 78 131 G 1-2 ThGA PC 93 93 121 5192 81 97 101 H 1-2 ThGA מחשב נמוך 119 100 119 335 80 76 117 A 3-4 מחשב IAA 111 102 112 82 1611 78 96 B 3-4 IAA מחשב נמוך 148 91 121 99 197 71 91 C 3-4 מחשב IFNaA 84 79 69 78 80 4994 83 D 3-4 IFNaA מחשב נמוך 88 86 74 82 66 330 78 E 3-4 מחשב IA-2A 104 107 125 68 78 87 5770 F 3-4 מחשב נמוך IA-2A 126 98 117 95 86 98 361 G 3-4 נ.צ. 84 77 119 71 81 86 87 H 3-4 נ.צ. 84 71 127 82 78 77 79 A 5-6 דוגמה1 132 3851 119 2217 82 77 106 B 5-6 דוגמה2 5396 80 69 950 94 80 4844 C 5-6 דוגמה3 2240 90 3305 130 66 87 119 D 5-6 דוגמה4 132 561 134 848 93 2520 128 E 5-6 דוגמה5 540 679 100 233 495 61 256 F 5-6 דוגמה6 104 89 1114 61 72 77 89 G 5-6 דוגמה7 106 1212 110 81 101 74 1957 H 5-6 דוגמה8 297 4322 519 93 79 77 2361 טבלה 2: ניתוח של בדיקת ECL 7-plex: סידור נתוני טבלה 1, המסומנים כ-7 מקשרים. הנתונים מטבלה 1 אורגנו מחדש, כאשר המקשרים 4 עד 6 (לא נעשה בהם שימוש) נמחקו, וערכים ממוצעים חושבו מכל קריאה כפולה מטבלה 1. הערכים של הבקרות החיוביות הגבוהות והנמוכות הסטנדרטיות הפנימיות, המתאימות לכל בדיקת נוגדנים עצמיים, המרוסנים על ידי מקשר מסוים, נמצאים בהדגשה כהה. מחשב, שליטה חיובית. NC, שליטה רגילה. גד-אינדקס TPOA-אינדקס TGA-Index ThGA-Index מדד IAA IFNaA-Index מדד IA-2A מחשב גאדה 1.000 0.005 0.000 0.003 -0.006 0.003 0.004 גדה מחשב נמוך 0.045 0.005 -0.001 0.006 0.002 0.000 -0.001 מחשב IAA 0.005 1.000 0.001 0.002 -0.001 -0.001 0.004 IAA מחשב נמוך 0.002 0.039 -0.002 0.003 -0.005 -0.003 0.001 מחשב IA-2A 0.004 0.004 1.000 0.004 -0.004 0.000 0.004 מחשב נמוך IA-2A 0.007 0.004 0.048 0.006 -0.002 -0.002 0.008 מחשב TGA 0.002 0.003 0.000 1.000 0.000 0.002 0.002 TG מחשב נמוך 0.006 0.004 0.000 0.052 -0.001 -0.002 0.005 מחשב TPOA 0.005 0.005 -0.001 0.002 1.000 -0.002 0.001 TPOA מחשב נמוך 0.012 0.003 0.000 0.006 0.076 -0.003 0.001 ThGA PC 0.000 0.000 -0.008 0.001 0.000 1.000 -0.001 ThGA מחשב נמוך 0.001 0.002 -0.008 0.002 -0.009 0.050 -0.002 מחשב IFNaA 0.004 0.006 0.001 0.000 -0.002 0.000 1.000 IFNaA מחשב נמוך 0.008 0.004 0.000 0.005 0.004 0.002 0.048 נ.צ. 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 נ.צ. 0.000 -0.001 0.001 0.002 -0.002 -0.002 -0.001 דוגמה1 0.009 0.683 0.000 0.419 0.001 -0.002 0.003 דוגמה2 0.958 0.001 -0.008 0.172 0.009 -0.001 0.837 דוגמה3 0.389 0.002 0.542 0.012 -0.009 0.000 0.006 דוגמה4 0.009 0.088 0.003 0.152 0.008 0.496 0.007 דוגמה5 0.082 0.109 -0.003 0.032 0.271 -0.005 0.030 דוגמה6 0.004 0.002 0.169 -0.002 -0.006 -0.002 0.000 דוגמה7 0.004 0.205 -0.002 0.002 0.013 -0.002 0.329 דוגמה8 0.039 0.768 0.068 0.004 -0.001 -0.002 0.400 טבלה 3: ניתוח של מבחן ECL 7-plex: תוצאות של ערכי מדד. ערכי האינדקס עבור כל מדגם עבור כל 7 מבחני הנוגדנים העצמיים חושבו כנגד הבקרות החיוביות והשליליות הפנימיות המקבילות שלהם כמתואר בפרוטוקול הבדיקה. כל ערך אינדקס שהיה גדול מערך החיתוך הוגדר כתוצאה חיובית, המוצגת בהדגשה כהה. ערך TGA-index של sample6 הודגש באפור מכיוון שמדובר בשגיאה הנגרמת על-ידי כפילויות שגויות המוצגות בשורה F-linker 3-עמודות 5 ו- 6 בטבלה 1. גדא IA-2A רשות העתיקות .TGA TPOA ת.ג.א. IFNαA* סנס מפרט טכני סנס מפרט טכני סנס מפרט טכני סנס מפרט טכני סנס מפרט טכני סנס מפרט טכני סנס מפרט טכני RBA 73.4% 98.5% 75.2% 99.0% 47.7% 99.1% 12.9% 99.0% 23.9% 95.2% 19.3% 94.7% 1.0% 99.6% ECL יחיד 71.6% 99.1% 73.6% 99.3% 48.3% 99.7% 16.0% 98.9% 26.3% 94.9% 20.6% 95.1% 0.8% 99.2% 7-Plex ECL 71.2% 98.9% 77.3% 98.9% 49.5% 98.9% 16.5% 98.7% 26.1% 94.7% 21.1% 94.7% 1.7% 99.1% טבלה 4: בדיקת רגישות וספציפיות בקרב 1026 מטופלי T1D ו-1022 בקרות, המותאמות הן לגיל והן למין, בבדיקת ECL של 7 פלקסים, בהשוואה לבדיקת ECL יחידה מקבילה ו-RBA או ELISA*. מבחני T hree שונים (RBA, ECL יחיד ו- 7-Plex ECL) עבור כל נוגדן אוטומטי הוגדרו למאפיינים ספציפיים דומים באמצעות 1022 גיל ומין תואמים בקרות בריאות. תוצאת הספציפיות של קבוצת הביקורת שנחקרה נקבעה סביב 95% עבור TPOA ו- ThGA ו- 99% עבור 5 המבחנים האחרים. *כוכבית מסמנת את בדיקת IFNαA עבור ELISA, בעוד שאחרות הן RBA.