Een high-throughput elektrochemiluminescentie 7-Plex-test die tegelijkertijd screent op type 1 diabetes en meerdere auto-immuunziekten

Analyse van de testresultaten werd weergegeven in tabel 1, tabel 2 en tabel 3. Leeswaarden komen uit de gegevens van de 10 plekken binnen dezelfde put. De indexwaarden voor elk monster werden berekend op basis van de overeenkomstige interne positieve en negatieve controles zoals beschreven in het testprotocol. Voorbeelden van slechte duplicaten zijn weergegeven in tabel 1 en veroorzaakten de uiteindelijke indexberekeningsfout in tabel 3. Alle ruwe telwaarden moeten worden gecontroleerd om vals-positieve of fout-negatieve resultaten te voorkomen. De 7-multiplexed ECL-test werd gevalideerd met behulp van een groot cohort monsters van 1026 nieuw gediagnosticeerde patiënten met T1D en 1022 leeftijd en geslacht gematchte gezonde controlepersonen. De niveaus van auto-antilichamen uit 7-Plex ECL-assay voor 1026 T1D-patiënten werden vergeleken met de niveaus van elk van onze overeenkomstige vastgestelde enkelvoudige ECL-assays zoals weergegeven in Figuur 2 en van elke overeenkomstige enkelvoudige standaard RBA en ELISA zoals weergegeven in Figuur 3. De assay specificiteiten werden identiek opgezet op 99e percentielen voor alle autoantilichaam assays behalve voor schildklier autoantilichamen (waar het 95e percentiel werd gebruikt), van 1022 gezonde controles voor alle drie de testmethoden (7-Plex ECL, single ECL, RBA of ELISA) zoals vermeld in tabel 4. De intertest-cv’s van GADA, IA-2A, IAA, TPOA, ThGA, TGA en IFNαA zijn respectievelijk 6,4%, 4,5%, 9,1%, 4,9%, 5,7%, 11,3% en 5,9%. Een klein aantal discordante monsters voor elk van de 7 auto-antilichamen werd gevonden rond de grens van cut-offs voor elke test (figuur 2 en figuur 3). Elf controlemonsters (11/1022, 1,1%) werden alleen in de 7-Plex-test positief gevonden en negatief in elke overeenkomstige enkele test. Evenzo gebeurde het in 9 monsters van de T1D-patiënten (9/1026, 0,9%). Bovendien werden 10 hoogpositieve TPOA en één ThGA in patiëntencohort die werden gezien in zowel de enkele ECL-assay als de RBA gemist in de 7-Plex-test. Deze monsters werden positief omgezet in de 7-Plex-test toen ze verder werden verdund. Over het algemeen werd 100% van de positiviteit in een enkele ECL-assay of RBA behandeld in de 7-Plex ECL-test, met dezelfde assay-specificiteit als geïllustreerd in tabel 4. Figuur 1: Illustratie van de Mutiplex ECL-test.Auto-antilichamen in serum zullen het Ru Sulfo-NHSged-antigeen overbruggen naar het gebiotinyleerde antigeen. Dit wordt gekoppeld aan een specifieke linker om een complex van antigeen-antilichaam-antigeen-linker te vormen. De complexen worden op de plaat gevangen en worden via elke specifieke linker op hun specifieke plekken vastgehouden. De specifiek gekoppelde linkergetallen, voor de 7 verschillende antigeeneiwitten, worden geïllustreerd. Detectie van antilichaamsignalen wordt bereikt met behulp van Ru Sulfo-NHS-gelabelde antigenen met elektrochemiluminescentie. De figuur is van Gu, Y. et al.13. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: Vergelijking van 7 autoantilichaamspiegels bij 1026 nieuwe patiënten met T1D tussen de enkele ECL-test en de 7-Plex ECL-test.Panelen a, b, c, d, e, f en g geven vergelijkingen weer van autoantilichaamniveaus voor respectievelijk GADA, IA-2A, IAA, TGA, TPOA, ThGA en IFNαA. De stippellijnen vertegenwoordigen de assay cut-offs voor elke autoantilichaam assay. De cut-offs werden ingesteld op het99e percentiel van 1022 leeftijd-gematchte gezonde controles voor elke test (behalve voor TPOA en ThGA die waren ingesteld op het95e percentiel), zoals weergegeven in tabel 4, vanaf 1022 leeftijd overeengekomen gezonde controles voor zowel single als multiplex ECL-assays. Rode gesloten diamanten worden gemarkeerd als ‘valse’ positieven in de 7-Plex ECL-test, < 1% van het onderzochte cohort, en ze werden gevalideerd als negatief in zowel enkele ECL als RBA. Rode nauwe vierkanten worden gemarkeerd als 'valse' negatieven in de 7-Plex ECL-test veroorzaakt door het fenomeen 'prozone', voornamelijk voorkomend in de TPOA-test in <1% van het onderzochte cohort. Beide vals-positieve als vals-negatieve uitkomsten worden besproken in de discussiesectie. De figuur is van Gu, Y. et al.13. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: Vergelijking van 7 autoantilichaamspiegels bij 1026 nieuwe patiënten met T1D tussen de RBA (ELISA voor IFNαA) en de 7-Plex ECL-test.Panelen a, b, c, d, e, f en g presenteren vergelijkingen van autoantilichaamniveaus voor respectievelijk GADA, IA-2A, IAA, TGA, TPOA, ThGA en IFNαA. De stippellijnen vertegenwoordigen de assay cut-offs voor elke autoantilichaam assay, dezelfde specificiteit set voor zowel RBA als de 7-Plex ECL assay, zoals weergegeven in Tabel 4, vanaf 1022 leeftijd gematchte gezonde controles. Rode gesloten diamanten en vierkanten vertegenwoordigen ‘valse’ positieven en ‘valse’ negatieven die voorkomen in de 7-Plex ECL-test, hetzelfde wordt weergegeven in figuur 2. De figuur is van Gu, Y. et al.13. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 1 2 3 4 5 6 Een 5580 5674 105 117 125 139 Linker-1 100 108 102 102 3956 3745 Linker-2 115 124 107 116 113 124 linker-3 67 64 68 61 65 69 Linker-4 89 87 98 92 90 80 linker-5 87 71 89 87 61 72 Linker-6 94 82 79 85 2154 2280 Linker-7 75 66 1628 1594 81 83 Linker-8 98 103 71 84 69 85 linker-9 102 118 93 98 113 99 linker-10 B 324 337 147 148 5426 5366 Linker-1 101 102 93 88 86 74 Linker-2 111 119 119 123 66 72 linker-3 72 65 59 68 74 67 Linker-4 81 98 83 92 79 72 linker-5 90 84 93 86 70 76 Linker-6 101 105 101 97 956 944 Linker-7 82 83 189 204 97 90 Linker-8 92 83 78 64 82 78 linker-9 83 79 88 93 4722 4965 linker-10 C 110 110 87 81 2114 2365 Linker-1 5526 5680 88 70 86 93 Linker-2 114 132 67 71 3326 3284 linker-3 64 62 88 74 64 80 Linker-4 94 82 86 75 89 76 linker-5 77 87 75 63 70 86 Linker-6 77 86 71 84 138 121 Linker-7 73 86 80 79 59 73 Linker-8 86 74 5064 4923 88 86 linker-9 105 113 85 80 124 114 linker-10 D 98 88 92 84 136 127 Linker-1 288 291 86 86 558 564 Linker-2 109 101 74 73 141 127 linker-3 78 66 66 55 74 66 Linker-4 79 83 79 86 96 91 linker-5 83 86 96 89 86 73 Linker-6 87 89 77 87 841 855 Linker-7 74 72 60 72 90 95 Linker-8 68 75 331 328 2460 2580 linker-9 86 98 80 75 123 133 linker-10 E 101 114 101 106 532 548 Linker-1 101 96 110 104 682 675 Linker-2 6015 5988 124 126 101 98 linker-3 66 71 82 71 80 62 Linker-4 102 97 99 80 83 110 linker-5 82 67 81 80 60 85 Linker-6 85 95 52 84 245 221 Linker-7 72 78 82 74 486 503 Linker-8 77 97 97 77 56 66 linker-9 114 104 5726 5814 259 253 linker-10 F 119 120 133 118 112 96 Linker-1 101 91 100 95 96 82 Linker-2 406 395 111 123 2127 101 linker-3 72 60 86 72 79 83 Linker-4 76 85 96 99 89 103 linker-5 88 78 91 83 89 95 Linker-6 104 97 87 102 56 66 Linker-7 76 77 79 93 69 75 Linker-8 85 71 95 100 83 71 linker-9 131 131 358 364 92 86 linker-10 G 90 95 85 82 105 107 Linker-1 99 86 77 76 1250 1174 Linker-2 119 123 120 118 112 108 linker-3 76 83 77 80 86 76 Linker-4 88 86 86 93 107 92 linker-5 73 73 71 82 84 75 Linker-6 5210 5173 72 69 76 85 Linker-7 80 81 79 82 100 101 Linker-8 96 97 89 83 65 83 linker-9 98 103 86 88 1933 1979 linker-10 H 114 124 81 86 299 295 Linker-1 107 92 69 72 4256 4388 Linker-2 114 123 125 129 501 536 linker-3 77 70 67 64 74 62 Linker-4 92 110 81 84 77 71 linker-5 87 79 72 76 83 81 Linker-6 328 341 84 80 88 97 Linker-7 75 84 75 90 74 83 Linker-8 73 79 78 76 84 70 linker-9 113 120 81 76 2372 2350 linker-10 Tabel 1: Analyse van 7-plex ECL-assay: ruwe CPS-tellingen (linkerhelft van de plaat). Ruwe CPS-tellingen worden verkregen uit een testplaat (de linkerhelft van de plaat) en elk monster wordt in tweevoud uitgevoerd. Onder elke rij van de plaat (A-H) bevinden zich 10 regels leeswaarden die de gegevens van de 10 plekken in dezelfde put vertegenwoordigen, overeenkomend met elk linkernummer zoals gemarkeerd. Voorbeelden van slechte duplicaten worden grijs gemarkeerd, zoals te zien is in rij F-linker 3-kolommen 5 en 6. Rij van tabel 1A Kolom van tabel 1A LINKER 1 LINKER 2 LINKER 3 LINKER 7 LINKER 8 LINKER 9 LINKER 10 Een 1-2 GADA PC 5627 104 120 88 71 101 110 B 1-2 GADA Lage PC 331 102 115 103 83 88 81 C 1-2 TPOA PC 110 5603 123 82 80 80 109 D 1-2 TPOA Lage PC 93 290 105 88 73 72 92 E 1-2 TGA PC 108 99 6002 90 75 87 109 F 1-2 TG Lage PC 120 96 401 101 77 78 131 G 1-2 ThGA PC 93 93 121 5192 81 97 101 H 1-2 ThGA Lage PC 119 100 119 335 80 76 117 Een 3-4 IAA-pc 111 102 112 82 1611 78 96 B 3-4 IAA Lage PC 148 91 121 99 197 71 91 C 3-4 IFNaA PC 84 79 69 78 80 4994 83 D 3-4 IFNaA Lage PC 88 86 74 82 66 330 78 E 3-4 IA-2A PC 104 107 125 68 78 87 5770 F 3-4 IA-2A Lage PC 126 98 117 95 86 98 361 G 3-4 NC 84 77 119 71 81 86 87 H 3-4 NC 84 71 127 82 78 77 79 Een 5-6 voorbeeld1 132 3851 119 2217 82 77 106 B 5-6 voorbeeld2 5396 80 69 950 94 80 4844 C 5-6 voorbeeld3 2240 90 3305 130 66 87 119 D 5-6 voorbeeld4 132 561 134 848 93 2520 128 E 5-6 voorbeeld5 540 679 100 233 495 61 256 F 5-6 voorbeeld6 104 89 1114 61 72 77 89 G 5-6 voorbeeld7 106 1212 110 81 101 74 1957 H 5-6 voorbeeld8 297 4322 519 93 79 77 2361 Tabel 2: Analyse van 7-plex ECL-assay: rangschikking van de tabel 1-gegevens, gemarkeerd als 7 linkers. De gegevens uit tabel 1 werden herschikt, waarbij linkers 4 tot en met 6 (niet gebruikt) werden verwijderd, en gemiddelde waarden werden berekend uit elke dubbele meting uit tabel 1. De waarden van de interne standaard hoge en lage positieve controles, overeenkomend met elke autoantilichaam assay, beperkt door een bepaalde linker, zijn in het donker vetgedrukt. PC, positieve controle. NC, normale controle. GAD-Index TPOA-index TGA-Index ThGA-Index IAA-Index IFNaA-index IA-2A-index GADA PC 1.000 0.005 0.000 0.003 -0.006 0.003 0.004 GADA Lage PC 0.045 0.005 -0.001 0.006 0.002 0.000 -0.001 IAA-pc 0.005 1.000 0.001 0.002 -0.001 -0.001 0.004 IAA Lage PC 0.002 0.039 -0.002 0.003 -0.005 -0.003 0.001 IA-2A PC 0.004 0.004 1.000 0.004 -0.004 0.000 0.004 IA-2A Lage PC 0.007 0.004 0.048 0.006 -0.002 -0.002 0.008 TGA PC 0.002 0.003 0.000 1.000 0.000 0.002 0.002 TG Lage PC 0.006 0.004 0.000 0.052 -0.001 -0.002 0.005 TPOA PC 0.005 0.005 -0.001 0.002 1.000 -0.002 0.001 TPOA Lage PC 0.012 0.003 0.000 0.006 0.076 -0.003 0.001 ThGA PC 0.000 0.000 -0.008 0.001 0.000 1.000 -0.001 ThGA Lage PC 0.001 0.002 -0.008 0.002 -0.009 0.050 -0.002 IFNaA PC 0.004 0.006 0.001 0.000 -0.002 0.000 1.000 IFNaA Lage PC 0.008 0.004 0.000 0.005 0.004 0.002 0.048 NC 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 NC 0.000 -0.001 0.001 0.002 -0.002 -0.002 -0.001 voorbeeld1 0.009 0.683 0.000 0.419 0.001 -0.002 0.003 voorbeeld2 0.958 0.001 -0.008 0.172 0.009 -0.001 0.837 voorbeeld3 0.389 0.002 0.542 0.012 -0.009 0.000 0.006 voorbeeld4 0.009 0.088 0.003 0.152 0.008 0.496 0.007 voorbeeld5 0.082 0.109 -0.003 0.032 0.271 -0.005 0.030 voorbeeld6 0.004 0.002 0.169 -0.002 -0.006 -0.002 0.000 voorbeeld7 0.004 0.205 -0.002 0.002 0.013 -0.002 0.329 voorbeeld8 0.039 0.768 0.068 0.004 -0.001 -0.002 0.400 Tabel 3: Analyse van 7-plex ECL-assay: resultaten van indexwaarden. Indexwaarden voor elk monster voor alle 7 autoantilichaamtests werden berekend op basis van hun overeenkomstige interne positieve en negatieve controles zoals beschreven in het testprotocol. Elke indexwaarde die groter was dan de afkapwaarde werd gedefinieerd als een positief resultaat, vetgedrukt weergegeven. De TGA-indexwaarde van sample6 werd grijs gemarkeerd omdat het een fout is die wordt veroorzaakt door slechte duplicaten in rij F-linker 3-kolommen 5 en 6 in tabel 1. Gada IA-2A IAA .TGA TPOA ThGA IFNαA* Sens Spec Sens Spec Sens Spec Sens Spec Sens Spec Sens Spec Sens Spec RBA 73.4% 98.5% 75.2% 99.0% 47.7% 99.1% 12.9% 99.0% 23.9% 95.2% 19.3% 94.7% 1.0% 99.6% Enkele ECL 71.6% 99.1% 73.6% 99.3% 48.3% 99.7% 16.0% 98.9% 26.3% 94.9% 20.6% 95.1% 0.8% 99.2% 7-Plex ECL 71.2% 98.9% 77.3% 98.9% 49.5% 98.9% 16.5% 98.7% 26.1% 94.7% 21.1% 94.7% 1.7% 99.1% Tabel 4: Testgevoeligheid en specificiteit bij 1026 T1D-patiënten en 1022 controles, gematcht voor zowel leeftijd als geslacht, in een 7-plex ECL-test, vergeleken met de overeenkomstige enkele ECL-test en RBA of ELISA *. Verschillendetesten (RBA, single ECL en 7-Plex ECL) voor elk autoantilichaam werden ingesteld op vergelijkbare specificiteiten met behulp van de 1022 leeftijd en geslacht gematchte gezonde controles. De specificiteitsuitkomst van het onderzochte controlecohort werd vastgesteld op ongeveer 95% voor TPOA en ThGA en op 99% voor de 5 andere testen. *Asterisk markeert de IFNαA-test voor ELISA, terwijl andere RBA zijn.