Endokardiyal ve Koroner Endotel Hücrelerinin Sıçan Kalbinin Ventriküler Serbest Duvarından İzolasyon

Tüm hayvan prosedürleri Stanford Üniversitesi Laboratuvar Hayvan Bakımı İdari Paneli (APLAC31608) tarafından onaylanmıştır. 1. Tamponların hazırlanması Tablo 1’delistelenen reaktifleri kullanarak sindirim tamponu hazırlayın. DNase I stok çözeltisini hazırlayın: 2.000 birim/mL (1 mg/mL) stok çözeltisi için RNase içermeyen suda DNase I’i çözün. Aliquot ve stok çözeltisini -20 °C’de saklayın. Liberaz çözeltisini hazırlayın: 5 mg/mL’lik bir stok çözeltisi için rnase içermeyen su ile liberaz çözün. 30 dk. Aliquot için 4 °C’de bir rulo üzerinde döndürün ve stok çözeltisini -20 °C’de saklayın. 0,5 M ethylenediaminetetraastic asit (EDTA) ve 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile büyükbaş serum albumin (BSA) stok çözeltisini 2 mM EDTA ve %0,5 BSA’lık son konsantrasyoniçin seyrelterek sıralama tamponunu hazırlayın. 2. Kalp koleksiyonu NOT: Bu protokolde 50-100 g ağırlığında altı Adet Sprague Dawley sıçanı kullanıldı. Cinsiyet farkı gözlenmedi. Co2 ile sıçan ötenazi ve bir diseksiyon platformu üzerinde bir supine pozisyonda yerleştirin. Ekstremiteleri aşağı pin ve% 70 etanol ile hem karın ve göğüs sterilize. Karnı makasla açın ve bağırsakların arkasında bulunan arka vena kava kısmına 21 G iğne yerleştirin. Şırınga pistonunu geri çekin, karaciğer daha açık görünene kadar vendeki kanı geri çekin ve yeterli kan alınmasını gösteren daha fazla kan çekilememiştir. Makas kullanarak, akciğer ve kalbe zarar vermemek için göğsü dikkatlice açın. Forseps ile aort kemer / atriyum kaldırın ve aort, pulmoner arter, pulmoner venler ve vena kava kurtarmak ve kalp kaldırmak için kesti. Aşırı kanı gidermek için kalbi 50 mL soğuk 1x Hanks’in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) tampon3x ile yıkayın. Mikrodises mikroskobu altında, sağ ventrikülsüz duvarı, Dulbecco’nun modifiye Kartal ortamı (DMEM) içeren 5 mL’lik bir tüpe çıkarın (Şekil 1A,B). Onun düz, arka yüz sol ve sağ tarafı tanımlamak için kalp lay. Pulmoner arter bulun, venlerin ve arterlerin en ön kalbin üst dallanma ve sağ ventrikül odasına aşağı pulmoner arter ile kesti. Kalbin ön yüzünde, tepe ulaşana kadar septum boyunca kesilmiş. Pulmoner arter ve sağ ventrikül oda kavşak noktasına kadar septum boyunca kalbin arka tarafında apeks kesmeye devamedin (Şekil 1A). Pulmoner arter ve sağ ventrikül kavşak noktasından başlayarak, sağ ventrikül serbest duvarı kalbin geri kalanından kurtarılıncaya kadar, kalbin hem ön hem de arka tarafını bir önceki diseksiyona dik olarak ve septumdan uzaklaştırın (Şekil 1B). Mikrodisesmikroskop altında, sol ventrikül serbest duvarını DMEM içeren 5 mL’lik bir tüpe çıkarın (Şekil 1C,D). Pulmoner arter arkasında kalbin üst dallanma, aort bulun ve sol ventrikül serbest duvar kesmek için adım 2.5 açıklanan yöntemi tekrarlayın. 3. AET sindirim Hem sağ hem de sol ventrikülsüz duvar dokularını iç yüzeyi düz, aşağı bakacak şekilde 60 cm’lik bir kültür kabına yerleştirin(Şekil 2).NOT: İç yüzey, Şekil 2A,C’ de gösterildiği gibi hafif içbükey şekilli ventriküliç yüzüdür. Tabağa 0,5-1 mL sindirim tamponu ekleyin ve pipetin ucunu doğrudan dokunun altına yerleştirin. Sadece iç yüzey batırılana kadar devam edin. Yemeği %5 CO2, 37 °C inkübatörde 5 dakika kuluçkaya yatırın. Sindirimi durdurmak için kültür yemeğine EC ortamı ekleyin.NOT: SINDIRIM tamponu miktarını 1:5 oranı olarak EC ortamına saklayın. Ventriküllerin iç yüzeyini EC ortamıile yıkamak için 1 mL’lik pipet kullanın ve akıntıyı 40 mm’lik bir süzgeçten 50 mL’lik bir toplama tüpüne aktarın(Şekil 2E). Aşağı saflaştırma için buz üzerinde koleksiyonları tutun. 4. CEC sindirim İç tabakadan(Şekil 2B,D)kirlenmeden sol ventrikülün dış yüzeyini kesin ve her birini sindirim tamponunun 1 mL’lik içeren ayrı bir 5 mL tüpüne yerleştirin.NOT: Sol ventrikül kalın ventrikül olarak tanımlanabilir ve dış yüzey biraz içbükey ventrikül dış yüzü olarak belirlenebilir. Diseksiyon makası kullanarak ventriküler duvarı küçük, 1 mm3 adet ebathalinde doğuz. Tüpü 37 °C’lik bir su banyosunda yaklaşık 15-20 dk. Girdap her 2-3 dakikada bir kuluçkaya yatırın. Pipet 4 mL EC orta 5 mL tüp içine sindirim sona erdirmek için. Çözeltiyi 5 mL serolojik pipetle 40 mm’lik bir süzgeçten 50 mL’lik bir tüpe aktarın(Şekil 2E). Aşağı saflaştırma için buz üzerinde koleksiyonları tutun. 5. Hücre toplama Tüpleri oda sıcaklığında 10 dakika (RT) için 300 x g’de santrifüj edin ve süpernatantı aspire edin. Pelet kırmızı görünüyorsa, 1x kırmızı kan hücresinin (RBC) 1-2 mL’lik lysing tamponu(Şekil 2F)peletini yeniden askıya alın.NOT: RBC yoksa, adım 6’ya geçin. Tüpleri 37 °C’lik bir su banyosunda 5 dakika kuluçkaya yatırın. Pipet 10 mL PBS 50 mL tüpler içine lysis durdurmak için. Tüpleri RT’de 10 dk için 300 x g’da santrifüj edin ve süpernatantı aspire edin. 6. AT sıralama 50 mL tüplere 90 μL sıralama tamponu ve 10 μL anti-CD31 PE antikor ekleyin. Tüpleri girdap ve sonra 4 ° C buzdolabında 10 dakika kuluçka. Tüpleriçine tampon sıralama 10 mL ekleyin, iyice karıştırın ve sonra RT 10 dakika için 300 x g santrifüj. Supernatant aspire ve sıralama tampon 80 μL ve anti-PE mikroboncuklar 20 μL pelet resuspend. Girdap tüpler ve 15 dakika boyunca 4 °C’de kuluçka. Tüplere 10 mL’lik tampon ekleyerek hücreleri yıkayın, iyice karıştırın ve rt’de 10 dakika boyunca 300 x g’de santrifüj edin. Supernatant aspire ve sıralama tampon 500 μL pelet resuspend. Süperparamanyetik küreleri içeren bir sütunu manyetik ayırıcıya yerleştirin ve 3 mL sıralama arabelleğiyle sütunu durulayın. Sütun “akış durdurma” sonra, pipet 500 μL hücre süspansiyon sütunlar içine ve sonra sıralama tampon ile sütunları yıkayın. Yıkama 3x, her 3 mL sıralama tampon(Şekil 2G)ile tekrarlayın. Kolonları ayırıcıdan çıkarın ve yeni bir 15 mL toplama tüpünün üzerine yerleştirin. Pipetle, sütunlara 5 mL EC orta ekleyin ve bir sütun pistonkullanarak çözümü itin. Toplama tüplerini RT’de 10 dk için 300 x g’da santrifüj edin ve süpernatantı aspire edin. Üreticinin talimatlarına uygun olarak, Bir kit kullanarak EEC ve CEC örneklerinin hücre peletinden RNA’yı ayıklayın. En az 500 ng RNA elde edilebilir.NOT: RNA ekstraksiyonundan sonra numune -80 °C’de saklanabilir. Üreticinin talimatlarına uyarak rastgele bir astar ve kit kullanarak cDNA almak için 500 ng RNA’yı ters yazır. Endokardiyal ve endotel popülasyonlarının doğrulanması için nicel PCR gerçekleştirin (Şekil 2H). Astar dizileri Tablo 2’delistelenmiştir. 384 qPCR plakanın kuyularına 5 μL EEC veya CEC cDNA (1 ng/μL) ekleyin. Astar sayısı başına üç kuyu olması için Yeterli kuyulara EEC veya CEC cDNA’sını ekleyin. 6 μL 2x qPCR SYBR yeşil arabelleği, her 10 μM astarın 0,5 μL’si ile karıştırın ve bunları her aday genine karşılık gelen tek bir kuyuya ekleyin. Plakayı rt’de 300 x g’da 1 dk plastik film ve santrifüj ile kapatın. Plakayı bir qPCR makinesine yerleştirin ve ardından programı 95 °C’de 3 dk, ardından 15 s için 95 °C’de ve ardından 55 °C’de 60 s. Sonraki iki adımı 45 devir için tekrarlayın.