Aislamiento de células endoteliales endocardiales y coronarias de la pared libre ventricular del corazón de rata

Todos los procedimientos de animales fueron aprobados por el Panel Administrativo sobre Cuidado de Animales de Laboratorio (APLAC31608) en la Universidad de Stanford. 1. Preparación de tampones Prepare el tampón de digestión utilizando los reactivos enumerados en la Tabla 1. Preparar la solución de stock DNase I: Disolver DNase I en agua libre de RNase para una solución de stock de 2.000 unidades/ml (1 mg/ml). Aliquot y almacenar la solución de stock a -20 oC. Preparar la solución liberadora: Disolver libera con agua libre de RNase para una solución en stock de 5 mg/ml. Gire en una caja de rodillos a 4 oC durante 30 minutos aliquot y almacene la solución de stock a -20 oC. Preparar el tampón de clasificación diluyendo 0,5 M de ácido etilendiaminetetraacético (EDTA) y 10% de albúmina sérica bovina (BSA) con 1 solución salina tamponada de fosfato (PBS) para una concentración final de 2 mM de EDTA y 0,5% de BSA. 2. Colección de corazones NOTA: En este protocolo se utilizaron seis ratas Sprague Dawley que pesaban entre 50 y 100 g. No se observó ninguna diferencia de género. Eutanasia la rata con CO2 y colóquela en posición supina sobre una plataforma de diseción. Anclar las extremidades hacia abajo y esterilizar tanto el abdomen como el pecho con 70% de etanol. Abra el abdomen con tijeras e inserte una aguja de 21 G en la porción de la vena cava posterior situada detrás de los intestinos. Tire del émbolo de la jeringa hacia atrás, retirando la sangre de la vena hasta que el hígado parezca más claro de color y no se pueda extraer más sangre, lo que indica suficiente extracción de sangre. Con tijeras, abra el pecho cuidadosamente para evitar dañar el pulmón y el corazón. Levante el arco/aurícula de la aorta con los fórceps y corte la aorta, la arteria pulmonar, las venas pulmonares y la vena cava para liberar y extraer el corazón. Lavar el corazón con 50 ml de tampón de solución salina equilibrada (HBSS) de 50 ml de solución salina balanceada de Hanks (HBSS) 3 veces para eliminar el exceso de sangre. Bajo un microscopio de microdisección, retire la pared libre ventricular derecha en un tubo de 5 ml que contenga el medio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco(Figura 1A,B). Poner el corazón en su cara más plana, posterior para identificar el lado izquierdo y derecho. Localice la arteria pulmonar, la más anterior de las venas y arterias que se ramifican desde la parte superior del corazón y corte a través de la arteria pulmonar hasta la cámara ventricular derecha. En la cara anterior del corazón, corte a lo largo del tabique hasta llegar al ápice. Continúe cortando desde el ápice hacia arriba el lado posterior del corazón a lo largo del tabique hasta la arteria pulmonar y el punto de unión de la cámara ventricular derecha(Figura 1A). A partir de la arteria pulmonar y el punto de unión ventricular derecha, corte el lado anterior y posterior del corazón perpendicularmente a la disección anterior y lejos del tabique, hasta que la pared libre ventricular derecha se libere del resto del corazón(Figura 1B). Bajo el microscopio de microdisección, retire la pared libre del ventrículo izquierdo en un tubo de 5 ml que contenga DMEM(Figura 1C,D). Localice la aorta, ramificándose desde la parte superior del corazón detrás de la arteria pulmonar, y repita el método descrito en el paso 2.5 para cortar la pared libre del ventíndor izquierdo. 3. Digestión CEE Coloque los tejidos de pared libre del ventular derecho e izquierdo en un plato de cultivo de 60 cm con la superficie interior acostada plana, mirando hacia abajo(Figura 2).NOTA: La superficie interior es la cara interior del ventrículo de forma ligeramente cóncava, como se muestra en la Figura 2A,C. Añadir 0,5–1 ml de tampón de digestión al plato, colocando la punta de la pipeta directamente debajo del tejido. Continúe hasta que sólo se sumerja la superficie interior. Incubar el plato en una incubadora de CO2al 5%, 37oC durante 5 min. Agregue el medio EC al plato de cultivo para detener la digestión.NOTA: Mantenga la cantidad de tampón de digestión en medio EC como una proporción de 1:5. Utilice una pipeta de 1 ml para vaciar la superficie interna de los ventrículos con medio EC y transferir la escorrenta a un tubo de recogida de 50 ml a través de un colador de 40 mm(Figura 2E). Mantenga las colecciones en hielo para su purificación aguas abajo. 4. Digestión CEC Corte a lo largo de la superficie exterior del ventrículo izquierdo sin contaminación de la capa interna(Figura 2B,D)y coloque cada uno en un tubo separado de 5 ml que contenga 1 ml del tampón de digestión.NOTA: El ventrículo izquierdo se puede identificar como el ventrículo más grueso, y la superficie exterior se puede determinar como la cara exterior del ventrículo ligeramente cóncavo. Usando tijeras de disección, picar la pared ventricular en pequeñas piezas de 1 mm3. Incubar el tubo en un baño de agua de 37 oC durante unos 15-20 minutos de vórtice cada 2-3 min. Pipetear 4 ml de medio EC en el tubo de 5 ml para terminar la digestión. Transfiera la solución con una pipeta serológica de 5 ml a un tubo de 50 ml a través de un colador de 40 mm(Figura 2E). Mantenga las colecciones en hielo para su purificación aguas abajo. 5. Colección de células Centrifugar los tubos a 300 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente (RT) y luego aspirar el sobrenadante. Si el pellet aparece rojo, resuspenda el pellet en 1–2 ml de 1x tampón de lising de glóbulos rojos (RBC)(Figura 2F).NOTA: Si no hay RCO, continúe con el paso 6. Incubar los tubos en un baño de agua de 37oC durante 5 min. Pipetear 10 ml de PBS en los tubos de 50 ml para detener la lisis. Centrifugar los tubos a 300 x g durante 10 minutos en RT, y luego aspirar el sobrenadante. 6. Clasificación CE Añadir 90 ml de tampón de clasificación y 10 l de anticuerpo anti-CD31 PE en los tubos de 50 ml. Vortex los tubos y luego incubarlos durante 10 minutos en un refrigerador de 4 oC. Añadir 10 ml de tampón de clasificación en los tubos, mezclar a fondo, y luego centrifugar a 300 x g durante 10 minutos en RT. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 80 l de tampón de clasificación y 20 l de microperlas. Vortic los tubos e incubar a 4oC durante 15 min. Lave las células agregando 10 ml de tampón de clasificación en los tubos, mezcle bien y luego centrifugarlas a 300 x g durante 10 minutos a RT. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 500 l de tampón de clasificación. Coloque una columna que contenga esferas superparamagnéticas en un separador magnético y enjuague la columna con 3 ml de tampón de clasificación. Después de que la columna sea “parada de flujo”, pipeta 500 l de la suspensión celular en las columnas y luego lave las columnas con búfer de clasificación. Repita el lavado 3x, cada uno con 3 ml de búfer de clasificación(Figura 2G). Retire las columnas del separador y colóquelas encima de un nuevo tubo de recogida de 15 ml. Con una pipeta, añada 5 ml de medio EC a las columnas e propulse la solución mediante un émbolo de columna. Centrifugar los tubos de recogida a 300 x g durante 10 minutos a RT y luego aspirar el sobrenadante. Extraiga el ARN del pellet celular de las muestras CEE y CEC utilizando un kit, siguiendo las instrucciones del fabricante. Se puede obtener un mínimo de 500 ng de ARN.NOTA: Después de la extracción del ARN, la muestra se puede almacenar a -80 oC. Trasvierta 500 ng de ARN para obtener ADNc usando una imprimación aleatoria y un kit, siguiendo las instrucciones del fabricante. Realizar un ITP cuantitativo para la validación de poblaciones endocardiales y endoteliales(Figura 2H). Las secuencias de imprimación se enumeran en la Tabla 2. Añadir 5 l de ADNC CEE o CEC (1 ng/L) en los pocillos de una placa de 384 qPCR. Agregue el ADNC CEE o CEC en suficientes pozos para que haya tres pozos por número de imprimaciones. Mezclar 6 l de tampón verde QPCR SYBR de 2x con 0,5 ml de cada imprimación de 10 m, incluidas las imprimaciones delanteras e inversas, y añadirlas en un solo pozo correspondiente a cada gen candidato. Sellar la placa con película de plástico y centrífuga durante 1 min a 300 x g a RT. Coloque la placa en una máquina qPCR y, a continuación, inicie el programa a 95 oC durante 3 min, seguido de 95 oC durante 15 s, y luego 55 oC durante 60 s. Repita los dos pasos siguientes para 45 ciclos.