Изоляция эндокардиальных и коронарных эндотелиальных клеток от вентрикулярной свободной стены Крысиного Сердца

Все процедуры для животных были одобрены Административной группой по уходу за лабораторными животными (APLAC31608) Стэнфордского университета. 1. Подготовка буферов Подготовьте буфер пищеварения с помощью реагентов, перечисленных в таблице 1. Подготовка DNase I фондовых решение: Растворите DNase I в RNase воды для фондового решения 2000 единиц / мл (1 мг /мл). Aliquot и хранить складе раствора при -20 градусах Цельсия. Подготовка раствора liberase: Растворите liberase с rNase-свободной водой для разрешения штока 5 мг/мл. Поверните его на роликовой банке при 4 градусах по Цельсию в течение 30 мин. Aliquot и храните складраствор при -20 градусов по Цельсию. Подготовьте сортировочный буфер путем разбавления 0,5 М этиленденеамитететраацетической кислоты (ЭДТА) и 10% раствора сыворотки сыворотки крупного рогатого скота (BSA) с 1x фосфатным буферным сольниковым раствором (PBS) для конечной концентрации 2 мМ ЭДТА и 0,5% BSA. 2. Коллекция сердца ПРИМЕЧАНИЕ: Шесть крыс Sprague Dawley весом 50-100 г были использованы в этом протоколе. Не наблюдалось никаких гендерных различий. Эвтанизировать крысу с CO2 и поместить ее в положение на спине на рассекающей платформе. Прикрепите конечности вниз и стерилизовать живот и грудь с 70% этанола. Откройте живот ножницами и вставьте 21 G иглу в часть задней полы вены, расположенной за кишечником. Потяните шприц поршень обратно, снятие крови из вены, пока печень появляется светлее в цвете и не больше крови могут быть сняты, что свидетельствует о достаточном удалении крови. Используя ножницы, откройте грудь тщательно, чтобы избежать повреждения легких и сердца. Поднимите арку аорты / атриум с щипками и сократить аорты, легочной артерии, легочных вен, и вены полы освободить и удалить сердце. Вымойте сердце с 50 мл холодного 1x Хэнкс ‘сбалансированный солевой раствор (HBSS) буфер 3x, чтобы удалить чрезмерную кровь. Под микроскопом микродиссекции, удалить правый желудочковой свободной стенки в 5 мл трубки, содержащей Dulbecco в модифицированной среде Eagle (DMEM)(Рисунок 1A,B). Положите сердце на его льстить, заднее лицо, чтобы определить левую и правую сторону. Найдите легочную артерию, самую переднюю вену и артерии, разветвляющиеся с верхней части сердца, и прорежьте легочную артерию до правой желудочковой камеры. На передней стороне сердца, вырезать вдоль перегородки до достижения вершины. Продолжить резки с вершины до задней стороне сердца вдоль перегородки до легочной артерии и правой желудочковой камеры точки соединения(рисунок 1A). Начиная с легочной артерии и правой точки соединения желудочка, вырезать как переднюю и заднюю сторону сердца перпендикулярно к предыдущему вскрытию и от перегородки, пока правая стенка желудочков освобождается от остальной части сердца (Рисунок 1B). Под микроскопом микродиссекции, удалить левый желудочковой свободной стенки в 5 мл трубки, содержащей DMEM(Рисунок 1C,D). Найдите аорту, ветвящийся от верхней части сердца за легочной артерией, и повторите метод, описанный в шаге 2.5, чтобы отрезать левую стенку желудочка. 3. Пищеварение ЕЭК Поместите как правый, так и левый желудочковые свободные стены ткани в 60 см культуры блюдо с внутренней поверхностью лежал плоский, лицом вниз(Рисунок 2).ПРИМЕЧАНИЕ: Внутренняя поверхность является внутренней поверхностью слегка вогнутой формы желудочка, как показано на рисунке 2A,C. Добавьте в блюдо 0,5-1 мл буфера пищеварения, поместив кончик пипетки прямо под ткань. Продолжайте, пока не будет погружена только внутренняя поверхность. Инкубировать блюдо в 5% CO2,37 КС инкубатор в течение 5 мин. Добавить EC среде в культуре блюдо, чтобы остановить пищеварение.ПРИМЕЧАНИЕ: Держите количество буфера пищеварения к среде EC как коэффициент 1:5. Используйте 1 мл пипетки, чтобы промыть внутреннюю поверхность желудочков с помощью EC среды и перенести стока в трубку сбора 50 мл через 40 мм ситечко(рисунок 2E). Храните коллекции на льду для очистки ниже по течению. 4. Пищеварение ЦИК Вырезать вдоль внешней поверхности левого желудочка без загрязнения от внутреннего слоя(рисунок 2B,D) и поместите каждый в отдельной трубке 5 мл, содержащей 1 мл буфера пищеварения.ПРИМЕЧАНИЕ: Левый желудочек можно определить как более толстый желудочек, а внешняя поверхность может быть определена как внешняя грань слегка вогнутого желудочка. Используя рассечение ножницами, фарш стенки желудочка в малых, 1 мм3 штук. Инкубировать трубку в водяной бане 37 градусов по Цельсию в течение 15-20 мин. Вортекс каждые 2-3 мин. Пипетка 4 мл EC среды в 5 мл трубки для прекращения пищеварения. Перенесите раствор с серологическим пипеткой 5 мл в трубку 50 мл через 40-мм ситечко(рисунок 2E). Храните коллекции на льду для очистки ниже по течению. 5. Коллекция клеток Центрифуга труб на 300 х г в течение 10 минут при комнатной температуре (RT), а затем аспирации супернатанта. Если гранулы появляются красными, resuspend гранулы в 1-2 мл 1x красных кровяных телец (РБК) lysing буфера(рисунок 2F).ПРИМЕЧАНИЕ: Если НЕТ РБК, перейдите к шагу 6. Инкубировать трубки в водяной бане 37 градусов в течение 5 мин. Пипетка 10 мл PBS в 50 мл труб, чтобы остановить лиза. Центрифуга труб на 300 х г в течение 10 минут на RT, а затем аспирации супернатанта. 6. Сортировка ЕС Добавьте 90 кЛ сортирующего буфера и 10 зл анти-CD31 PE антитела в 50 мл труб. Vortex трубки, а затем инкубировать их в течение 10 минут в холодильнике 4 кс. Добавьте 10 мл сортировки буфера в трубки, тщательно перемешайте, а затем центрифугу при 300 х г в течение 10 минут на RT. Аспирировать супернатант и resuspend гранулы в 80 злител сортировожного буфера и 20 Зл анти-PE микробусов. Вихрь трубки и инкубировать при 4 кв КС в течение 15 мин. Вымойте клетки, добавив 10 мл сортировки буфера в трубки, тщательно перемешать, а затем центрифуги их на 300 х г в течение 10 минут на RT. Призадыхать супернатант и resuspend гранулы в 500 л сортировки буфера. Поместите столбец, содержащий суперпарамагнитные сферы, в магнитный сепаратор и промыть столбец 3 мл сортирующего буфера. После того, как колонна “остановка потока”, пипетка 500 л ячеек подвески в колонны, а затем мыть колонны с сортировочным буфером. Повторите мыть 3x, каждый с 3 мл сортировки буфера(рисунок 2G). Снимите столбцы с сепаратора и поместите их поверх новой трубки коллекции 15 мл. С помощью пипетки добавьте 5 мл среды EC к столбику и продвиайте решение с помощью колонны. Centrifuge коллекции труб на 300 х г в течение 10 минут на RT, а затем аспирации супернатанта. Извлеките РНК из клеточных гранул образцов ЕЭК и ЦИК с помощью комплекта, следуя инструкциям производителя. Минимум 500 нг РНК могут быть получены.ПРИМЕЧАНИЕ: После извлечения РНК образец может храниться при -80 градусов по Цельсию. Обратный транскриб 500 нг РНК, чтобы получить cDNA с помощью случайного грунтовки и комплект, следуя инструкциям производителя. Выполните количественные ПЦР для проверки эндокардиальных и эндотелиальных популяций(рисунок 2H). Последовательность праймерперечислений указана в таблице 2. Добавьте 5 кДНК ЕЭК или CEC (1 нг/Л) в скважины пластины 384 qPCR. Добавьте кДНК ЕЭК или ЦИК в достаточное количество скважин, чтобы было три скважины на количество грунтовок. Смешайте 6 qL 2x qPCR SYBR зеленый буфер с 0,5 л из каждого 10 км грунтовки, в том числе как вперед, так и обратной грунтовки, и добавить их в один хорошо соответствующие каждому кандидату гена. Запечатать пластину с пластиковой пленкой и центрифуги в течение 1 мин при 300 х г на RT. Поместите пластину в машину qPCR, а затем запустите программу при 95 градусах по Цельсию в течение 3 мин, затем 95 градусов по Цельсию в течение 15 с, а затем 55 градусов по Цельсию в течение 60 с. Повторите последующие два шага в течение 45 циклов.