Isolamento das Células Endocárdicas e Coronárias da Parede Livre Ventricular do Coração de Rato

Todos os procedimentos de animais foram aprovados pelo Painel Administrativo de Cuidados Com Animais Laboratoriais (APLAC31608) da Universidade de Stanford. 1. Preparação de buffers Prepare o buffer de digestão usando os reagentes listados na Tabela 1. Prepare a solução de estoque de DNase I: Dissolva o DNase I em água sem RNase para uma solução de estoque de 2.000 unidades/mL (1 mg/mL). Alíquota e armazene a solução de estoque a -20 °C. Prepare a solução liberase: Dissolva a liberação com água livre de RNase para uma solução de estoque de 5 mg/mL. Gire-o em um banco de rolos a 4 °C por 30 min. Alíquota e armazene a solução de estoque a -20 °C. Prepare o tampão de classificação diluindo 0,5 M de ácido etilenodiaminetetraacético (EDTA) e 10% de solução de albumina de soro bovino (BSA) com 1x de solução de solução de soro tampão fosfato (PBS) para uma concentração final de 2 mM de EDTA e 0,5% de BSA. 2. Coleção de coração NOTA: Seis ratos Sprague Dawley pesando 50-100 g foram usados neste protocolo. Não foi observada diferença de gênero. Eutanize o rato com CO2 e coloque-o em uma posição supina em uma plataforma de dissecação. Fixar as extremidades para baixo e esterilizar o abdômen e o peito com 70% de etanol. Abra o abdômen com uma tesoura e insira uma agulha de 21 G na porção da veia cava posterior localizada atrás do intestino. Puxe o êmbolo de seringa para trás, retirando o sangue da veia até que o fígado pareça mais leve e não possa retirar mais sangue, indicando remoção de sangue suficiente. Com uma tesoura, abra o peito cuidadosamente para evitar danificar o pulmão e o coração. Levante o arco/átrio de aorta com os fórceps e corte a aorta, artéria pulmonar, veias pulmonares e veia cava para liberar e remover o coração. Lave o coração com 50 mL de solução de sal balanceada de 1x de Hanks (HBSS) tampão 3x para remover o sangue excessivo. Sob um microscópio de microdissecção, remova a parede livre ventricular direita em um tubo de 5 mL contendo o meio águia modificado de Dulbecco (DMEM) (Figura 1A,B). Coloque o coração em seu rosto liso e posterior para identificar o lado esquerdo e direito. Localize a artéria pulmonar, a mais anterior das veias e artérias que se ramificam do topo do coração e corte a artéria pulmonar até a câmara ventricular direita. Na face anterior do coração, corte ao longo do septo até atingir o ápice. Continue cortando do ápice até o lado posterior do coração ao longo do septo até a artéria pulmonar e o ponto de junção da câmara ventricular direita(Figura 1A). A partir da artéria pulmonar e do ponto de junção ventricular direito, corte o lado anterior e posterior do coração perpendicularmente à dissecção anterior e longe do septo, até que a parede livre ventricular direita seja liberada do resto do coração(Figura 1B). Sob o microscópio de microdissecção, remova a parede livre ventricular esquerda em um tubo de 5 mL contendo DMEM (Figura 1C,D). Localize a aorta, ramificando-se do topo do coração atrás da artéria pulmonar, e repita o método descrito na etapa 2.5 para cortar a parede livre ventricular esquerda. 3. Digestão CEI Coloque os tecidos de parede livre ventricular direito e esquerdo em um prato de cultura de 60 cm com a superfície interna deitada plana, voltada para baixo(Figura 2).NOTA: A superfície interna é a face interna do ventrículo em forma de côncavo, conforme mostrado na Figura 2A,C. Adicione 0,5-1 mL de tampão de digestão ao prato, colocando a ponta da pipeta diretamente sob o tecido. Continue até que apenas a superfície interna esteja imersa. Incubar o prato em uma incubadora de 5% de CO2, 37 °C por 5 min. Adicione o meio EC ao prato de cultura para parar a digestão.NOTA: Mantenha a quantidade de tampão de digestão no meio CE como uma razão 1:5. Use uma pipeta de 1 mL para lavar a superfície interna dos ventrículos com o meio EC e transferir o escoamento para um tubo de coleta de 50 mL através de um coador de 40 mm(Figura 2E). Mantenha as coleções no gelo para purificação a jusante. 4. Digestão cec Corte ao longo da superfície externa do ventrículo esquerdo sem contaminação da camada interna(Figura 2B,D) e coloque cada um em um tubo separado de 5 mL contendo 1 mL do tampão de digestão.NOTA: O ventrículo esquerdo pode ser identificado como o ventrículo mais espesso, e a superfície externa pode ser determinada como a face exterior do ventrículo ligeiramente côncavo. Usando uma tesoura de dissecção, pique a parede ventricular em pequenas, 1 mm3 pedaços. Incubar o tubo em um banho de água de 37 °C por cerca de 15-20 min. Vórtice a cada 2-3 min. Pipeta 4 mL de meio Ce no tubo de 5 mL para terminar a digestão. Transfira a solução com uma pipeta sorológica de 5 mL para um tubo de 50 mL através de um coador de 40 mm(Figura 2E). Mantenha as coleções no gelo para purificação a jusante. 5. Coleta de células Centrifugar os tubos a 300 x g por 10 min à temperatura ambiente (RT) e, em seguida, aspirar o sobrenadante. Se a pelota aparecer vermelha, resuspenda a pelota em 1-2 mL de 1x tampão de lontoa de glóbulos vermelhos (RBC)(Figura 2F).NOTA: Se não houver RBCs, prossiga para a etapa 6. Incubar os tubos em um banho de água de 37 °C por 5 min. Pipeta de 10 mL de PBS nos tubos de 50 mL para parar a lésia. Centrifugar os tubos a 300 x g por 10 min em RT, e depois aspirar o sobrenadante. 6. Classificação CE Adicione 90 μL de tampão de classificação e 10 μL de anticorpo anti-CD31 PE nos tubos de 50 mL. Vórtice os tubos e, em seguida, incuba-los por 10 min em uma geladeira de 4 °C. Adicione 10 mL de tampão de classificação nos tubos, misture completamente e, em seguida, centrífuga a 300 x g por 10 min em RT. Apiratee o sobrenadante e resuspenda a pelota em 80 μL de tampão de classificação e 20 μL de microesferas anti-PE. Vórtice os tubos e incubar a 4 °C por 15 min. Lave as células adicionando 10 mL de tampão de classificação nos tubos, misture-as completamente e, em seguida, centrifuga-as a 300 x g por 10 min no RT. Apiratee o sobrenadante e resuspenda a pelota em 500 μL de tampão de classificação. Coloque uma coluna contendo esferas superparamagnéticas em um separador magnético e enxágue a coluna com 3 mL de tampão de classificação. Depois que a coluna for “pare de fluxo”, pipeta 500 μL da suspensão celular nas colunas e, em seguida, lavar as colunas com tampão de classificação. Repita a lavagem 3x, cada uma com 3 mL de tampão de classificação(Figura 2G). Remova as colunas do separador e coloque-as em cima de um novo tubo de coleta de 15 mL. Com uma pipeta, adicione 5 mL de meio CE às colunas e impulsione a solução usando um êmbolo de coluna. Centrifugar os tubos de coleta a 300 x g por 10 min em RT e, em seguida, aspirar o sobrenadante. Extrair o RNA da pelota celular das amostras CEE e CEC utilizando um kit, seguindo as instruções do fabricante. Um mínimo de 500 ng de RNA pode ser obtido.NOTA: Após a extração do RNA, a amostra pode ser armazenada a -80 °C. Transcreva inversamente 500 ng de RNA para obter cDNA usando um primer aleatório e um kit, seguindo as instruções do fabricante. Realizar pcr quantitativo para validação de populações endocárdicas e endoteliais (Figura 2H). As seqüências do primer estão listadas na Tabela 2. Adicione 5 μL de CEE ou CEC cDNA (1 ng/μL) nos poços de uma placa de 384 qPCR. Adicione o cedeao ou cec cDNA em poços suficientes para que haja três poços por número de primers. Misture 6 μL de tampão verde 2x qPCR SYBR com 0,5 μL de cada primer de 10 μM, incluindo primers dianteiros e reversos, e adicione-os em um único poço correspondente a cada gene candidato. Sele a placa com filme plástico e centrífuga por 1 min a 300 x g no RT. Coloque a placa em uma máquina qPCR e, em seguida, inicie o programa a 95 °C por 3 min, seguido por 95 °C para 15 s e, em seguida, 55 °C para 60 s. Repita os dois passos subseqüentes para 45 ciclos.