Isolamento delle cellule endocartali e coronarie dal muro libero ventricolare del cuore di ratto

Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dal gruppo amministrativo sulla cura degli animali da laboratorio (APLAC31608) presso la Stanford University. 1. Preparazione dei buffer Preparare il buffer di digestione utilizzando i reagenti elencati nella Tabella 1. Preparare la soluzione stock DNase I: Dissolvere DNase I in acqua senza RNase per una soluzione di stock di 2.000 unità/mL (1 mg/mL). Aliquota e conservare la soluzione di stock a -20 gradi centigradi. Preparare la soluzione libera: Sciogliere la liberazione con acqua senza RNase per una soluzione stock di 5 mg/mL. Ruotarlo su una banchia a rulli a 4 gradi centigradi per 30 min. Aliquot e conservare la soluzione di riserva a -20 gradi centigradi. Preparare il buffer di ordinamento diluindo 0,5 M di acido etilenediaminetracetraacetica (EDTA) e 10% di serie di albumina di siero bovino (BSA) con 1x fosfato buffertans (PBS) per una concentrazione finale di 2 mM di EDTA e 0,5% di BSA. 2. Collezione Cuore NOTA: in questo protocollo sono stati utilizzati sei ratti Sprague Dawley del peso di 50-100 g. Nessuna differenza di genere è stata osservata. Eutanasia il ratto con CO2 e lo mette in posizione supina su una piattaforma di dissezione. Pin le estremità verso il basso e sterilizzare sia l’addome e il torace con 70% etanolo. Aprire l’addome con le forbici e inserire un ago da 21 G nella porzione della vena cava posteriore situata dietro l’intestino. Tirare indietro lo stantuffo della siringa, ritirando il sangue dalla vena fino a quando il fegato appare di colore più chiaro e non può essere ritirato più sangue, indicando una sufficiente rimozione del sangue. Usando le forbici, aprire il torace con attenzione per evitare di danneggiare il polmone e il cuore. Sollevare l’arco/atrio dell’aorta con le pinze e tagliare l’aorta, l’arteria polmonare, le vene polmonari e la vena cava per liberare e rimuovere il cuore. Lavare il cuore con 50 mL di soluzione di sale bilanciato (HBSS) fredda (HBSS) per rimuovere il sangue eccessivo. Al microscopio a microdisezione, rimuovere la parete libera ventricolare destra in un tubo da 5 mL contenente il mezzo Aquila modificato (DMEM) di Dulbecco (Figura 1A,B). Posare il cuore sul suo volto più piatto e posteriore per identificare il lato sinistro e destro. Individuare l’arteria polmonare, la più anteriore delle vene e delle arterie che si ramificano dalla parte superiore del cuore e tagliano l’arteria polmonare fino alla camera ventricolare destra. Sulla faccia anteriore del cuore, tagliare lungo il setto fino a raggiungere l’apice. Continuare a tagliare dall’apice il lato posteriore del cuore lungo il setto fino all’arteria polmonare e al punto di giunzione della camera ventricolare destra (Figura 1A). Partendo dall’arteria polmonare e dal punto di giunzione ventricolare destro, tagliare sia il lato anteriore che il lato posteriore del cuore perpendicolarmente alla dissezione precedente e lontano dal setto, fino a quando la parete libera ventricolare destra non viene liberata dal resto del cuore (Figura 1B). Al microscopio a microdisezione, rimuovere la parete libera ventricolare sinistra in un tubo da 5 mL contenente DMEM (Figura 1C,D). Individuare l’aorta, ramificandosi dalla parte superiore del cuore dietro l’arteria polmonare, e ripetere il metodo descritto nel passaggio 2.5 per tagliare la parete libera ventricolare sinistra. 3. Digestione CEE Posizionare i tessuti a parete libera ventricolare destro e sinistro in un piatto di coltura di 60 cm con la superficie interna distesa piatta, rivolta verso il basso (Figura 2).NOTA: La superficie interna è la faccia interna del ventricolo leggermente concavo a forma di, come illustrato nella Figura 2A,C. Aggiungere 0,5-1 mL di tampone di digestione al piatto, ponendo la punta della pipetta direttamente sotto il tessuto. Continuare fino a quando solo la superficie interna è immersa. Incubare il piatto in un 5% di CO2, 37 gradi centigradi incubatrice per 5 min. Aggiungere il mezzo EC al piatto di coltura per fermare la digestione.NOTA: mantenere la quantità di buffer di digestione a medio EC come rapporto 1:5. Utilizzare una pipetta da 1 mL per lavare la superficie interna dei ventricoli con il mezzo EC e trasferire il deflusso in un tubo di raccolta da 50 mL attraverso un strainer da 40 mm (Figura 2E). Mantenere le collezioni sul ghiaccio per la purificazione a valle. 4. Digestione CEC Tagliare lungo la superficie esterna del ventricolo sinistro senza contaminazione dallo strato interno (Figura 2B,D) e posizionare ciascuno in un tubo da 5 mL separato contenente 1 mL del tampone di digestione.NOTA: Il ventricolo sinistro può essere identificato come il ventricolo più spesso e la superficie esterna può essere determinata come la faccia esterna del ventricolo leggermente concavo. Utilizzando le forbici a dissezione, sminuisci la parete ventricolare in piccoli pezzi di 1 mm3. Incubare il tubo in un bagno d’acqua di 37 gradi centigradi per circa 15-20 min. Pipetta 4 mL di EC medio nel tubo 5 mL per terminare la digestione. Trasferire la soluzione con una pipetta sierologica da 5 mL in un tubo da 50 mL attraverso un colino da 40 mm (Figura 2E). Mantenere le collezioni sul ghiaccio per la purificazione a valle. 5. Raccolta di celle Centrifugare i tubi a 300 x g per 10 min a temperatura ambiente (RT) e poi aspirare il super-natante. Se il pellet appare rosso, sospendere il pellet in 1-2 mL di 1x buffer di liscivia dei globuli rossi (RBC) (Figura 2F).NOTA: se non sono presenti RBC, procedere al passaggio 6. Incubare i tubi in un bagno d’acqua a 37 gradi centigradi per 5 min. Pipette 10 mL di PBS nei tubi da 50 mL per fermare la lisi. Centrifugare i tubi a 300 x g per 10 min a RT, e poi aspirare il supernatante. 6. Ordinamento CE Aggiungete 90 l di tampone di smistamento e 10- L di anticorpi anti-CD31 PE nei tubi da 50 mL. Vorticare i tubi e poi incubarli per 10 min in un frigorifero di 4 gradi centigradi. Aggiungere 10 mL di smistamento tampone nei tubi, mescolare accuratamente, quindi centrifugare a 300 x g per 10 min a RT. Aspirare il supernatante e risospendere il pellet in 80 litri di tampone di smistamento e 20 -L di microsfere anti-PE. Vorticare i tubi e incubare a 4 gradi centigradi per 15 min. Lavare le cellule aggiungendo 10 mL di smistamento tampone nei tubi, mescolare accuratamente, e quindi centrificarli a 300 x g per 10 min a RT. Aspirare il supernatante e sospendere il pellet in 500 – L di buffer di smistamento. Posizionare una colonna contenente sfere superparamagnetiche in un separatore magnetico e risciacquare la colonna con 3 mL di buffer di ordinamento. Dopo che la colonna è “flow stop”, pipetta 500 -L della sospensione cellulare nelle colonne e quindi lavare le colonne con buffer di ordinamento. Ripetere il lavaggio 3x, ciascuno con 3 mL di buffer di ordinamento (Figura 2G). Rimuovere le colonne dal separatore e posizionarle sopra un nuovo tubo di raccolta da 15 mL. Con una pipetta, aggiungere 5 mL di mezzo EC alle colonne e spingere la soluzione attraverso l’utilizzo di uno stantuffo di colonna. Centrifugare i tubi di raccolta a 300 x g per 10 min a RT e poi aspirare il supernatante. Estrarre l’RNA dal pellet cellulare della CEE e cec utilizzando un kit, seguendo le istruzioni del produttore. Si può ottenere un minimo di 500 ng di RNA.NOTA: Dopo l’estrazione dell’RNA, il campione può essere conservato a -80 gradi centigradi. Trascrivere inverso 500 ng di RNA per ottenere cDNA utilizzando un primer casuale e un kit, seguendo le istruzioni del produttore. Eseguire la PCR quantitativa per la convalida delle popolazioni endocardiali ed endoteliali (Figura 2H). Le sequenze di Primer sono elencate nella tabella 2. Aggiungete 5 -L di EEC o CEC cDNA (1 ng/L) nei pozze di una piastra da 384 qPCR. Aggiungere il cDNA CeE o CEC in abbastanza pozzi in modo che ci siano tre pozzi per numero di primer. Mescolare 6 l di 2x qPCR SYBR buffer verde con 0,5 l di ogni primer da 10 M, inclusi i primer avanti e indietro, e aggiungerli in un unico pozzo corrispondente a ciascun gene candidato. Sigillare la piastra con pellicola plastica e centrifugare per 1 min a 300 x g a RT. Mettete la piastra in una macchina qPCR e poi avviate il programma a 95 gradi centigradi per 3 min, seguite da 95 gradi centigradi per 15 s, quindi 55 gradi centigradi per 60 s. Ripetete i due passaggi successivi per 45 cicli.