בידוד של תאי כלילית ותאים כליליים מהקיר החופשי של לב החולדה

כל ההליכים בעלי חיים אושרו על ידי פאנל מינהלי על טיפול בעלי חיים מעבדה (APLAC31608) באוניברסיטת סטנפורד. 1. הכנת מאגרים הכן את מאגר העיכול באמצעות הריאגנטים הרשום בטבלה 1. הכן את פתרון המניה DNase I: התמוססות DNase I ב-RNase-מים ללא תשלום עבור פתרון מניות של 2,000 יחידות/mL (1 מ”ג/mL). הורדה ואחסון של פתרון המניה ב-20 ° c. להכין את הפתרון ליבראז: לפזר liberase עם RNase-מים חינם עבור פתרון מניות של 5 מ”ג/mL. סובב אותו על הגדה הרים ב 4 ° c עבור 30 דקות. לאחסן את הפתרון מניות ב-20 ° c. הכן את מאגר המיון על ידי דילול 0.5 M ethylenediammiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiis חומצה (EDTA) ו 10% בסרום של שור (BSA) פתרון מניות עם מלוחים 1x פוספט באגירה (PBS) עבור ריכוז סופי 0.5 של 2. אוסף לב הערה: שישה חולדות של מג במשקל 50-100 גרם שימשו בפרוטוקול זה. שום הבדל מגדרי לא נצפתה. המתת החסד עם CO2 ומניחים אותו בעמדה פרקדן על פלטפורמת מבתר. להצמיד את הגפיים למטה לחטא הן את הבטן ואת החזה עם 70% אתנול. פתח את הבטן עם מספריים והכנס מחט G 21 לתוך החלק של קאווה המטה האחורי ממוקם מאחורי המעיים. משוך את המזרק בחזרה, לנתק את הדם מן הווריד עד הכבד נראה קל יותר בצבע ולא יותר דם יכול להיות מסוגר, המציין הסרת דם מספיק. באמצעות מספריים, לפתוח את החזה בזהירות כדי למנוע נזק לריאות וללב. הרם את קשת העורקים/אטריום עם מלקחיים ולחתוך את העורקים, עורק הריאות, ורידים ריאתי, ולבנה קאווה כדי לשחרר ולהסיר את הלב. לשטוף את הלב עם 50 mL של קר 1x הנקס מאוזנת תמיסת מלח (HBSS) מאגר 3x כדי להסיר דם מוגזם. תחת מיקרוסקופ מיקרודיסקציה, הסר את הקיר הימני של החומה החופשית לצינור של 5 מ ל המכיל את מדיום הנשר השונה של Dulbecco (DMEM) (איור 1A,B). הניחו את הלב על פניה האחוריים והפנים כדי לזהות את הצד השמאלי והימני. אתר את עורק הריאות, החלק הקדמי ביותר של הוורידים והעורקים הסתעפות מן החלק העליון של הלב לחתוך דרך עורק הריאתי מטה אל החדר הימני הנכון. על הפנים הקדמיות של הלב, חותכים לאורך המחיצה עד שהגיעו לפיסגה. המשך לחתוך מהפיסגה במעלה הצד האחורי של הלב לאורך המחיצה עד לעורק הריאתי ולנקודת המפגש הימני התאי (איור 1A). החל מעורק הריאתי ומנקודת הצומת הימנית, חותכים הן את הצד הקדמי והן האחורי של הלב הניצב לניתוח הקודם והרחק ממחיצת המחיצה, עד שהקיר הימני השמאלי משוחרר משאר הלב (איור 1B). תחת מיקרוסקופ מיקרודיסקציה, להסיר את הקיר השמאלי חדרית חינם לתוך צינור 5 מ ל המכיל DMEM (איור 1C,D). אתר את העורקים, הסתעפות מן החלק העליון של הלב מאחורי העורק הריאתי, ולחזור על השיטה המתוארת בשלב 2.5 לחתוך את הקיר השמאלי חדרית חינם. 3. העיכול EEC מניחים את שתי הרקמה הימנית והשמאלית של רקמות הקיר בצלחת התרבות 60 ס מ עם המשטח הפנימי השוכב בדירה, פונה כלפי מטה (איור 2).הערה: המשטח הפנימי הוא הפנים הפנים של החדר מעוצב מעט בצורת כמוצג באיור 2A,C. הוסיפו 0.5 – 1 מ ל של מאגר העיכול למנה, הצבת קצה הפיפטה ישירות מתחת לרקמה. המשך עד שרק המשטח הפנימי יהיה שקוע. מודחת הצלחת ב 5% CO2, 37 מעלות בחממה של ° c עבור 5 דקות. הוסף EC בינוני לצלחת התרבות כדי לעצור את העיכול.הערה: שמור את כמות מאגר העיכול ל-EC בינונית כיחס 1:5. השתמש בפיפטה 1 מ ל כדי לרוקן את המשטח הפנימי של החדרים עם EC בינוני ולהעביר את הנגר לתוך שפופרת אוסף 50 mL דרך מסננת 40 מ”מ (איור 2E). שמור את הקולקציות על קרח. בשביל טיהור במורד הזרם 4. העיכול ו-CEC חותכים לאורך המשטח החיצוני של החדר השמאלי ללא זיהום מהשכבה הפנימית (איור 2B,D) ומניחים כל אחד בצינור 5 מ ל נפרד המכיל 1 מ ל של מאגר העיכול.הערה: החדר השמאלי ניתן לזהות כמו החדר העבה יותר, ואת המשטח החיצוני ניתן לקבוע כפנים החיצוני של החלל הקמור מעט. באמצעות מספריים לחיתוך, האוהב את הקיר חדרית לתוך קטן, 1 מ”מ3 חתיכות. מודיית את הצינור באמבט 37 מעלות צלזיוס עבור כ 15 – 20 דקות. מערבולת כל 2 – 3 דקות. פיפטה 4 מ ל של EC בינוני לתוך צינור 5 מ ל כדי לסיים את העיכול. העבר את הפתרון עם צינורות 5 מ ל לתוך צינור 50 mL באמצעות מסננת 40 מ”מ (איור 2E). שמור את הקולקציות על קרח. בשביל טיהור במורד הזרם 5. אוסף תאים צנטריפוגה את הצינורות ב 300 x g עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT) ולאחר מכן מביסה את supernatant. אם הגלולה מופיעה אדומה, השהה מחדש את הגלולה ב-1 – 2 מ ל של 1 x תא דם אדום (RBC) מאגר ליסינג (איור 2F).הערה: אם אין RBCs, המשך לשלב 6. מודטה את הצינורות באמבט מים 37 ° c עבור 5 דקות. פיפטה 10 מ ל של PBS לתוך צינורות 50 mL להפסיק את הליזה. צנטריפוגה את הצינורות ב 300 x g עבור 10 דקות ב-RT, ולאחר מכן לבשל את הסופרנטאנט. 6. EC מיון הוסף 90 μL של מאגר מיון ו 10 μL של נוגדן anti-CD31 PE לתוך שפופרות 50 mL. מערבולת את הצינורות ולאחר מכן מודטים אותם 10 דקות במקרר 4 ° c. הוסף 10 מ ל של מאגר מיון לתוך הצינורות, לערבב ביסודיות, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 300 x g עבור 10 דקות ב-RT. מרפה את הסופרנטאנט ומשהה מחדש את הגלולה ב-80 μL של מאגר מיון ו -20 μL של מיקרוחרוזי אנטי-PE. מערבולת את הצינורות ואת הדגירה ב 4 ° c עבור 15 דקות. לשטוף את התאים על ידי הוספת 10 מ ל של מאגר מיון לתוך הצינורות, לערבב ביסודיות, ולאחר מכן צנטריפוגה אותם ב 300 x g עבור 10 דקות ב RT. ולהשעות את הגלולה ב-500 μL. של מאגר מיון מקם עמודה המכילה כדורים על-חושיים למפריד מגנטי ושטוף את העמודה עם 3 מ ל של מאגר מיון. לאחר העמודה הם “לעצור זרימה”, פיפטה 500 μL של התא הבולם לתוך העמודות ולאחר מכן לשטוף את העמודות עם מאגר מיון. חזור על כביסה 3x, כל אחד עם 3 מ ל של מאגר מיון (איור 2G). הסר את העמודות מהמפריד והוצא אותן מעל צינור אוסף של 15 מ ל חדש. עם פיפטה, יש להוסיף 5 מ ל של EC בינוני לעמודות, ולהניע את הפתרון באמצעות בוכנה עמודה. צנטריפוגה את צינורות האוסף ב 300 x g עבור 10 דקות בשעה RT ולאחר מכן מרוב את הסופרנטאנט. לחלץ את RNA מן הגלולה התא של הדגימות EEC ו-CEC באמצעות ערכה, בעקבות הוראות היצרן. מינימום של 500 ng של RNA ניתן להשיג.הערה: לאחר חילוץ RNA, המדגם יכול להיות מאוחסן ב-80 ° c. הפוך תעתור 500 ng של RNA כדי לקבל cDNA באמצעות פריימר אקראי ערכת, בעקבות הוראות היצרן. לבצע PCR כמותי לאימות של אוכלוסיות אנדותל ושלל (איור 2H). רצפים פריימר מפורטים בטבלה 2. הוסף 5 μL של EEC או CEC cDNA (1 ng/μL) לתוך הבארות של 384 qPCR לוחית. הוסף את EEC או CEC cDNA לתוך מספיק בארות כך שיש שלוש בארות למספר התחל. מערבבים 6 μL של מאגר הירוק 2x qPCR SYBR עם 0.5 μL של כל 10 μM פריימר, כולל התחל והפוך, ולהוסיף אותם לאחד היטב מתאים לכל גן מועמד. חותם את הצלחת עם הסרט פלסטיק וצנטריפוגה עבור 1 דקות ב 300 x g ב RT. מניחים את הצלחת לתוך מכונת qPCR ולאחר מכן להתחיל את התוכנית ב 95 ° c עבור 3 דקות, ואחריו 95 ° צ’ עבור 15 s, ולאחר מכן 55 ° צ’ עבור 60 s. חזור על שני השלבים הבאים עבור מחזורי 45.