Isolierung von Endokardialen und koronaren Endothelzellen aus der ventrikulären freien Wand des Rattenherzes

Alle tierischen Verfahren wurden vom Administrative Panel on Laboratory Animal Care (APLAC31608) der Stanford University genehmigt. 1. Vorbereitung von Puffern Bereiten Sie den Verdauungspuffer mit den in Tabelle 1aufgeführten Reagenzien vor. Bereiten Sie die DNase I Lagerlösung vor: Lösen Sie DNase I in RNase-freiem Wasser für eine Stammlösung von 2.000 Einheiten/ml (1 mg/ml). Aliquot und lagern Sie die Lagerlösung bei -20 °C. Bereiten Sie die Liberase-Lösung vor: Lösen Sie Liberase mit RNase-freiem Wasser für eine Stammlösung von 5 mg/ml. Drehen Sie es auf einer Rollenbank bei 4 °C für 30 min. Aliquot und lagern Sie die Lagerlösung bei -20 °C. Bereiten Sie den Sortierpuffer vor, indem Sie 0,5 M Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und 10% Rinderserumalbumin (BSA) Stammlösung mit 1x Phosphat gepufferter Kochsaline (PBS) für eine Endkonzentration von 2 mM EDTA und 0,5% BSA verdünnen. 2. Herz-Sammlung HINWEIS: In diesem Protokoll wurden sechs Sprague Dawley-Ratten mit einem Gewicht von 50–100 g verwendet. Es wurde kein Geschlechtsunterschied beobachtet. Euthanisieren Sie die Ratte mit CO2 und platzieren Sie sie in einer Supine-Position auf einer Sezierender Plattform. Pin die Extremitäten nach unten und sterilisieren sowohl den Bauch und Brust mit 70% Ethanol. Öffnen Sie den Bauch mit einer Schere und legen Sie eine 21 G Nadel in den Teil der hinteren Vena cava hinter dem Darm. Ziehen Sie den Spritzenkolben zurück, ziehen Sie das Blut aus der Vene, bis die Leber heller in der Farbe erscheint und kein Blut mehr entnommen werden kann, was auf eine ausreichende Blutentnahme hindeutet. Öffnen Sie die Brust mit einer Schere vorsichtig, um eine Schädigung der Lunge und des Herzens zu vermeiden. Heben Sie den Aortabogen/Atrium mit der Zange an und schneiden Sie die Aorta, die Lungenarterie, die Lungenvenen und die Venenhöhle, um das Herz zu befreien und zu entfernen. Waschen Sie das Herz mit 50 ml kaltem 1x Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) Puffer 3x, um übermäßiges Blut zu entfernen. Entfernen Sie unter einem Mikrodissektionsmikroskop die rechte ventrikuläre freie Wand in ein 5 ml-Rohr, das das modifizierte Eagle-Medium (DMEM) von Dulbecco enthält (Abbildung 1A,B). Legen Sie das Herz auf sein flacheres, hinteres Gesicht, um die linke und rechte Seite zu identifizieren. Finden Sie die Lungenarterie, die vordere der Venen und Arterien, die von der Oberseite des Herzens verzweigen und durch die Lungenarterie bis zur rechten ventrikulären Kammer schneiden. Auf dem vorderen Gesicht des Herzens, entlang des Septums schneiden, bis die Spitze zu erreichen. Schneiden Sie weiter von der Spitze die hintere Seite des Herzens entlang des Septums bis zur Lungenarterie und dem rechten ventrikulären Kammerknotenpunkt (Abbildung 1A). Ausgehend von der Lungenarterie und dem rechtsventrikulären Knotenpunkt, schneiden Sie sowohl die vordere als auch die hintere Seite des Herzens senkrecht zur vorherigen Zerlegung und weg vom Septum, bis die rechtsventrikuläre freie Wand vom Rest des Herzens befreit wird (Abbildung 1B). Entfernen Sie unter dem Mikrodissektionsmikroskop die linksventrikuläre freie Wand in ein 5 ml-Rohr mit DMEM (Abbildung 1C,D). Suchen Sie die Aorta, die von der Spitze des Herzens hinter der Lungenarterie verzweigt ist, und wiederholen Sie die in Schritt 2.5 beschriebene Methode, um die linksventrikuläre freie Wand abzuschneiden. 3. EWG-Verdauung Legen Sie sowohl rechts als auch linksventrikuläres freies Wandgewebe in eine 60 cm große Kulturschale, wobei die innere Oberfläche flach liegt (Abbildung 2).HINWEIS: Die Innenfläche ist die Innenfläche des leicht konkav geformten Ventrikels, wie in Abbildung 2A,Cdargestellt. Fügen Sie 0,5-1 ml Verdauungspuffer in die Schale, die Spitze der Pipette direkt unter das Gewebe. Fahren Sie fort, bis nur die innere Oberfläche eingetaucht ist. Inkubieren Sie die Schale in einem 5%CO2,37 °C Inkubator für 5 min. Fügen Sie ec Medium zum Kulturgericht hinzu, um die Verdauung zu stoppen.HINWEIS: Bewahren Sie die Menge des Verdauungspuffers auf EC-Medium als 1:5-Verhältnis auf. Verwenden Sie eine 1 ml Pipette, um die Innenfläche der Ventrikel mit EC-Medium zu spülen und den Abfluss durch ein 40-mm-Sieb in ein 50 ml-Sammelrohr zu übertragen (Abbildung 2E). Halten Sie die Sammlungen zur nachgelagerten Reinigung auf Eis. 4. CEC-Verdauung Schneiden Sie entlang der Außenfläche des linken Ventrikels ohne Kontamination von der inneren Schicht (Abbildung 2B,D) und legen Sie sie jeweils in ein separates 5 ml-Rohr, das 1 ml des Verdauungspuffers enthält.HINWEIS: Der linke Ventrikel kann als dickerer Ventrikel identifiziert werden, und die Außenfläche kann als Außenfläche des leicht konkaven Ventrikels bestimmt werden. Mit der Sezierschere die ventrikuläre Wand in kleine, 1 mm3 Stück zerkleinern. Inkubieren Sie das Rohr in einem 37 °C Wasserbad für ca. 15–20 min. Vortex alle 2–3 min. Pipette 4 ml EC-Medium in das 5 ml Rohr, um die Verdauung zu beenden. Übertragen Sie die Lösung mit einer 5 ml serologischen Pipette in ein 50 ml Rohr durch ein 40 mm Sieb (Abbildung 2E). Halten Sie die Sammlungen zur nachgelagerten Reinigung auf Eis. 5. Zellsammlung Zentrifugieren Sie die Rohre bei 300 x g für 10 min bei Raumtemperatur (RT) und aspirieren Sie dann den Überstand. Wenn das Pellet rot erscheint, setzen Sie das Pellet in 1–2 ml des 1x roten Blutkörperchens (RBC) Lysingpuffer san (Abbildung 2F).HINWEIS: Wenn keine RBCs vorhanden sind, fahren Sie mit Schritt 6 fort. Inkubieren Sie die Rohre in einem 37 °C Wasserbad für 5 min. Pipette 10 ml PBS in die 50 ml Rohre, um die Lyse zu stoppen. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 300 x g für 10 min bei RT, und saugen Sie dann den Überstand an. 6. EG-Sortierung Fügen Sie den 50 ml-Rohren 90 L Sortierpuffer und 10 l Anti-CD31 PE-Antikörper hinzu. Die Rohre vortexen und dann 10 min in einem 4 °C-Kühlschrank bebrüten. 10 ml Sortierpuffer in die Rohre geben, gründlich mischen und dann bei 300 x g 10 min bei RT zentrieren. Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 80 l Sortierpuffer und 20 l Anti-PE-Mikroperlen wieder auf. Wirbeln Sie die Rohre und inkubieren bei 4 °C für 15 min. Waschen Sie die Zellen, indem Sie 10 ml Sortierpuffer in die Rohre geben, gründlich mischen und zentrieren Sie sie dann bei 300 x g für 10 min bei RT. Den Überstand ansaugen und das Pellet in 500 l Sortierpuffer wieder aufhängen. Legen Sie eine Säule mit superparamagnetischen Kugeln in einen magnetischen Separator und spülen Sie die Säule mit 3 ml Sortierpuffer. Nachdem die Spalte “Flow Stop” sind, Pipette 500 l der Zellsuspension in die Spalten und dann waschen Sie die Spalten mit Sortierpuffer. Wiederholen Sie die Wäsche 3x mit jeweils 3 ml Sortierpuffer (Abbildung 2G). Entfernen Sie die Spalten aus dem Trennzeichen, und legen Sie sie auf ein neues 15 ml-Sammelrohr. Mit einer Pipette 5 ml EC-Medium zu den Säulen hinzufügen und die Lösung durch die Verwendung eines Säulenkolbens antreiben. Zentrifugieren Sie die Sammelrohre bei 300 x g für 10 min bei RT und saugen Sie dann den Überstand an. Extrahieren Sie die RNA aus dem Zellpellet der EWG- und CEC-Proben mit einem Kit, das den Anweisungen des Herstellers folgt. Es können mindestens 500 ng RNA erhalten werden.HINWEIS: Nach der RNA-Extraktion kann die Probe bei -80 °C gelagert werden. Reverse transkribieren 500 ng RNA, um cDNA mit einem zufälligen Primer und einem Kit zu erhalten, nach den Anweisungen des Herstellers. Durchführung quantitativer PCR zur Validierung von Endokard- und Endothelpopulationen (Abbildung 2H). Primersequenzen sind in Tabelle 2aufgeführt. Fügen Sie 5 L EWG- oder CEC-cDNA (1 ng/L) in die Bohrungen einer 384 qPCR-Platte ein. Fügen Sie die EWG- oder CEC-cDNA in genügend Brunnen ein, so dass es drei Bohrungen pro Anzahl von Primern gibt. Mischen Sie 6 l des 2x qPCR SYBR-Grünpuffers mit 0,5 l pro 10-M-Primer, einschließlich Vorwärts- und Rückwärtsprimern, und fügen Sie sie in einen einzigen Brunnen ein, der jedem Kandidatengen entspricht. Versiegeln Sie die Platte mit Kunststofffolie und Zentrifuge für 1 min bei 300 x g bei RT. Legen Sie die Platte in eine qPCR-Maschine und starten Sie das Programm dann bei 95 °C für 3 min, gefolgt von 95 °C für 15 s und dann 55 °C für 60 s. Wiederholen Sie die folgenden zwei Schritte für 45 Zyklen.