Isolement des cellules endocardiques et coronaires endothéliales du mur libre ventriculaire du cœur de rat

Toutes les procédures animales ont été approuvées par le Groupe d’administration sur les soins aux animaux de laboratoire (APLAC31608) de l’Université Stanford. 1. Préparation des tampons Préparer le tampon de digestion à l’aide des réactifs énumérés dans le tableau 1. Préparer la solution de stock DNase I : Dissoudre DNase I dans de l’eau sans RNase pour une solution de stock de 2 000 unités/mL (1 mg/mL). Aliquot et stocker la solution de stock à -20 oC. Préparer la solution liberase : Dissoudre la liberase avec de l’eau sans RNase pour une solution de stock de 5 mg/mL. Faites-le pivoter sur une banque à rouleaux à 4 oC pendant 30 min. Aliquot et entreposez la solution de stock à -20 oC. Préparer le tampon de tri en diluer 0,5 M d’acide éthylènediaminettraacétique (EDTA) et 10% de sérum bovin albumin (BSA) solution de stock avec 1x phosphate tamponné saline (PBS) pour une concentration finale de 2 mM de EDTA et 0,5% de BSA. 2. Collection de coeur REMARQUE : Six rats Sprague Dawley pesant 50 à 100 g ont été utilisés dans ce protocole. Aucune différence entre les sexes n’a été observée. Euthanasiez le rat avec du CO2 et placez-le en position de supine sur une plate-forme de dissection. Épinglez les extrémités vers le bas et stérilisez l’abdomen et la poitrine avec 70% d’éthanol. Ouvrez l’abdomen avec des ciseaux et insérez une aiguille de 21 G dans la partie du cava de vena postérieur situé derrière les intestins. Retirez le piston de seringue en arrière, en retirant le sang de la veine jusqu’à ce que le foie semble plus léger dans la couleur et pas plus de sang peut être retiré, indiquant l’ablation suffisante de sang. À l’aide de ciseaux, ouvrez soigneusement la poitrine pour éviter d’endommager le poumon et le cœur. Soulevez l’arc/atrium de l’aorte avec les forceps et coupez l’aorte, l’artère pulmonaire, les veines pulmonaires et le vena cava pour libérer et enlever le cœur. Laver le cœur avec 50 ml de froid 1x Hanks solution de sel équilibrée (HBSS) tampon 3x pour enlever le sang excessif. Sous un microscope à microdissection, retirer le mur libre ventriculaire droit dans un tube de 5 ml contenant le milieu Eagle modifié (DMEM) modifié de Dulbecco (DMEM) (figure 1A,B). Posez le cœur sur son visage postérieur plat pour identifier le côté gauche et droit. Localiser l’artère pulmonaire, la plus antérieure des veines et des artères ramification du haut du cœur et couper à travers l’artère pulmonaire jusqu’à la chambre ventriculaire droite. Sur la face antérieure du cœur, couper le long du septum jusqu’à atteindre le sommet. Continuer à couper du sommet jusqu’au côté postérieur du cœur le long du septum jusqu’à ce que l’artère pulmonaire et le point de jonction de chambre ventriculaire droite (figure 1A). À partir de l’artère pulmonaire et du point de jonction ventriculaire droite, couper à la fois le côté antérieur et postérieur du cœur perpendiculairement à la dissection précédente et loin du septum, jusqu’à ce que le mur libre ventriculaire droit est libéré du reste du cœur (figure 1B). Sous le microscope à microdissection, retirer le mur ventriculaire gauche dans un tube de 5 ml contenant du DMEM(figure 1C,D). Localiser l’aorte, ramification du haut du cœur derrière l’artère pulmonaire, et répéter la méthode décrite dans l’étape 2.5 pour couper le mur gauche ventriculaire libre. 3. Digestion de la CEE Placez les tissus muraux libres ventriculaires droits et gauches dans un plat de culture de 60 cm avec la surface intérieure couchée à plat, face vers le bas(figure 2).REMARQUE : La surface intérieure est la face intérieure du ventricule légèrement concave en forme comme le montre la figure 2A,C. Ajouter 0,5 à 1 ml de tampon de digestion au plat, en plaçant la pointe de la pipette directement sous le tissu. Continuer jusqu’à ce que seule la surface intérieure soit immergée. Incuber le plat dans un incubateur deCO 5%, 37 oC pendant 5 min. Ajouter le milieu EC au plat de culture pour arrêter la digestion.REMARQUE : Conserver la quantité de tampon de digestion par rapport à EC comme un rapport de 1:5. Utilisez une pipette de 1 ml pour rincer la surface intérieure des ventricules avec le milieu EC et transférer le ruissellement dans un tube de collecte de 50 ml à travers une passoire de 40 mm(figure 2E). Gardez les collections sur la glace pour la purification en aval. 4. Digestion ceC Couper le long de la surface extérieure du ventricule gauche sans contamination de la couche interne(figure 2B,D) et placer chacun dans un tube séparé de 5 ml contenant 1 ml de tampon de digestion.REMARQUE : Le ventricule gauche peut être identifié comme ventricule plus épais, et la surface extérieure peut être déterminée comme la face extérieure du ventricule légèrement concave. À l’aide de ciseaux de dissection, hachez la paroi ventriculaire en petits morceaux de 1 mm3. Incuber le tube dans un bain d’eau de 37 oC pendant environ 15-20 min. Vortex tous les 2-3 minutes. Pipette 4 ml de milieu EC dans le tube de 5 ml pour mettre fin à la digestion. Transférer la solution avec une pipette sérologique de 5 ml dans un tube de 50 ml à travers une passoire de 40 mm(figure 2E). Gardez les collections sur la glace pour la purification en aval. 5. Collection cellulaire Centrifugez les tubes à 300 x g pendant 10 minutes à température ambiante (RT) puis aspirez le surnatant. Si la granule apparaît rouge, réutilisez la granule dans 1 à 2 ml de globule rouge 1x (RBC) tampon de lysage(figure 2F).REMARQUE : S’il n’y a pas de CTC, passez à l’étape 6. Incuber les tubes dans un bain d’eau de 37 oC pendant 5 min. Pipette 10 mL de PBS dans les tubes de 50 ml pour arrêter la lyse. Centrifugez les tubes à 300 x g pendant 10 minutes à RT, puis aspirez le supernatant. 6. Tri des CE Ajouter 90 L de tampon de tri et 10 l d’anticorps pe anti-CD31 dans les tubes de 50 ml. Vortex les tubes, puis les incuber pendant 10 min dans un réfrigérateur à 4 oC. Ajouter 10 ml de tampon de tri dans les tubes, bien mélanger, puis centrifugeuse à 300 x g pendant 10 minutes à RT. Aspirez le supernatant et réutilisez la granule dans 80 L de tampon de tri et 20 L de microbilles anti-PE. Vortex les tubes et incuber à 4 oC pendant 15 min. Laver les cellules en ajoutant 10 ml de tampon de tri dans les tubes, bien mélanger, puis les centrifuger à 300 x g pendant 10 minutes à RT. Aspirer le supernatant et réutiliser la pastille dans 500 L de tampon de tri. Placez une colonne contenant des sphères superparamagnetiques dans un séparateur magnétique et rincez la colonne avec 3 ml de tampon de tri. Après que la colonne soit « stop d’écoulement », pipette 500 ‘L de la suspension de cellule dans les colonnes, puis laver les colonnes avec tampon de tri. Répétez le lavage 3x, chacun avec 3 ml de tampon de tri(figure 2G). Retirez les colonnes du séparateur et placez-les au-dessus d’un nouveau tube de collecte de 15 ml. À l’aide d’une pipette, ajoutez 5 ml de milieu EC aux colonnes et propulsez la solution à l’aide d’un piston à colonnes. Centrifugez les tubes de collecte à 300 x g pendant 10 min à RT, puis aspirez le supernatant. Extraire l’ARN de la granule cellulaire des échantillons de la CEE et de la CEC à l’aide d’un kit, conformément aux instructions du fabricant. Un minimum de 500 ng d’ARN peut être obtenu.REMARQUE : Après l’extraction de l’ARN, l’échantillon peut être stocké à -80 oC. Inverser transcribe 500 ng d’ARN pour obtenir cDNA à l’aide d’une amorce aléatoire et un kit, en suivant les instructions du fabricant. Effectuer pcR quantitatif pour la validation des populations endocardiales et endothéliales(figure 2H). Les séquences d’apprêt sont répertoriées dans le tableau 2. Ajouter 5 L de CEE ou ceC cDNA (1 ng/L) dans les puits d’une plaque de 384 qPCR. Ajouter la CEE ou l’ADC de la CEE dans suffisamment de puits pour qu’il y ait trois puits par nombre d’amorces. Mélanger 6 L de tampon vert QPCR SYBR de 2x qPCR avec 0,5 l de chaque amorce de 10 M, y compris les amorces avant et inversées, et ajoutez-les en un seul puits correspondant à chaque gène candidat. Scellez la plaque avec du film plastique et de la centrifugeuse pendant 1 min à 300 x g à RT. Placer la plaque dans une machine qPCR, puis démarrer le programme à 95 oC pendant 3 minutes, suivie de 95 oC pour 15 s, puis de 55 oC pour 60 s. Répétez les deux étapes suivantes pour 45 cycles.