Isolatie van endocardiale en coronaire endotheelcellen van de Ventriculaire Vrije Muur van het Hart van de Rat

Alle dierprocedures zijn goedgekeurd door het Administratief Panel on Laboratory Animal Care (APLAC31608) van Stanford University. 1. Voorbereiding van buffers Bereid de vergistingsbuffer voor met behulp van de reagentia in tabel 1. Bereid de DNase I voorraadoplossing voor: Los DNase I op in RNase-vrij water voor een voorraadoplossing van 2.000 eenheden/mL (1 mg/mL). Aliquot en bewaar de voorraadoplossing op -20 °C. Bereid de liberase oplossing voor: Los liberase op met RNase-vrij water voor een voorraadoplossing van 5 mg/mL. Draai het op een rolbank bij 4 °C gedurende 30 min. Aliquot en bewaar de voorraadoplossing op -20 °C. Bereid de sorteerbuffer voor door 0,5 M ethylenediaminetetraazijnzuur (EDTA) en 10% runderserumalbumine (BSA) voorraadoplossing met 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) te verdunnen voor een eindconcentratie van 2 mM EDTA en 0,5% van BSA. 2. Hartcollectie OPMERKING: Zes Sprague Dawley ratten met een gewicht van 50-100 g werden gebruikt in dit protocol. Er werd geen genderverschil waargenomen. Euthanaseer de rat met CO2 en plaats hem in een supine positie op een ontleedplatform. Pin de ledematen naar beneden en steriliseren zowel de buik en borst met 70% ethanol. Open de buik met een schaar en steek een 21 G naald in het gedeelte van de achterste vena cava gelegen achter de darmen. Trek de spuitzuiger terug, haal het bloed uit de ader totdat de lever lichter van kleur lijkt en er geen bloed meer kan worden ingetrokken, wat wijst op voldoende bloedverwijdering. Met behulp van een schaar, open de borst zorgvuldig om te voorkomen dat beschadiging van de long en het hart. Til de aorta boog / atrium met de tangen en snijd de aorta, longslagader, longaders, en vena cava te bevrijden en het hart te verwijderen. Was het hart met 50 mL koude 1x Hanks’ balanced salt solution (HBSS) buffer 3x om overmatig bloed te verwijderen. Verwijder onder een microdissectiemicroscoop de rechter ventriculaire vrije wand in een 5 mL-buis met dulbecco’s gemodificeerde Eagle medium (DMEM) (Figuur 1A,B). Leg het hart op zijn vlakkere, achterste gezicht om de linker- en rechterkant te identificeren. Zoek de longslagader, de meest voorste van de aderen en slagaders vertakking van de bovenkant van het hart en snijd door de longslagader naar de rechter ventriculaire kamer. Op het voorste gezicht van het hart, snijd langs het septum tot het bereiken van de top. Doorgaan met het snijden van de top van de achterste kant van het hart langs het septum tot de longslagader en de rechter ventriculaire kamer knooppunt punt (Figuur 1A). Vanaf de longslagader en rechter ventriculaire knooppunt, snijd zowel de voorste en achterste kant van het hart loodrecht op de vorige dissectie en uit de buurt van het septum, totdat de rechter ventriculaire vrije muur is bevrijd van de rest van het hart (Figuur 1B). Verwijder onder de microdissectiemicroscoop de linker ventriculaire vrije wand in een 5 mL-buis met DMEM (Figuur 1C,D). Zoek de aorta, vertakking van de bovenkant van het hart achter de longslagader, en herhaal de methode beschreven in stap 2.5 af te snijden van de linker ventriculaire vrije muur. 3. EEG-spijsvertering Plaats zowel rechts als links ventriculaire vrije wandweefsels in een 60 cm cultuurschaal met het binnenoppervlak plat liggen, naar beneden gericht (Figuur 2).OPMERKING: Het binnenoppervlak is het binnenvlak van de licht holle vorm van ventrikel zoals afgebeeld in figuur 2A,C. Voeg 0,5–1 mL van de spijsvertering buffer aan de schotel, het plaatsen van de punt van de pipet direct onder het weefsel. Ga door tot alleen het binnenoppervlak is ondergedompeld. Incubeer de schotel in een 5% CO2,37 °C incubator gedurende 5 min. Voeg EG medium aan de cultuur schotel om de spijsvertering te stoppen.OPMERKING: Houd de hoeveelheid vergistingsbuffer tot EG-medium als 1:5-verhouding. Gebruik een pipet van 1 mL om het binnenoppervlak van de ventrikels met EG-medium te spoelen en breng de afvloeiing over in een 50 mL-opvangbuis door middel van een zeef van 40 mm (figuur 2E). Houd de collecties op ijs voor downstream zuivering. 4. CEC-spijsvertering Snijd langs het buitenoppervlak van de linker ventrikel zonder verontreiniging van de binnenste laag (Figuur 2B,D) en plaats elk in een aparte 5 mL buis met 1 mL van de spijsvertering buffer.OPMERKING: De linker ventrikel kan worden geïdentificeerd als de dikkere ventrikel, en het buitenoppervlak kan worden bepaald als de buitenkant van de licht holle ventrikel. Met behulp van dissectie schaar, gehakt de ventriculaire wand in kleine, 1 mm3 stukken. Incubeer de buis in een 37 °C waterbad gedurende ongeveer 15-20 min. Vortex elke 2-3 min. Pipetteer 4 mL EG-medium in de 5 mL buis om de spijsvertering te beëindigen. Breng de oplossing met een 5 mL serologische pipet in een buis van 50 mL door middel van een 40 mm zeef (Figuur 2E). Houd de collecties op ijs voor downstream zuivering. 5. Celverzameling Centrifugeer de buizen op 300 x g gedurende 10 min bij kamertemperatuur (RT) en zuig vervolgens de supernatant aan. Als de pellet rood lijkt, de pellet opnieuw opschorten in 1-2 mL van 1x rode bloedcellen (RBC) lysing buffer (Figuur 2F).OPMERKING: Als er geen RBCs zijn, gaat u verder met stap 6. Incubeer de buizen in een waterbad van 37 °C gedurende 5 min. Pipetteer 10 mL PBS in de 50 mL buizen om de lysis te stoppen. Centrifugeer de buizen op 300 x g gedurende 10 min bij RT en zuig vervolgens de supernatant aan. 6. EG-sortering Voeg 90 μL sorteerbuffer en 10 μL anti-CD31 PE-antilichaam toe aan de 50 mL-buizen. Draai de buizen en broed ze vervolgens 10 min uit in een koelkast van 4 °C. Voeg 10 mL sorteerbuffer toe aan de buizen, meng grondig en centrifugeer vervolgens op 300 x g voor 10 min bij RT. Zuig de supernatant aan en stouw de pellet opnieuw in 80 μL sorteerbuffer en 20 μL anti-PE microbeads. Draai de buizen en broed bij 4 °C gedurende 15 min. Was de cellen door 10 mL sorteerbuffer in de buizen toe te voegen, meng grondig en centrifugeer ze vervolgens op 300 x g voor 10 min bij RT. Zuig de supernatant aan en stouw de pellet opnieuw in 500 μL sorteerbuffer. Plaats een kolom met superparamagnetische bollen in een magnetische afscheider en spoel de kolom af met 3 mL sorteerbuffer. Nadat de kolom “stroomstop” is, pipettt500 μL van de celsuspensie in de kolommen en was de kolommen vervolgens met sorteerbuffer. Herhaal de was 3x, elk met 3 mL sorteerbuffer(figuur 2G). Verwijder de kolommen uit de separator en plaats ze op een nieuwe 15 mL-inzamelbuis. Voeg met een pipet 5 mL EG-medium toe aan de kolommen en stuw de oplossing door een kolomzuiger te gebruiken. Centrifugeer de opvangbuizen op 300 x g gedurende 10 min bij RT en zuig vervolgens de supernatant aan. Haal het RNA uit de celpellets van de EEG- en CEC-monsters met behulp van een kit, volgens de instructies van de fabrikant. Een minimum van 500 ng RNA kan worden verkregen.OPMERKING: Na RNA-extractie kan het monster worden opgeslagen bij -80 °C. Reverse transcriberen 500 ng van RNA om cDNA te krijgen met behulp van een willekeurige primer en een kit, volgens de instructies van de fabrikant. Voer kwantitatieve PCR uit voor de validatie van endocardiale en endotheelpopulaties (figuur 2H). Primersequenties worden vermeld in tabel 2. Voeg 5 μL EEC of CEC cDNA (1 ng/μL) toe aan de putten van een 384 qPCR plaat. Voeg de EEG of CEC cDNA in voldoende putten, zodat er drie putten per aantal primers. Meng 6 μL van 2x qPCR SYBR groene buffer met 0,5 μL van elke 10 μM primer, inclusief zowel vooruit als achteruit primers, en voeg ze toe in een enkele put die overeenkomt met elk kandidaat-gen. Sluit de plaat af met plastic folie en centrifugeer 1 min bij 300 x g bij RT. Plaats de plaat in een qPCR-machine en start het programma op 95 °C gedurende 3 minuten, gevolgd door 95 °C voor 15 s, en vervolgens 55 °C voor 60 s. Herhaal de volgende twee stappen gedurende 45 cycli.