عزل الخلايا الإندوكاريال والشريان التاجي من الجدار الحر البطيني للقلب الجرذ
Summary
نقدم بروتوكولًا لعزل الخلايا الأندية والانهوائية التاجية من قلوب الفئران من خلال هضم الأنسجة بالتتابع في عازل للهضم وجمع الخلايا من دورات الطرد المركزي المتكررة وتنقية الخلايا باستخدام الميكروبات CD31 المضادة للفئران.
Abstract
وقد تبين أن الخلايا الانبهية الدابيدية (EECs) والخلايا الانهوائية التاجية (CECs) تختلف في الأصل والتنمية والعلامات والوظائف. وبالتالي، تلعب هاتان المجموعتان الخلويتان أدوارًا فريدة في أمراض القلب. الدراسات الحالية التي تنطوي على خلايا الانهويلية المعزولة التحقيق في مجموعات الخلايا التي تتكون من كل من EECs وCECs. يوضح هذا البروتوكول أسلوب عزل هذه الخلايا بشكل مستقل للتوصيف الخاص بالخلية. بعد جمع الجدار الحر البطيني الأيسر والأيمن، يتم تحرير الخلايا البطانة من السطح الخارجي والسطح الداخلي بشكل منفصل باستخدام محلول عازلة الهضم. احتفظ الهضم التسلسلي للسطح الخارجي وطبقة endocardial الداخلية بفصل مجموعتين من خلايا بطانة الأرض. ويجري التحقق من العزلة المنفصلة للبلدان الاقتصادية الخالصة والبلدان الاقتصادية لأوروبا من خلال تحديد علامات خاصة بكل مجموعة من السكان. استنادا إلى خلية واحدة نشرت سابقا RNA التنميط في قلب الماوس، وNpr3، Hapln1، والتعبير الجيني Cdh11 هي فريدة من نوعها لEECs؛ في حين Fabp4، Mgll، والتعبير الجيني Cd36 هي فريدة من نوعها لCECs. وكشفت بيانات qPCR عن تعبير مثري عن هذه العلامات المميزة في عيناتكل منها، مما يشير إلى عزل الجماعة الاقتصادية الأوروبية وCEC الناجح، فضلا ً عن الحفاظ على النمط الظاهري للخلية، مما يتيح إجراء المزيد من التحليل الوظيفي الخاص بالخلايا.
Introduction
توفر هذه المقالة بروتوكولًا مفصلًا (معدلًا من Gladka et al.1)للتشريح والعزل اللاحق للخلايا المنفثة المنفدية (EECs) والخلايا الانثيلية التاجية (CECs) من قلوب الفئران. ومن شأن القدرة على التحقيق في هذه الخلايا بشكل مستقل أن تمكن من استكشاف آليات خاصة بنوع الخلية تقوم عليها مجموعة متنوعة من أمراض القلب التي يمكن أن تكون بمثابة أهداف علاجية محتملة. ومع ذلك، لم يتم بعد نشر طريقة ناجحة لجمع مجموعات الخلايا هذه بشكل مستقل.
CECs تختلف عن EECs فيما يتعلق بأصلها، وعلامات، ووظائف أثناء نمو القلب والمرض11،2،,3،,4،,5،,6،,7. EECs تنبع من السطح البطني من mesoderm القلب3. أنها تنشأ من Flk1+ الخلايا السلف ردا على VEGF وHIF الإشارات وتشكيل الطبقة الأعمق من المناطق الثلاثة منفصلة من القلب النامية: الأذين، البطين، والوريد الجيوب الأنفية3،6. يشير تتبع النسب الوراثي إلى أن الخلايا الإندية المتعددة القدرات للورينوس الجيوب الأنفية تستمد خلايا وبوئية، تهاجر لتشكل الطبقة تحت الملحمية3. في وقت لاحق ، تميز الطبقة تحت الملحمة في الشرايين التاجية والأوردة ، بما في ذلك CECs ، والتي لا تزال عبر الجدار الحر البطيني الطرفي3،4. يتم تنظيم هذا المسار المنفدي إلى الإندوثيل من قبل VEGFC ، ELA / APJ ، وSOX17 يشيرإلى 3،4 ،66،8،9., يستمد التغاف البطيني أقل CECs من الحاجز التدخلي بواسطة آلية غير معروفة3. في وقت لاحق، يقترح التمايز المترجمة بين EECs و CECs بواسطة علامات محددة لهذه الخلايا اثنين من السكان، بما في ذلك Mgll، Fabp4، والتعبير Cd36 في CECs، أو Npr3، Cdh11، والتعبير Hapln1 في EECs3،,5،,10.
تلعب EECs و CECs أدوارًا مختلفة في وظيفة القلب. Endocardial إلى التحول mesenchymal، وتشكيل صمام، نضوج الغرفة، وتنظيم تدفق المسالك، وتطوير قناة atrioventricular هي مشروطة EECs6. بدلا من ذلك، CECs المساهمة في لهجة vasomotor والتهاب الشرايين التاجية11. هذه الفروق في وظيفة يؤدي إلى أدوار فردية في تطور المرض4,12. على سبيل المثال، تشير الأدلة إلى أن خلل EECs قد يؤدي إلى مرض الصمام الخلقي6،noncompaction عضلة القلب6،تأثير الحاجز الأذيني6،تليف يفيلي بطانة الرحم13،متلازمة القلب الأيسر hypoplastic13،نقص التنسج البطيني13،وتضخم القلب12. وبالمثل، وجدت الدراسات أن CECs غير طبيعية تسهم في مرض الشريان التاجي14 والتجلط11.
إن العزلة الناجحة للمراكز الاقتصادية لأوروبا والمراكز الاقتصادية لأوروبا ضرورية لتحقيق معرفة شاملة بهذين المجموعتين من الخلايا، والتي يمكن استخدامها في كل من البيئات البحثية والسريرية. ومن شأن تحديد عوامل النمو والتمايز لهذه الخلايا أن يوفر مرجعاً للتمايز بين الأنواع الفرعية الانبوثيلية من الخلايا الجذعية المستحثة المتعددة القدرات. وعلاوة على ذلك، فإن التحديد الكامل للتباينات في تطوير وتنظيم ووظيفة الشركات الاقتصادية والاجتماعية لأوروبا ووظيفتها أمر حيوي لفهم العوامل الجينومية والبيجينية المسؤولة عن العديد من أمراض القلب بطريقة خاصة بالخلية. توضح هذه المقالة الخطوات اللازمة للجمع الناجح للـ EECs و CECs بشكل مستقل، وتقدم أدلة على الفصل من خلال تقييم مستويات التعبير الجيني للعلامات الخاصة بنوع الخلية.
Protocol
Representative Results
Discussion
وتختلف مراكز CECs وEECs من حيث المنشأ والعلامات والوظائف، وبالتالي يمكن أن تلعب أدوارًا فريدة في التنمية والمرض. وتقتصر البروتوكولات القائمة لعزل الخلايا الانهوفية على الأنسجة الوعائية الكلية، مما يهمل جمع اللجان الاقتصادية لأوروبا، مما يحد من دراسة الوظائف الخاصة باللجنة الاقتصادية لأوروبا والجماعة الاقتصادية الأوروبية. ومن الضروري عزل ودراسة هاتين المجموعتين بشكل مستقل، لأن هذه المعرفة ستوفر مرجعاً للتمايز بين مراكز الرعاية الصحية المتكاملة في مراكز التقييم والمراكز الاقتصادية لأوروبا لأغراض الدراسات المستقبلية، وتيسر فحص هذه الخلايا للحصول على أهداف علاجية محتملة لمختلف أمراض القلب. يحدد هذا البروتوكول الجديد طريقة لعزل EECs عن السطح الداخلي وCECs عن السطح الخارجي للجدار الحر البطيني للفئران البالغة.
ومن الأهمية بمكان التحكم في توقيت كل خطوة بدقة شديدة في هذا البروتوكول. لأن عدد EECs محدود جدا في أنسجة قلب الفئران، قللنا من وقت الهضم للطبقة الداخلية للقلب لمنع الضرر الخلوي والأهم من ذلك، التلوث CEC. إضافة فورية من الحل المتوسط EC لإنهاء رد الفعل الأنزيمي هو أيضا مهم جدا للحفاظ على صلاحية الخلية عالية. تشير الكريات الحمراء التالية للخلايا إلى وجود عدد كبير من RBCs. اعتماداً على كمية التلوث RBC، يمكن إضافة 1-2 مل من المخزن المؤقت تحلل RBC لتدهور RBCs. يجب توقيت الحضانة بعناية لتجنب تلف كبير للخلايا، ويتم إضافة PBS على الفور لإنهاء رد الفعل. باستخدام البروتوكول الحالي، تمكنا من عزل 105 EECs من ستة قلوب الفئران. ويمكن أن تكون هذه الخلايا المصنفة على طبق ثقافة الخلية لمزيد من التوسع والتوصيف.
عند إعداد الأنسجة لجمع الجدار مجانا، تم غسل القلب مع HBSS لإزالة غالبية RBCs المتبقية. HBSS هو المتوسطة الموصى بها بسبب مظهره واضح، والتي تمكن من تصور خلايا الدم، على النقيض من DMED التي تحتوي على أحمر الفينول. تكوين المخزن المؤقت الهضم يضمن تحرير كاف من الخلايا الانهوثيلية، حيث إنزيم الهضم liberase يجرد أنسجة الخلايا المكشوفة، DNase الأول يزيل الحمض النووي من الخلايا الميتة لتعزيز انفصال الخلايا التي قد تمنعها نوعية لاصقة الحمض النووي، العازلة HEPES يوازن درجة الحموضة، وDMEM هو متوسط القاعدية المعدلة مع تركيز أعلى من الأحماض الأمينية والفيتامينات لتحسين صيانة الخلايا ويحتوي على الكالسيوم اللازمة لتنشيط
وفقا لتسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة (scRNA-seq) التي تم الحصول عليها من كل من الإنسان15 والماوس القلب10، تم الإبلاغ عن عدة علامات تعزى إلى مجموعات محددة من الجماعة الأوروبية. اخترنا بعض الجينات الأكثر ثراء لفحص نقاء EECs معزولة (أي Npr3، Cdh11، وHapln1)وEECs (أي Mgll، Fabp4، و Cd36). بالنسبة إلى α-Actinو Npr3و Cdh11وعلامات Hapln1 أظهرت زيادة التعبير في EECs مقارنة بـ CECs. وبالمثل، كان التعبير عن علامات Mgllو Fabp4و Cd36 أكبر في مراكز CECs مقارنة بالشركات الاقتصادية والاجتماعية. وتتفق العلامات المعبر عنها بشكل فريد لكل عينة مع علامات مميزة للبلدان الاقتصادية الخالصة والبلدان الاقتصادية لأوروبا على التوالي، مما يشير إلى العزلة الناجحة.
ومع ذلك ، فإن البروتوكول الحالي لا يستبعد التلوث المتبادل بين مجموعتين من الجماعة الأوروبية أثناء العزلة ، حتى مع عمليات الهضم التسلسلية التي يتم التحكم فيها بعناية. لذلك ، يمكن تطبيق بعض علامات سطح الخلية لمزيد من التنقية. على سبيل المثال، NPR3 عموما تسميات الديدوكارديوم10، في حين يمكن تتبع APJ غالبية CECs16. نظرًا لأنه يتم التعبير عن هاتين العلامتين على سطح الخلية ، يمكن استخدامهما لفرز الخلايا المنشطة (FACS) ، والأجسام المضادة المستخدمة لزيادة تنقية مجموعات EC المتميزة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن للبشري15 والماوس10 القلب scRNA – seq تأكيد إثراء Npr3 في EECs ، ويمكن استخدام Cd36 المحتمل لتنقية CEC.
وفي الختام، يحدد البروتوكول المقدم العزلة المستقلة لللجان الاقتصادية والاجتماعية لأوروبا والبلدان الاقتصادية لأوروبا عن قلب الجرذان. يمكن استخدام التحديد الشامل للخصائص الخلوية ، الذي تم تمكينه عن طريق عزل الخلايا ، لتطبيقات المصب الهامة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يقدر المؤلفان كثيراً الدكتورة لينغلي وانغ لمساعدتها في البروتوكول الحيواني، وقسم طب الأطفال في جامعة ستانفورد لدعم البنية التحتية. تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة / NHLBI K99 HL135258 (إلى M.G.).
Materials
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Gibco | 15630080 | 1M |
| 15ml Tubes | Eppendorf | 0030122151 | |
| 50ml Tubes | Nunc | 339652 | |
| 5ml Tubes | Eppendorf | 30119401 | |
| ACK Lysing Buffer | Gibco | A1049201 | |
| Anti-CD31 PE | Miltenyi Biotec | 130-115-505 | |
| Anti-PE microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | 10% |
| CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-rad | 1855485 | For qPCR |
| DNAse I | Worthington | LK 003172 | 1 mg/mL in water |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 10313021 | |
| Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2) | Lonza | CC-3162 | EC Medium |
| Ethylendiaminetetraacetic Acid (EDTA) | Invitrogen | 15575020 | 0.5 M |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) X1 | Gibco | 14025092 | |
| Hard-Shell 384-Well PCR Plates, thin wall, skirted, clear/white | Bio-rad | HSP3805 | For qPCR |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368813 | |
| Liberase TM | Sigma Aldrich | 5401119001 | 5 mg/mL |
| MACS LS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | For EC isolation |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | For EC isolation |
| Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical | Bio-rad | MSB1001 | For qPCR |
| Narrow Pattern Forceps | F.S.T | 11002-12 | For heart harvest |
| Nylon Sterile Strainer | Falcon | 352340 | 40 mm |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) X1 | Gibco | 1001023 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | A25780 | For qPCR |
| Quick-RNA Microprep Kit | Zymo Research | R1050 | For RNA extraction |
| S&T Forceps – SuperGrip Tips | F.S.T | 00632-11 | For heart harvest |
| Strabismus Scissors – Tungsten Carbide | F.S.T | 14574-11 | For heart harvest |
| Vannas Spring Scissors – Microserrated | F.S.T | 15007-08 | For heart harvest |
References
- Gladka, M. M., et al. Single-Cell Sequencing of the Healthy and Diseased Heart Reveals Cytoskeleton-Associated Protein 4 as a New Modulator of Fibroblasts Activation. Circulation. 138 (2), 166-180 (2018).
- Koren, C. W., Sveinbjornsson, B., Smedsrod, B. Isolation and culture of endocardial endothelial cells from Atlantic salmon (Salmo salar) and Atlantic cod (Gadus morhua). Cell and Tissue Research. 290 (1), 89-99 (1997).
- Tian, X., et al. Subepicardial endothelial cells invade the embryonic ventricle wall to form coronary arteries. Cell Research. 23 (9), 1075-1090 (2013).
- Wu, B., et al. Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling. Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).
- Li, Y., Lui, K. O., Zhou, B. Reassessing endothelial-to-mesenchymal transition in cardiovascular diseases. Nature Reviews in Cardiology. 15 (8), 445-456 (2018).
- Zhang, H., Lui, K. O., Zhou, B. Endocardial Cell Plasticity in Cardiac Development, Diseases and Regeneration. Circulation Research. 122 (5), 774-789 (2018).
- Yu, S. Y., et al. Isolation and characterization of human coronary artery-derived endothelial cells in vivo from patients undergoing percutaneous coronary interventions. Journal of Vascular Research. 46 (5), 487-494 (2009).
- Red-Horse, K., Ueno, H., Weissman, I. L., Krasnow, M. A. Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells. Nature. 464 (7288), 549-553 (2010).
- Kamimura, T., Yamagishi, T., Nakajima, Y. Avian coronary endothelium is a mosaic of sinus venosus- and ventricle-derived endothelial cells in a region-specific manner. Development, Growth and Differentiation. 60 (2), 97-111 (2018).
- Zhang, H., et al. Endocardium Minimally Contributes to Coronary Endothelium in the Embryonic Ventricular Free Walls. Circulation Research. 118 (12), 1880-1893 (2016).
- Kinlay, S., Libby, P., Ganz, P. Endothelial function and coronary artery disease. Current Opinion in Lipidology. 12 (4), 383-389 (2001).
- Jacques, D., Bkaily, G. Endocardial endothelial cell hypertrophy takes place during the development of hereditary cardiomyopathy. Molecular and Cell Biochemistry. 453 (1-2), 157-161 (2019).
- Grossfeld, P., Nie, S., Lin, L., Wang, L., Anderson, R. H. Hypoplastic Left Heart Syndrome: A New Paradigm for an Old Disease. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 6 (1), (2019).
- Li, Y., et al. Down-regulated RGS5 by genetic variants impairs endothelial cell function and contributes to coronary artery disease. Cardiovascular Research. , (2019).
- Miao, Y., et al. Single-Cell RNA-Seq Reveals Endocardial Defect in Hypoplastic Left Heart Syndrome. bioRxiv. , (2019).
- Chen, H. I., et al. The sinus venosus contributes to coronary vasculature through VEGFC-stimulated angiogenesis. Development. 141 (23), 4500-4512 (2014).
