Deciphering the Structural Effects of Activating EGFR Somatic Mutations with Molecular Dynamics Simulation

Mahlet  Z. Tamirat; Kari  J. Kurppa; Klaus Elenius; Mark  S. Johnson

doi:10.3791/61125

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Biochemistry

通过分子动力学模拟破译激活EGFR体电突变的结构效应

Published: May 20, 2020

doi:

10.3791/61125

Mahlet Z. Tamirat¹, Kari J. Kurppa², Klaus Elenius^2,3,4, Mark S. Johnson¹

¹Structural Bioinformatics Laboratory, Biochemistry, Faculty of Science and Engineering,Åbo Akademi University, ²Medicity Research Laboratories and Institute of Biomedicine,University of Turku, ³Turku Bioscience Centre,University of Turku and Åbo Akademi University, ⁴Department of Oncology and Radiotherapy,University of Turku and Turku University Hospital

Summary

该协议的目的是利用分子动力学模拟来检查由于EGFR激酶蛋白的激活突变而发生的动态结构变化。

Abstract

在受体酪氨酸激酶（RTK）的表皮生长因子受体（EGFR）家族（ErbB）中发生的许多躯体突变从癌症患者中报告，尽管相对较少已经测试，并证明导致ErbB的功能变化。ErbB受体在配体结合时被粉化和激活，受体的动态构象变化是下游信号感应所固有的。对于实验显示的两种突变，A702V和⁺⁷⁴⁶ELREA⁷⁵⁰ 缺失突变，我们用以下协议说明分子动力学（MD）模拟如何探明突变酪氨酸激酶结构与野生型EGFR相比的（1）相位稳定性;（2）结构后果和构象性转变及其与观察到的功能变化的关系;（3）突变对结合ATP强度的影响，以及激活的非对称二丁体中激酶域之间的结合;和（4）突变对与活性酶相关的EGFR结合位点内的关键相互作用的影响。该协议提供了详细的分步程序和指导，对于使用MD模拟作为探究结构动力学和与生物功能关系的手段的蛋白质结构调查，可以更普遍地发挥作用。

Introduction

受体酪氨酸激酶（RTKs）的人类表皮生长因子受体（EGFR）家族（ErbB）包括四个成员 – EGFR/ErbB1/HER1、ErbB2/HER2、ErbB3/HER3和ErbB4/HER4。ErbB受体调节细胞生长和增殖、分化、迁移和存活率¹^1、2²等基本细胞过程，因此是强大的原生基因。ErbB受体的异常活性，特别是EGFR和ErbB2，经常与人类癌症相关，使ErbB受体成为癌症治疗^2、3^,^{的主要靶点}。

从人类恶性肿瘤^{3，4，5，ERBB基因的}^几次^体^理变化^已经报告。 ERBB最佳特征的例子包括非小细胞肺癌（NSCLC）EGFR激酶域中的复发性、激活点突变和帧内短删除。这些EGFR突变代表了癌症生长的关键驱动因素，并预测对EGFR的敏感性针对癌症药物⁶^,^6，7，8。^,⁸然而，在大多数癌症中，EGFR中的体细胞突变发生在这些反复出现的”热点”之外，并分布在受体的整个1210残差跨度内。事实上，EGFR原序沿线的残留物在人类癌症9中被发现^发生变异。然而，除了少数热点，绝大多数与癌症相关的EGFR突变的功能意义仍然未知。

ErbBs 的单体结构由大型氨基酸终端细胞外域组成，然后是单个跨膜螺旋，导致细胞内酪氨酸激酶域和 C-终端尾区，其中包含细胞内信号蛋白的对接位点。利高结合触发细胞外域的戏剧性构象变化，通过暴露对称交叉的二角臂并与其芳香/疏水表面相互作用，促进受体二角蛋白的形成。在受体二丁层形成时，酪氨酸激酶域不对称地接触（图1），导致激酶的激活，这些激酶能对受体单体C-终端尾部进行磷化，随后在下游信号^10、11^,¹¹的激活中。

图1：EGFR二元结构。 当细胞外域结合生长因子（EGF，表皮生长因子）时，EGFR 一毛钱。然后，通过与活化剂激酶域的不对称相互作用激活接收器激酶域，并且C-终端尾部在酪氨酸残留物中自动磷化（从塔米拉特等人^{第12条修改}）。请单击此处查看此图的较大版本。

由于单体二丁体过渡期间发生的动态结构重组，以及与非对称二丁体的形成相关的激酶激活，沿受体结构全长发生的突变可能会对受体功能产生影响。在这里，我们描述了我们之前研究中的几个例子，其中突变和可视化的建模足以解释对功能的影响。

例1：一个报告的突变，D595V在ErbB4^13，导致增加ErbB4二化和磷酸^化14。突变位置的可视化是理解观察到的功能效应的关键因素：D595V发生在 ec域的二毛手臂的对称交叉（图2A）。手臂主要是芳香和疏水，用瓦林代替极性阿斯巴酸将增加”粘性”疏水相互作用，稳定暗化剂，从而增加磷酸化^{的时间长度14。}最初，在每只手臂上发现阿斯巴酸盐是一个惊喜，但回想起来，人们可能会认为它是一种活动定时机制，极酸侧链会降低完整调暗剂的亲和力和寿命，从而限制激酶介质的磷酸化和信号。然后，通过进一步稳定 ErbB4 二床，用瓦林替换将移除此保护。

图2：ErbB4激活突变和产生激酶死亡ErbB4的突变的位置。 （A） D595 （激活 D595V 突变）位于 ErbB4 ectododo 模型的芳香/疏水一毛臂上;与增长因素结合的武器关联;（附近的残留物显示为木棍）。（B）在 ErbB4 中，G802（未激活 G802dup 突变）有助于在 ATP 腺素环周围形成结合口袋，催化 D861（未激活 D861Y 突变）结合 ATP 的 Mg^2+（未显示）和 γ 磷酸盐组。请单击此处查看此图的较大版本。

示例 2：人们可能预计，针对激酶域的 ATP 结合位点的体细胞突变将改变或消除酶活性，导致无法发出信号的受损或激酶死亡受体。在9例乳腺、胃、结肠直肠或NSCLC 15患者报告的突变中^{，9个突变中，2}个在检测时磷酸化活性^{高度降低16：G802dup（G→GG）}和D861Y。两种激活体突变都存在于酪氨酸激酶域结构的 ATP 结合位点（图2B）：柔性甘氨酸，重复，将改变腺氨酸环位点，而小阿斯巴酸被终端磷酸盐附近的笨重酪氨酸取代将物理上阻止 Mg²⁺-ATP 结合。但是，由于 Erbb4 可以与 ErbB2 形成异质体 – ErbB2 不绑定生长因子，并且依赖于与 Erbb 的关联，该 Erbb 可以进行异构化 – Erbb2 （活动） -ErbB4（激酶-死亡）异质体会通过Erk/Akt信号通路刺激细胞增殖，但细胞不会分化，因为激酶死亡ErbB4和缺乏STAT5通路激活^16。

在最近的研究中，ErbBs的动态运动显然与了解某些突变体对ErbB功能的影响有关，特别是酪氨酸激酶域内发生的突变。酪氨酸激酶域由N叶（主要是β片）和C-叶（主要是α脂肪）组成，由ATP结合的催化位点分离。N-lobe 包括 +C 螺旋和 P 环，而激活（A 环）和催化回路存在于 C-lobe 17、18、19¹⁷^,¹⁸^,^中。酪氨酸激酶域的晶体结构揭示了两个非活动构象，大多数结构具有像Src的不活动状态。在活性构象中，A 环的催化阿斯分割指向 ATP 结合位点，而 +C 螺旋指向 ATP 结合口袋（”+C-in”构象），形成强谷氨酸-裂氨酸离子对相互作用。

由于 ErbB 和组件激酶域是高度动态的实体，尤其是在突变对功能和生物活动的影响可能与 ErbB 的构象状态紧密相关的情况下，因此评估突变与它们将经历的动态变化范围相关的突变非常重要。ErbB 的 X 射线晶体结构提供 3D 结构的静态快照，这可能与理解突变的动态后果相关，也可能与相关。为了探寻与三维（3D）结构可用的”能量景观”对应的动态变化范围，分子动力学（MD）模拟^{被广泛应用于20。}在突变导致酪氨酸激酶域内局部构象变化或复杂稳定的情况下，按 100 ns 顺序进行模拟可能就足够了。但是，较大规模的构象变化（例如，激酶域的活动和非活动构象之间的转换）需要较长的模拟时间 – 以微秒^{21 的顺序计算}。

关于下面描述的协议，我们考虑在酪氨酸激酶域内激活两个突变（图3）。这两种突变都位于激酶域内，这些位置发生局部local构象变化，这些变化决定了激酶是否处于活动状态，因此在这两种情况下都应用了 MD 模拟。在第一种情况下，我们考虑直接影响EGFR接收器激酶域的ATP结合位点和催化机制的更改，专门研究在NSCLC^4、7中广泛牵连的 exon 19^删除突变^的后果。α⁷⁴⁶ELREA⁷⁵⁰突变，可减少 μC 螺旋前 3-μC 回路的长度 – 向激酶激活时的结合/活性位点移动的螺旋，通过定位与 ATP 相互作用的 Lysine，参与形成螺旋的 E762 和 K745 之间的临界静电相互作用 – 使激活^{域为 12}。在第二种情况下，我们考虑EGFR的A702V突变，它被证明是一种由 iScream 平台⁹揭示并识别在NSCLC患者²²中的新功能增益激活突变。接收方激酶域上的 Alanine-702 位于接收器接口的接体和活化器激酶域的 juxtamebane 段 B 上，其中激活⁹需要这种非对称激酶暗化复合物和激酶构象变化。

图3：EGFR的不对称激酶域暗化器。 A702V突变将位于活化器和接收方激酶域的关键接口，与 +C 螺旋相邻，靠近活化酶的等体 941。非对称二丁体的形成引起的一致性变化导致激酶激活。包含 ELREA 序列的 +3-μC 环路直接在 +C 螺旋之前;在激活过程中，+C 螺旋向内移动，朝 ATP 绑定站点移动。请单击此处查看此图的较大版本。

Protocol

注：使用MD模拟检查+ELREA和A702V突变对EGFR结构的影响的详细步骤讨论如下： 1. 结构准备注：为了研究[ELREA突变]的结构影响，准备如下野生型和突变形式的阿波活性、ATP绑定活性和apo非活性EGFR单体结构。打开 Chimra23 可视化程序（https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/）准备野生型apo活性EGFR激酶结构。在” 文件” 菜单中，单击”按 ID 提取”选项并选择蛋白质数据库（PDB24）数据库并指定 PDB 代码 2GS225 （2.8 + 分辨率）。PDB 是一个 3D 结构库，由不同的实验技术解决，包括 X 射线晶体学、核磁共振光谱学、低温电子显微镜和中子衍射。从 EGFR PDB 结构 1M1426 （2.6 +）和 3W2S 2727 （1.9 +）中选择这些段，构建 2GS2 缺失的结构元件。为此，请打开 1M14 和 3W2S，并使用工具与结构比较菜单中的”MatchMaker”选项将它们叠加 →在2GS2 上。裁剪从 1M14 和 3W2S 添加的段。选择 2GS2 间隙之前残留物的端子原子以及从 1M14 和 3W2S 添加的原子（有关添加段的详细信息，请参阅表 1）。在命令行类型绑定 sel 和命中输入。此结构是模板结构。使用步骤 1.2 中的模板结构构造 EGFR 激酶域的 μELREA 删除突变形式。通过保存模板结构序列（收藏→序列 → 文件→ 保存为），然后删除残留编号 746-750 的 ELREA 序列，生成 [ELREA EGFR 的 FASTA 格式序列）。打开奇梅拉中的 μELREA EGFR 序列，并使用”序列”菜单将其与 2GS2 模板结构序列对齐。在对齐窗口中选择” 结构→建模器（同源性）28 选项。在弹出窗口上，将 2GS2 复合结构指定为模板，将突变序列指定为要建模的查询。然后按 “确定”。根据 zDOPE 分数（通常是最低分数）和目视检查，在生成的模型中选择突变模型。要准备ATP绑定野生型EGFR激酶结构，请使用PDB结构2ITX 29（2.98+）作为主结构。29按照步骤1.2中的步骤，使用结构 2GS625 （2.6 +）和 3W2S 构建缺失段（参见表 1）。通过打开文本编辑器中的 PDB 文件并将 ANP 的 N3B 氮原子转换为氧原子，将生成结构中的配体 ANP 转换为 ATP。如步骤 1.1 所述，在 Chimera 中打开步骤 1.4 中的结构。从 PDB 结构 2ITN29 （2.47 +）向该结构添加镁离子，以实现 Mg2+ 离子的类似定位。使用步骤 1.5 生成的结构，在步骤 1.3 之后对 μELREA 突变体进行建模。 Apo 活动 EGFR Apo 非活动 EGFR ATP 绑定活动 EGFR 主体结构 2GS2 2GS7 2ITX 用于构建缺失循环的结构 1M14 （723-725） 3W2S （958-984） 2GS6 （862-865） 3W2S （967-981） 4HJO （848-850） 3W2S （990-1001）表 1：用于构建 apo 活动、apo 非活动和非活动结构和 ATP 绑定活动结构的复合模型的结构。主结构中缺失区域（括号中的氨基酸范围）由所列结构构成。为了准备野生型 apo 非活性 EGFR 激酶结构，请像步骤 1.1 中一样打开 PDB 结构 2GS725 （2.6 +），并删除绑定配体和晶体水。使用步骤 1.2 中的过程，从结构 3W2S 和 4HJO30 （2.75 +）中添加 2GS7 中缺失的段（参见表 1）。基于最终的非活动EGFR结构，使用步骤1.3中的过程准备突变模型。注：对于A702V突变研究，EGFR非对称二聚体结构进行了研究，因为该突变位于形成三聚界面很大一部分的激酶域的并列乙基段。野生型和 A702V 突变 EGFR 结构的编制如下：野生型非对称二元结构由PDB结构2GS2构成，最初以单体形式显示。要转换为在不对称排列中包含活化剂和接收器激酶的生物组件，请像在 1.1 中一样在 Chimera 中打开 2GS2，然后通过单击工具 → 高阶结构 → 单元单元菜单进行对称计算。选择 2GS2 结构并输入 “复制”。最后，从对称操作产生的二元的多个副本中选择并保存单个非对称二分。使用步骤 1.8 中的野生类型非对称 EGFR 结构，使用奇梅拉中的工具 → 结构编辑 → Rotamers 选项，将丙氨酸 702 替换为 valine 来构建 A702V 突变体。注：总共为+ELREA和A702V突变研究准备了6个单体和两毛制EGFR结构。每个结构随后处理模拟使用蛋白质制备向导在Maestro程序31和MD模拟与琥珀程序32。使用”文件”导入结构选项在 Maestro 中→结构。然后点击蛋白质制备向导按钮并选择以下选项：添加氢原子，构建缺失的侧链原子，使用PROPKA确定pH7.0值电离残留物的质子状态，优化芦笋、谷氨酰胺和组氨酸残留物的方向进行氢结合，最终最小化结构。 2. 系统设置打开琥珀色软件包中包含的跳跃程序。进口 ff14SB 力场33 （源跃进.protein.ff14SB）和 TIP3P 水分子34 （源跃进.水.tip3p）.对于 ATP 绑定系统，还导入 ATP35 的参数（loadamberparams frcmod.phosphate， loadamberprep ATP.prep）。然后，加载结构（mol = loadpdb 结构.pdb）。用显式 TIP3P 水分子在八面体盒中溶解结构，这些分子从蛋白质的表面原子（解氧糖体 TIP3PBOX 10.0）向各个方向延伸 10 10 10 10 。检查已建系统（检查摩尔）并通过添加必要的离子（附加层 mol Na= 0 ）中和它。要对生物分子系统进行充分建模，请向模拟框中添加额外的 Na + /Cl – 原子，使系统盐浓度达到 0.15 M（加法摩尔 Na+ X，加注 mol Cl- X），其中 X 被结果：所需的盐浓度 = 水分子数 * 每个水分子的体积 = Avogadro 的数字所取代。生成并保存系统的拓扑和坐标文件，作为后续生产模拟的输入（saveamberparm mol X.prmtop X.inpcrd）。 3. 分子动力学模拟使用琥珀色，最初使仿真系统受到 5000 个最陡坡和结合梯度能量最小化的周期，以规避不利的配置。以多个步骤进行最小化，逐步将对溶质原子施加的约束从 25 kcalmol-1 +-2 降低至 0 kcal mol-1 +-2。在最小化输入文件中，min.in调整总最小化周期（maxcyc = 5000）的 maxcyc 变量，以说明最陡峭下降算法的周期数。使用 restraint_wt 变量对约束掩底参数指定的溶质原子施加约束力。然后运行最小化，如下所示：$AMBERHOME / bin / sander – o – i min.in – o min. out – p X. prmtop – c X. inpcrd – r min. rst – ref X. inpcrd注：使用的策略和实际参数可能因自己的喜好而异。详情及指引可从琥珀色手册及网站（https://ambermd.org/index.php）将系统加热 100 ps，从 0 K 到 300 K，在溶质原子上设置10 kcal mol-1 + -2约束。为此heat.in，在 heat.in 输入文件中设置tempi = 0.0 ，temp0 = 300.0 ，dt = 0.002 ps ，nstlim = 50000 和 restraint_wt = 10。 temp0 = 300.0使用以下命令执行加热：$AMBERHOME / bin / sander – o – i heat.in – o 热. out – p X. prmtop – c min. rst – r 热. rst – x 热. mdcrd – ref min. rst 在《不扩散条约》合奏下，平衡900 ps的系统;恒定的原子数、温度（温度0 = 300.0）和压力（ntp = 1），用贝伦德森方法（ntt = 1）控制它。为长距离静电相互作用设置 9 1 + 距离截止（切断 =9.0）。逐渐降低溶质原子约束至0.1 kcalmol-1 =-2 （restraint_wt = 0.1。运行平衡输入文件equil.in，描述上述参数，如下所示：$AMBERHOME / bin / sander – o – i equil.in – o equil. out – p X. prmtop – c 热. rst – r equil. rst – x equil. mdcrd – ref 热. rst 使用无拘无束的 5 ns 模拟完成平衡（设置 dt = 0.002 ps ，ntslim = 25000000）。$AMBERHOME / bin / sander – o – i equil_final. in – o equil_final. out – p X. prmtop – c equil. rst – r equil_final. rst – x equil_final. mdcrd – ref equil. rst 通过检查温度、压力、密度和能量值，检查系统已平衡。$AMBERHOME / bin / process_mdout. perl 热. out equil. out equil_final. outxmgrace 摘要。温度/密度/ETOT/EPTOT/EKTOT 执行 100 ns 的生产模拟（设置 dt = 0.002ps，ntslim = 50000000 在 prod.in），并保存每 10ps（ntwx = 5000）的构象数。$AMBERHOME / bin / sander – o – i prod.in – o prod. out – p X. prmtop – c equil_final. rst – r prod. rst – x prod. mdrcd – ref equil_final. rst 4. 分析目视检查通过打开VMD36中的相应prod.mdcrd轨迹文件，可视化在野生类型和突变 EGFR 激酶模拟过程中采样的构象。使用方便的二级结构表示，从记录的轨迹分析蛋白质的整体结构动力学。查看感兴趣的原子/残余物之间的特定相互作用，例如催化必需的 K745 – E762 盐桥。或者，以 PDB 格式保存在模拟期间采样的多个构象，并使用 Chimera 程序打开它们。使用 MatchMaker 选项在初始结构或中值结构上叠加结构。以实心显示初始/中值结构，以褪色的白色显示其余对齐结构。这种方法允许人们更清楚地可视化记录的结构运动。注：在Melvin等人37中，可以找到关于MDS构象体的有效表示和处理的建议。 RMSD 和 RMSF 分析使用 Cpptraj 程序38 计算根平均平方偏差（RMSD）和根平均平方波动（RMSF）计算，以分析蛋白质的全局稳定性并检查不同结构单元的灵活性。在 rmsd.in 和 rmsf.in 输入文件中，指示初始结构的主干原子（用于 RMSD）和 C+ 原子（用于 RMSF）作为 RMS 拟合的参考。在 rmsd/rmsf.in 文件中导入琥珀色拓扑文件（parm X.promtop）和相应的轨迹文件（trajin prod.mdcrd）.然后运行命令 Cpptraj -i rmsd/rmsf.in。绘制输出数据以进行分析。或者，根据 C+ 原子 RMSD 对齐构象组合并着色每个残留物。为此，请打开 Chimera 中的构象，并将它们与媒人选项对齐。转到 “工具→按→渲染。选择构象合奏和 C+ RMSD 的残差作为属性，然后单击”确定 “。然后，构象的链迹将从蓝色→白色→红色，分别反映高、中、低结构稳定性的区域。氢键分析分析ATP与野生型/+12个EFR之间的氢键相互作用。准备一个Cpptraj hbond.in，以执行此任务。 hbond.in定义一个氢键，供体接受器距离小于或等于 3.5 Ω，键角大于或等于 135°。仅指定分析与Nointramol变量（即 ATP 和 EGFR 之间的氢键）（hbond All nointramol dist 3.5 out nhb.agr avgout avghb.dat）之间的分子间氢键。运行脚本作为Cpptraj-i hbond.in。使用此脚本可以评估分子内部的相互作用，例如残渣 K745 和 E762 之间的相互作用，这些残留物是 EGFR 激酶活性的关键残留物。为此，指定K745为氢键供体，E762为氢键接受 hbond.in 并相应地运行脚本。原子之间的监测距离通过打开 VMD中的野生类型轨迹和 +ELREA apo EGFR，测量 K745 和 E762 之间的距离。通过单击鼠标标签，选择 Glu762 的 C+和 Lys745 的 Nz →键标签→键。通过绘制图形和图形、标签和粘结 →，→模拟→距离。自由能量计算要计算 ATP 和野生型/+ELREA EGFR 之间以及野生型/A702V EGFR 的活化剂和接收器激酶之间的估计结合自由能量，请使用 AMBER 封装中提供的分子力学通用出生表面积（MM-GBSA）模块39。将 ATP 设置为配体，将 EGFR 设置为 μELREA 研究中的受体。在A702V研究中，指定接收器激酶为配体，活化剂激酶为受体。首先在将PBRadii值设置为mbondi2的跳跃程序中分别准备配体、受体和配体受体复合PDB文件。对于 PDB 文件，保存气相琥珀色拓扑（.prmtop）和坐标（.inpcrd）文件。然后，在 mmgbsa 输入文件中，mmgbsa.in，设置igb = 2 ，saltcon = 0.1。使用模拟的轨迹、准备好的受体/配体琥珀文件和 mmgbsa.in 中的参数执行绑定能量计算，MMPBSA.py以琥mmgbsa.in珀色提供：$AMBERHOME / bin / Mmpbsa. py – o – i mmgbsa.in – o mmgbsa. dat – sp X. prmtop – cp 复杂. prmtop – rp 受体. prmtop – lp 配迪. prmtop – y prod. mdcrd – eo 输出. csv 通过绘制图形分析输出数据输出.csv. 。

Representative Results

所述协议用于研究+ELREA和A702V突变对EGFR激酶结构的结构效应。该协议的一个应用是研究突变对局部结构/构象稳定性的影响，通过计算MD模拟的RMSD和RMSF值。由于A702V突变位于同膜B段，因此为野生型和A702V EGFR计算了接收方激酶相对于起始结构的这一段RMSD。结果（图4A）显示，与野生型EGFR激酶域（平均RMSD 1.1 1 1 1 1 1 1 1 1 0.01）相比，突变体的朱克斯膜B段在100 ns模拟（平均RMSD 0.7 + – 95% 置信区间（CI） 0.009）中提高了构象稳定性。这很可能是由于将丙氨酸702（甲基组侧链）置换为更笨重的疏水残留物、瓦林（异丙基组侧链）而在二聚器界面上更紧密的疏水相互作用的结果，导致接收器激酶域上的V702与活化剂激酶域的异构相互作用增加。 β-Β突变位于+3-μC环，毗邻功能临界的+C螺旋;μC 螺旋的构象是 EGFR 激酶活动状态和非活动状态之间变化的关键。在MD模拟期间，通过检查RMSF对螺旋中残留物的C+原子（图Figure 44B）：总体，与野生型（平均RMSF 1.5° – 95% CI 0.4）相比，突变体（平均 RMSF 1.1 + – 95% CI 0.57）的波动较低;N 端子残留物的波动差异最高。分别叠加在野生型激酶域和[ELREA激酶域的中值结构上的采样构象也支持这些结果》（图4C）：野生型和β雷亚激酶域对叠加构象具有整体相似的稳定性，但+3-ΜC环和+C螺旋除外，在+ELREA EGFR中，这些均明显更稳定。这些发现表明，删除ELREA序列会抑制活动状态+C螺旋的运动，从而抑制并稳定活性构象。此外，由于 +C 螺旋构成非对称二角界面的一部分，突变体中 μC 螺旋上的约束很可能稳定非对称二角，延长激活状态的持续时间。该协议的另一个应用是研究模拟过程中发生的关键分子内和分子间相互作用的行为。因此，K745和E762之间的相互作用，这是EGFR酶活性的根本，通过测量MD模拟期间两个残留物的侧链极原子之间形成的氢键的小时占用率（图5A）：与野生型激酶域相比，在βREA激酶域中，由于更稳定的μC螺旋，这种关键的静电相互作用在β雷亚激酶域中形成更为频繁，因此，由于更稳定的βC螺旋，该动力学与E762相比，在βREA激酶域中形成更为频繁。在模拟过程中，还评估了Mg 2+-ATP与野生型和[ELREA EGFR激酶域》（图5B）之间的相互作用（图5C）：μELREA（平均值4.0 – 95%CI 0.03）的氢键数量大于野生型EGFR（平均值3.2-95%CI 0.04）。Figure 5C对氢键的进一步分析表明，K745与埃勒雷亚EGFR中的ATP磷酸盐组相互作用更为频繁，这与在埃勒雷亚突变EGFR激酶域模拟中指出的更稳定的K745-E762相互作用有关。协议中描述的MD模拟也可用于评估蛋白质-蛋白质和蛋白质配体相互作用的结合相对自由能量。野生型和A702V EGFR的活化剂和接收方激酶域之间的结合能量，以及ATP与野生型和+ELREA突变EGFR激酶域之间的结合能量，计算自分子力学通用出生表面积（MMGBSA）计算（图6A）：A702V突变体产生较低的平均+G结合值（平均+G结合=-76千卡/摩尔-9 5% CI 0.47），表示更有利的暗化相互作用，与野生型 EGFR 域（平均 +G绑定= -61 kcal/mol – 95% CI 0.61）相比。A由于A702V EGFR激酶域观测到的疏水性相互作用增加，此观测结果与更稳定的朱斯特彭贝B段和更紧密的二聚光界面一致。在 ATP 绑定到野生类型和 μELREA EGFR 激酶域（图6B）的情况下，MMGBSA 计算预测与 +ELREA 突变体（平均+57 kcal/mol – 95% CI 0.43）结合更强 ATP 绑定，与野生型 EGFR（平均 +G绑定-48 kcal/mol – 95% CI 0.33）进行比较。与野生型域相比，这一结果与ATP和埃雷亚EGFR（图5C）之间记录的氢Figure 5键数量相同。该协议还可用于调查在模拟过程中观察到的一致性变化。在目前的研究中，通过从模拟中对样品构象的目视检测和叠加，研究了5月雷亚突变对非活动EGFR构象的影响。分析发现+ELREA EGFR激酶域中的+C螺旋向内运动（图7A），这是Figure 7向活动状态过渡期间预期的结构变化。相比之下，野生类型非活动EGFR的+C螺旋保持了初始构象（图7BB）。因此，MD模拟支持了删除突变的建议，即实验显示的增加激酶活性40，41，促进从非活动激酶到活动状态的构象性转变。40, 图4：MD仿真期间活性EGFR激酶域的野生型和突变构象稳定性。（A） RMSD（骨干原子）在野生型（蓝色）和A702V（红色）接收器激酶域的并列膜B段。（B） RMSF （C+ 原子）超过 +C 螺旋的残留物：野生型（蓝色）和[ELREA（黄金）。（C）野生型（左）和+ELREA（右）EGFR激酶域的叠加样品构象;基于每个残留物的 RMSD （C+ 原子）的链迹线与中值结构有关。着色范围从蓝色到白色到红色，表示高质量稳定性到低构象稳定性区域。请注意，隔离激酶域的”自由”N 端子区域（红色）在完整的 EGFR 结构中不会表现出此级别的移动性。根据Chakroborty等人9（图4A转载，经生物化学杂志许可转载）和塔米拉特等人第12条改编的数字。请单击此处查看此图的较大版本。图5：在MD模拟过程中，有源接收器激酶中的主要特征：K745-E762盐桥、+C螺旋和与ATP的相互作用。（A） K745-E762相互作用在模拟野生类型（蓝色）和+ELREA（黄金）EGFR激酶域期间的占有率。（B）野生型和+ELREA突变体与ATP（棒）相互作用的残留物。Mg2+ （绿色）坐标与 ATP 和 D855。（C） ATP在MD模拟期间与野生型和+ELREA EGFR激酶域形成的氢键数。图自塔米拉特等人12。请单击此处查看此图的较大版本。图6：在模拟过程中，对突变激酶域观察到较低的相对自由结合能量。（A）为野生类型（蓝色）和A702V（红色）EGFR的活化剂和接收方激酶域之间的相互作用计算的绑定能量。（B） +G将ATP 绑定到野生型（蓝色）和+ELREA（黄金）EGFR 激酶域。根据Chakroborty等人9（图6A转载，经生物化学杂志许可转载）和塔米拉特等人第12条改编的数字。请单击此处查看此图的较大版本。图7：野生类型和+ELREA非活性EGFR激酶域的超置构象。αC螺旋和A环螺旋的象形（A）野生类型（蓝色中位结构）和（B） +ELREA EGFR （黄金）其他样品的构象，褪色的白色;MD 模拟之前的初始结构，粉红色。图自塔米拉特等人12。请单击此处查看此图的较大版本。

Discussion

本研究中描述的协议侧重于利用分子动力学模拟来研究激活EGFR激酶域的体细胞突变引起的局部和全球结构变化。虽然野生型和突变EGFR的X射线晶体结构提供了宝贵的结构洞察力，但它们描绘了一种或几个静态表示。然而，ErbB生物功能固有的是酶不活跃和活性酪氨酸激酶之间的必要过渡，调用激酶单体结构和分子内相互作用的动态变化。因此，进行了MD模拟，以探寻EGFR酪氨酸激酶域的动态性质，包括野生型结构、引入的+ELREA缺失突变和A702V突变。这些模拟成功地阐明了这些突变在结构中可能发挥的作用，以及它们对酪氨酸激酶域的构象的影响将会导致在实验中观察到的EGFR激酶活性增加。

该协议中的一个关键步骤是使用相关结构来评估突变的影响。选择相关模拟输入结构的一个方法，是可视化静态 3D 结构中突变的位置，并检查其对相邻氨基酸和结构单元的可能影响。例如，在这项研究中，由于A702V EGFR突变位于形成非对称二聚体接口的柔和性B段，因此使用二聚体结构进行模拟与单体相比至关重要。使用单体结构会将接收器激酶的朱斯特门巴内B段暴露在溶剂中，从而剥夺其稳定相互作用，突变增强为更大的疏水残留物，以及从活化剂激酶的C-lobe残留物与二氧核酸941相互作用。此外，值得注意的是，PDB文件中的坐标表示的三D结构不一定与应用于研究的生物学相关结构相对应对应。例如，使用 ErbB4 的结构，PDB 代码 3BCE，PDB 坐标对应于修剪器，但这是由于晶体触点（可视化此结构时可以看到单体之间的接触很少）。PDB文件中的矩阵可用于重建晶体学相关的结构，这些结构可以可视化，以识别与原始出版物⁴²中报告的与生物相关的3D结构对应的链。该协议的另一个基本步骤是正确准备模拟输入结构，例如在不同的循环区域，特别是在突变附近建立缺失的氨基酸。尽管 PDB 中存在许多野生类型的 EGFR 结构，但只有有限数量的突变 EGFR 结构可用。因此，突变结构也需要建模;对于像A702V这样的单个残留物突变，奇梅拉被用来改变残留物;而对于[ELREA]删除突变，则使用了建模器。

模拟输入文件使用的各种参数（例如，最小化周期数、一次加热到所需温度或通过几个中间温度缓慢加热、平衡和生产模拟的时间段）可以根据研究分子、工作目标以及自己的偏好进行修改。在执行 MD 仿真时，也经常出现输入文件、与使用中的仿真软件相关的问题甚至用户错误等错误。因此，通过仔细检查任何错误消息来了解错误的来源非常重要。大多数模拟程序都有一个邮件列表，用户可以在其中向软件开发人员和其他用户提出问题，通过这些列表可以解决大多数问题。此外，用户手册为理解仿真协议的详细信息（包括假设和限制）提供了大量帮助。尽管MD模拟是探索分子动态特性的重要工具，但请记住，计算结果需要与其他信息来源一起仔细评估，以评估其有效性。只要有可能，就与研究所研究的蛋白质的专家合作，特别是在进行相关的湿实验室实验研究的情况下，为结构解释提供结果，并建议基于结构观测进行的实验，以测试假设。

在这项研究中，该协议有效地检查了埃勒雷亚和A702V突变对EGFR激酶结构的动态结构影响。仿真显示，μELREA 抑制功能上必需的 +C 螺旋，并促进从非活动激酶到稳定活性激酶的构象变化。仿真结果由药物反应数据独立支持，该数据证明酪氨酸激酶抑制剂对具有[ELREA缺失突变和野生型EGFR的]肺癌细胞系的影响，其中，识别活性激酶相一致的药物比野生型EGFR¹²报告为抗活激酶符合性的药物，其抑制作用更大。随着A702V突变，MD仿真表明，与野生类型相比，活化-接收方激酶接口的稳定性有所提高，活化剂和接收方激酶相互关联性更高，共同支持EGFR激酶的活性构象的维持。A702V突变位于接收方激酶的并列乙基段上，将增加与活化剂激酶的疏水性相互作用，从而延长激活状态的持续时间。A702V突变在没有生长 因子的情况下支持 细胞存活，并在EGFR突变9的体外筛选^中鉴定。

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

这项研究由芬兰科学院（308317、32005）、西格丽德·朱塞柳斯基金会和托、乔和彭蒂·博格纪念基金以及芬兰科学院（274728、316796）、芬兰癌症基金会和图尔库大学中央医院的K.E.资助。M.Z.T.由奥博·阿卡德米信息与结构生物学博士网络资助。我们感谢CSC IT 科学中心的计算资源，感谢朱卡·莱赫托宁博士在芬兰生物中心生物信息学网络下提供 IT 支持;和生物中心芬兰结构生物学基础设施网络。

Materials

Amber software	University of California, San Francisco	Version 2018	Executable
Chimera program	Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics at the University of California, San Francisco	Version 1.13.1	Executable
EGFR struture files	The Protein Data Bank		3D coordinates of EGFR structures
Maestro	Schrödinger LLC	Version 2018-3	Executable
Modeller program	The Andrej Šali Lab, Departments of Biopharmaceutical Sciences and Pharmaceutical Chemistry, University of California San Francisco		Included in the Chimera program
VMD software	Theoretical and Computational Biophysics Group, University of Illinois at Urbana-Champaign	Version 1.9.3	Executable

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Tamirat, M. Z., Kurppa, K. J., Elenius, K., Johnson, M. S. Deciphering the Structural Effects of Activating EGFR Somatic Mutations with Molecular Dynamics Simulation. J. Vis. Exp. (159), e61125, doi:10.3791/61125 (2020).

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