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Behavior

Flypub estuda desinibição comportamental induzida pelo etanol e sensibilização

Published: May 18, 2020
doi:
10.3791/61123
, , , , ,
1Department of Biological Sciences,University of Texas at El Paso

Summary

O ensaio Flypub mede os comportamentos que a mosca da fruta Drosophila melanogaster exibe sob a influência do etanol. O ensaio pode ser facilmente dominado por experimentadores em todos os níveis e aplicado a vários estímulos vaporizados, facilitando o abuso de substâncias e estudos de dependência.

Abstract

O transtorno do uso de álcool (AUD) continua sendo um problema sério em nossa sociedade. Para desenvolver intervenções eficazes para o vício, é importante compreender os mecanismos neurobiológicos subjacentes, para os quais são necessárias diversas abordagens experimentais e sistemas modelo. O principal ingrediente das bebidas alcoólicas é o etanol, que causa alterações adaptativas no sistema nervoso central e comportamento na ingestão crônica. A sensibilização comportamental (ou seja, respostas escalonadas) representa, em particular, uma mudança adaptativa chave subjacente ao vício. A maioria dos estudos de sensibilização comportamental induzidos pelo etanol em modelos animais tem sido conduzida sobre o efeito ativador locomotor do etanol. Um efeito proeminente do etanol é a desinibição comportamental. A sensibilização comportamental para o efeito de desinibição do etanol, no entanto, é sub-representada. Para resolver essa questão, desenvolvemos o ensaio Flypub que permite medir o aumento escalonado das atividades desinibidas de namoro após a exposição recorrente ao etanol em Drosophila melanogaster. Aqui, relatamos o ensaio passo-a-passo da Flypub, incluindo montagem de câmaras de exposição ao etanol, montagem da estação de ensaio, critérios para cuidados e coleta de moscas, entrega de etanol, quantificação de atividades decorte desinibidas, processamento de dados e análise estatística. Também são fornecidas como solucionar etapas críticas, superar limitações e expandir sua utilidade para avaliar comportamentos adicionais induzidos pelo etanol. O ensaio flypub em combinação com poderosas ferramentas genéticas em Drosophila melanogaster facilitará a tarefa de descobrir o mecanismo subjacente à sensibilização comportamental induzida pelo etanol.

Introduction

O álcool é uma das drogas mais facilmente disponíveis e amplamente consumidas no mundo. Tem alto potencial para uso indevido e vício; no entanto, o mecanismo subjacente a esse processo permanece incompletamente compreendido. O etanol induz desinibição, euforia, comprometimento cognitivo, hiperatividade, perda de controle motor e sedação em vermes1, moscas de frutas1,2,3, ratos4, ratos5 e humanos6, indicando componentes neurobiológicos comuns mediando os efeitos do etanol de invertebrados para mamíferos, incluindo humanos. A ingestão crônica de etanol causa adaptações neurais e modificações comportamentais que sustentam aud. Uma das adaptações é a sensibilização comportamental definida como a resposta aumentada com experiências repetidas de etanol7,8,9 ou outras substâncias viciantes10,11,12.

Ao longo das décadas, os estudos sobre a sensibilização comportamental induzida pelo etanol (EIBS) têm focado no efeito estimulante do locomotor, que é usado como proxy para uma resposta eufórica7,8,9,13. Por exemplo, ratos ou ratos em repetição (a cada 24, 48 ou 72 h) a administração do etanol exibem a atividade locomotor aumentada medida pela velocidade de caminhada8,,14,,15,,16,17,18,,19,,20,21. Da mesma forma, as moscas-das-frutas submetidas à segunda exposição ao vapor de etanol 4h após a primeira exposição exibem a resposta locomotor aprimorada medida pela velocidade de caminhada também22. Embora não haja informações sobre o mecanismo subjacente ao EIBS para o efeito estimulante do locomotor em moscas de frutas, os estudos em ratos e camundongos descobriram os componentes moleculares e de sinalização (por exemplo, os sistemas de dopamina, glutamato e GABA) bem como substratos neurais e circuito (por exemplo, a área tegmental ventral, núcleo accumbens, amígdala e córtex pré-frontal) que desempenham papéis importantes para o EIBS6,9,23.

A desinibição é um grande efeito do etanol e leva à manifestação de comportamentos tipicamente restritos. O efeito desinibidor é exercido nas funções motoras, emocionais, sociais, sexuais e cognitivas, o que pode levar a comportamentos sexuais inadequados, agressões verbais ou físicas e atos impulsivos em humanos e modelos animais24,25,26,27,28,29. A desinibição induzida pelo etanol tem sido investigada em modelos animais para estudos mecanicistas e incluem impulsividade motora e agressão em roedores e macacos, bem como a desinibição forrageante em vermes6,9,24,28,29,30. Demonstramos que as moscas das frutas apresentam comportamento sexual desinibido sob a influência do etanol31. Especificamente, machos selvagens raramente cortejam outros machos sem etanol31 e quando o fazem, os cortês rejeitam ativamente cortejar machos. Sob a influência do etanol, no entanto, as moscas machos mostram mais namoro em relação a outros machos e os cortês exibem menos rejeição, resultando em um namoro intermasculino global. Notavelmente, as moscas desenvolvem sensibilização comportamental para o efeito de desinibição sobre a exposição recorrente ao etanol, que serve como um sistema único para estudar o EIBS31,32.

Neste relatório, descrevemos como configurar, executar, solucionar problemas e analisar o ensaio e os dados do Flypub para estudar a desinibição e sensibilização induzida pelo etanol na mosca da fruta Drosophila melanogaster. Para fornecer sua utilidade e eficácia, testamos o tipo selvagem Canton-S (CS; cepa de mosca de controle) juntamente com as moscas deficientes em tyramina β hidroxilase (tβh) que sintetiza octopamina (OA). OA é um grande neuromodulador em invertebrados33,34 e desempenha um papel fundamental no desenvolvimento da tolerância ao etanol em moscas22. Informamos aqui, pela primeira vez, que a OA é importante para o EIBS.

Protocol

NOTA: A seção de protocolo detalha as etapas preparatórias, de ensaio e análise da Flypub que incluem (1) montagem da câmara, (2) cuidados e coleta de moscas, (3) configuração da estação de ensaio, (4) exposição ao etanol, (5) pontuação de namoro e análise de dados, e (6) análise estatística. Os passos-chave para a condução do ensaio e análise flypub são retratados em um fluxo de trabalho (Figura 1). 1. Montagem da câmara (Figura 2) Corte a parte inferior da garrafa de Drosophila redonda na marca de 25 mL usando uma lâmina de barbear. Faça um furo, 5 mm de diâmetro, na marca de 50 mL da garrafa usando um ferro de solda quente.NOTA: Este é o ponto de acesso onde as moscas serão transferidas para a câmara. Corte uma folha de malha em um círculo de 54 mm de diâmetro, para caber na garrafa de Drosophila na marca de 75 mL. Fixar a malha na marca de 75 mL da garrafa usando cola quente. Corte a folha de plástico de policarbonato em um círculo de 70 mm de diâmetro. Coloque a folha de plástico de policarbonato na garrafa na marca de 25 mL (área aberta inferior feita na etapa 1.1) usando cola quente. Pressão para baixo usando pesos para garantir que a rodada de policarbonato esteja firmemente presa à parte inferior. Lave os bares com etanol para remover quaisquer odores e enxágue-os várias vezes sob água destilada. Agite vigorosamente os bares para remover o excesso de água. Seque os bares colocando-os horizontalmente em toalhas de papel à temperatura ambiente. 2. Cuidados com moscas e coleta Mantenha as moscas em um meio alimentar padrão de farinha de milho/ágar/açúcar/levedura (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/harvardfood.html). Coletar moscas machos de um a dois dias de idade em um grupo de 33, que representam um ponto de dados, sob anestesia de dióxido de carbono (CO2). Certifique-se de selecionar as moscas com morfologia intacta e colocá-las em um frasco de comida para recuperar.NOTA: Mais duas ou três moscas a menos por grupo são toleráveis. Comportamentos podem ser sensíveis a configurações experimentais, portanto, um número total de moscas por pub pode precisar ser ajustado com uma linha de vôo de controle.NOTA: Certifique-se de que o frasco de comida esteja deitado ao lado para que as moscas anestesiadas não grudem na comida. Mantenha as moscas na incubadora de 25 °C com pelo menos 50% de umidade relativa e um ciclo escuro de 12 horas / 12 h durante 2 dias antes da exposição ao etanol.NOTA: A liberação de CO2 é fundamental para eliminar quaisquer efeitos fisiológicos ou comportamentais induzidos por CO2que possam alterar as respostas induzidas pelo etanol. Use códigos para cegar genótipos de voo ou condições de tratamento para os experimentadores que conduzem a exposição ao etanol e marcar comportamentos de namoro.NOTA: Testes cegos ajudam a eliminar viés experimental. 3. Estação de ensaio configurada(Figura 3A) Configure um suporte de cópia com um braço central anexado em um topo de banco em uma sala bem ventilada.NOTA: O suporte de cópia não é obrigatório. Qualquer dispositivo de encenação que forneça uma plataforma de nível é suficiente. Fixar os dois braços laterais ao suporte, com cada braço aproximadamente 18 cm para fora do centro do suporte. Coloque uma luz fluorescente em cada braço do suporte e uma no meio. Conecte o gravador de vídeo ao braço central, aproximadamente 38 cm acima do centro da base. Isso vai gravar os bares de uma vista superior. Cubra a base do suporte com papel branco, que ajuda a visualizar moscas de cor escura para criar contraste. Durante o dia de exposição, acenda as luzes fluorescentes e o computador conectado à câmera de vídeo que está ligada ao suporte de cópia(Figura 3A).NOTA: A intensidade da luz 2100-2200 lux proporciona boa qualidade de comportamentos registrados para pontuação. No entanto, as condições de iluminação ambiente em laboratório são suficientes para observar as atividades de namoro induzidas pelo etanol. Prepare os itens a serem utilizados para exposição ao etanol retratado na Figura 3B. Reúna seis pubs limpos e montados para um conjunto de experimentos e rotule-os com o código 1 a 6.NOTA: Certifique-se de colocar os códigos aleatórios em genótipos de mosca ou condições de tratamento. 4. Exposição ao etanol(Figura 3) Transfira suavemente um grupo de 33 machos para uma câmara Flypub através do orifício na marca de 50 mL usando um pequeno funil.NOTA: Para minimizar o estresse mecânico às moscas, coloque uma almofada de rato ou qualquer material de amortecimento sob o pub durante a transferência. Cubra o buraco com uma fita.NOTA: A fita é usada para fechar o buraco, evitando que as moscas escapem do pub. Alinhe os bares no palco de 1 a 6. Aclimatar as moscas para a câmara por 10 min(Figura 3D). Ajuste as configurações da câmera, incluindo o foco, zoom e brilho, e grave os últimos 5 min de aclimatação para medir um nível de namoro basal.NOTA: Para eliminar o brilho gerado pelo reflexo da luz de um pub, coloque lenços de laboratório (tipicamente 4 camadas ou menos de 1 mm de espessura) na parte inferior do pub para ajustar o ângulo. Prepare as almofadas de algodão para a entrega de etanol cortando uma almofada em quatro quadrantes iguais com uma tesoura limpa e, em seguida, corte os cantos para fazê-lo caber em uma placa de Petri durante a aclimatação(Figura 3C).NOTA: Não use as mãos nuas para manusear as almofadas de algodão. Use fórceps para manusear as almofadas de algodão para evitar qualquer transferência potencial de odores. Adicione uma almofada de algodão em cada placa de Petri. Adicione 1 mL de 95% de etanol a cada almofada de algodão, certifique-se de que a solução de etanol seja distribuída uniformemente em toda a área da almofada. Cubra com limpadores de laboratório de duas camadas para evitar a evaporação rápida do etanol. Coloque a pequena placa de Petri contendo a almofada de algodão encharcada de etanol e os lenços de laboratório de duas camadas através da abertura inferior do pub após a climatização. Alinhe os pubs no palco, comece a gravar e inicie simultaneamente um temporizador. Registre os bares contendo moscas durante a exposição ao etanol até que as moscas parem de cortejar ou se mover devido à sedação. Remova a placa de Petri contendo etanol de cada pub com uma espátula quando mais de 90% das moscas estiverem sedadas. Transferência suavemente voa de volta para seus frascos atribuídos através do buraco na marca de 50 mL no pub.NOTA: Coloque um funil em cima dos frascos de alimentos para ajudar na transferência. Certifique-se de colocar moscas sedadas ao lado dos frascos de comida para evitar que elas grudem na comida. Limpe os bares com etanol para remover quaisquer odores e enxágue-os várias vezes sob água destilada em funcionamento. Agite vigorosamente os bares para remover o excesso de água. Seque os bares colocando-os horizontalmente em toalhas de papel à temperatura ambiente. Mantenha as moscas na incubadora de 25 °C com pelo menos 50% de umidade relativa e um ciclo escuro de 12 horas/ 12 h. Repita as etapas 4.1-4.17 a cada 24h por seis dias consecutivos e certifique-se de realizar a exposição ao etanol na mesma hora do dia para evitar quaisquer efeitos circadianos.NOTA: Troque os frascos de alimentos a cada 2 a 3 dias para manter moscas saudáveis. 5. Pontuação de corte e análise de dados(Figura 4-6) Abra os vídeos gravados usando um media player (por exemplo, VLC) e amplie o vídeo para observar claramente moscas para marcar(Figura 4A). Anexar o código de tempo ao vídeo(Figura 4B). Conte o número de homens envolvidos em atividades de namoro, incluindo a seguir, extensão unilateral da asa, cadeia de namoro, círculo de namoro, dobra abdominal e montagem para cada 10 s tempo bloco31 (Figura 5). Digite o número de homens exibindo namoro para cada bloco de tempo de 10 s em uma planilha(Figura 6A). Use o número máximo de homens cortejando nos três blocos de tempo consecutivos de 10 s como um ponto de dados representativo(Figura 6B). Calcule a média de 10 pontos de dados consecutivos com o maior valor (Figura 6C) e isso representa a porcentagem de namoro intermasculino por pub (Figura 6A). 6. Análise estatística (Figura Suplementar 1) Abra o software de análise estatística (por exemplo, Minitab 17) e adicione dados de namoro na planilha.NOTA: Qualquer software de análise estatística pode ser usado. Para determinar a distribuição dos dados (distribuição normal ou não normal), vá para a guia Estatística, selecione Estatísticas Básicase clique na opção Teste de Normalidade (Figura Suplementar 1Ai). Em Variável,selecione colunas individuais (cada coluna representando um conjunto de dados de um genótipo ou tratamento em estudo), escolha o teste Anderson-Darling e clique em OK (Figura Suplementar 1Aii).NOTA: O Gráfico de Probabilidade de Normalidade mostrará o Valor P calculado: se o Valor P for superior a 0,05, os dados serão normalmente distribuídos. Se o Valor P for inferior a 0,05, os dados serão não distribuídos normalmente (Figura Suplementar 1Aiii). Para comparação de vários grupos, empilhe as colunas para comparar clicando na guia Dados, selecione Pilhae, em seguida, Colunas (Figura Suplementar 1Bi). Na janela Colunas de pilha, selecione as colunas de dados a serem empilhadas, selecione o empilhamento feito em Nova planilha ou coluna da planilha atual com a próxima coluna designada para denotar subscript (por exemplo, identidade de grupo de dados; Figura Suplementar 1Bii-1Biii). Clique na guia Stat, selecione o teste ANOVA, selecione o Modelo Linear Geral e clique no Modelo Linear Geral de Ajuste (Figura Suplementar 1Ci). Na janela Modelo Linear Geral, selecione as colunas a serem comparadas na caixa Respostas, selecione a coluna com subscrito na caixa Fatores e clique em OK,o que leva aos resultados da análise estatística(Figura Suplementar 1Cii-1Ciii). Para comparação de dois grupos com dados normalmente distribuídos, clique na guia Estatística, selecione as Estatísticas Básicase selecione o teste t de 2-Amostra (Figura Suplementar 1Di). Na janela 2-Sample t para a janela Média, selecione Cada amostra está em sua própria coluna,a partir de uma caixa de entrada, selecione os dois grupos para comparar nas caixas Amostra 1 e Amostra 2 e, em seguida, clique em OK, o que leva aos resultados da análise estatística(Figura Suplementar 1Dii-1Diii). Para comparação de dois grupos com dados não-distribuídos normalmente, vá para a guia Stat, selecione Nonparametrics e clique em Mann-Whitney (Figura Suplementar 1Ei) Na janela Mann-Whitney, selecione os dois grupos para comparar nas caixas Primeira Amostra e Segunda Amostra e clique em OK, o que leva aos resultados da análise estatística(Figura Suplementar 1Eii-1Eiii). Para comparação de três ou mais grupos de dados não-distribuídos normalmente, vá para a guia Stat, selecione Nonparametricse, em seguida, clique no teste Kruskal-Wallis (Figura Suplementar 1Fi). Na janela Kruskal-Wallis, selecione as colunas a serem comparadas na caixa Resposta, selecione a coluna com subscrito na caixa Fator e clique em OK,o que leva aos resultados da análise estatística(Figura Suplementar 1Fii-1Fiii).

Representative Results

Esta seção demonstra os resultados de um experimento representativo da Flypub. Os machos drosophila raramente cortejam outros machos35,36. Durante a primeira exposição ao etanol, os machos do tipo selvagem Canton-S (CS)apresentaram um pequeno, mas insignificante aumento no namoro intermasculino desinibido31 (Figura 7A). No entanto, os machos de CS apresentaram aumentos escalonados na atividade desinibida do namoro nas exposições subseqüentes de etanol (ANOVA GLM, CS: R2=0,83, F(5,66) =65,21, p < 0,0001; n = 12; Figura 7A), que indica sensibilização comportamental para o efeito de desinibição do etanol. Já mostramos anteriormente que este tipo de EIBS requer dopamina e o receptor de dopamina DopEcR nos neurônios de cogumelos31,32. Para identificar se neuromoduladores adicionais estão envolvidos no EIBS, investigamos o papel da OA testando as moscas (tβh; nM18 null alelo)37,38 sem tyramine β hydroxylase, a enzima limitante da taxa na biossíntese da OA, portanto deficiente em OA. Os machos tβh no fundo genético CS (um presente gentil do Dr. Andreas Thum, Universidade de Leipzig , Alemanha) mostraram a resposta sensibilizada desinibida do namoro sobre as exposições diárias de etanol (ANOVA GLM, tβh: R2=0,67, F(5,66) =27,60, p < 0,0001; n = 12; Figura 7B) mas no nível reduzido em relação a CS (ANOVAGLM, efeito de interação: F =2,50, p <0,034). Após a análise pós-hoc, os machos tβh apresentaram níveis mais baixos de namoro intermasculino em cada exposição que é mais evidente durante a quarta a sexta exposição ao etanol quando comparado s CS (T-teste de duas amostras: p < 0,002 em EXP4, p < 0,004 em EXP5, p < 0,021 em EXP6; n = 12; Figura 7C). Juntos, esses resultados indicam que a OA pode desempenhar um papel no EIBS para o efeito de desinibição do etanol. Mais importante, esses conjuntos de dados demonstram claramente a utilidade e a eficácia do ensaio Flypub no estudo da desinibição e sensibilização induzida pelo etanol. Figura 1: Fluxo de trabalho de ensaio flypub. Um fluxo de trabalho que destaca as etapas-chave para a condução do ensaio Flypub. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: Materiais de câmara flypub e montagem. (A) Os materiais necessários para construir uma câmara Flypub incluem (i) cola de pistola de cola quente, (ii) pistola de cola quente, (iii) lâmina de barbear,(iv) ferro de solda,(v) régua,(vi) malha,(vii) folha de plástico de policarbonato, e(viii)garrafa de drosophila de fundo redondo. (B) Representação esquemmática da assembléia da câmara Flypub. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: Exposição ao etanol. (A)Uma estação Flypub totalmente montada. (B) Os materiais necessários para a exposição ao etanol incluem (i) micropipeta P1000, (ii) fita, (iii)viiialmofada de algodão, (iv) placa de petri,(v) lenços de laboratório,(vi) funil pequeno,(vii)funil médio,(ix) mouse pad,(x) tesoura,(xi) 95% etanol,(xii) fócepas e (xiii) espátula. (C) Passos sobre como cortar almofadas de algodão. (D) Imagem de visão superior dos pubs alinhados no palco. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4: Configuração de vídeo para pontuação comportamental. Mostrado é o guia passo-a-passo sobre (A) como ampliar no vídeo e (B) como inserir o arquivo de código de tempo no media player VLC para pontuação comportamental. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5: Comportamentos de namoro masculino. Imagens representativas ilustram os comportamentos de namoro masculino de Drosophila, incluindo a extensão da asa seguinte e unilateral para (A) canção de namoro, (B) cadeia de namoro, (C) círculo de namoro(D) dobra abdominal e (E) montagem que são usados para pontuação comportamental. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 6: Entrada e análise de dados. (A) O número de homens envolvidos em namoro em cada bloco de tempo de 10 s é transcrito em uma planilha. O maior número de homens cortejando três blocos de tempo consecutivos de 10 s (arqueiro verde) é usado como um ponto de dados representativo. A média de 10 pontos de dados consecutivos (faixa azul ou laranja) com o valor máximo representa a porcentagem de namoro intermasculino por pub [parêntese laranja; MAX (média), seta preta). (B,C) As fórmulas da planilha utilizadas para calcular o ponto máximo de dados representativos e a média máxima de 10 pontos de dados representativos consecutivos por pub. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 7: Etanol induziu desinibição comportamental e sensibilização em SC e tβh. (A,B) Os machos CS e tβh apresentaram desinibição sensibilizada do namoro com repetidas exposições de etanol (ANOVA GLM, CS: R2=0,83, F(5,66)=65,21, p < 0,0001; tβh: R2=0,67, F(5,66)=27,60, p < 0,0001; n = 12). (C) Os machos tβh apresentaram menor namoro desinibido em comparação com CS (n=12). Os valores p das análises pós-hoc são mostrados acima da linha. A atividade de namoro intermasculino foi analisada a partir dos vídeos gerados para cada exposição ao etanol. Todos os dados são relatados como meios ± erro padrão da média. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura Suplementar 1: Análise estatística. As etapas do software Minitab 17 sobre como realizar o teste de normalidade (A) (B) empilhando os dados, (C) Teste de modelo linear geral ANOVA, (D) Teste t de duas amostras,(E) teste Mann-Whitney e (F) Teste Kruskal-Wallis. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

Neste relatório, descrevemos a configuração e o protocolo detalhado do ensaio flypub; um novo método para medir como a exposição recorrente ao etanol desencadeia o namoro desinibido e a sensibilização comportamental. Embora o ensaio flypub seja relativamente simples, várias etapas requerem cuidado e atenção para garantir resultados confiáveis. Em primeiro lugar, as moscas para testes devem ser totalmente pigmentadas (ou seja, moscas adultas totalmente desenvolvidas), saudáveis e intactas. Deformidades ou danos especialmente em suas asas ou pernas podem afetar a capacidade do macho de cortejar. Em segundo lugar, a idade da mosca é importante e deve ser comparada entre os grupos controle e experimental (idade ideal: 3-5 dias de idade na exposição ao etanol 1). Duas semanas e moscas machos selvagens mais velhas tendem a exibir os níveis elevados de namoro desinibido31. Assim, a correspondência etária adequada das moscas em estudo é essencial para evitar resultados variáveis. Em terceiro lugar, o número de moscapor pub é vital (ótimo: 33 por pub). Os números de moscas mais baixos ou mais altos por pub podem distorcer muito as pontuações de namoro (dados não mostrados). Em quarto lugar, as câmaras Flypub precisam ter volumes idênticos como ilustrado na Figura 2B. Isso garante que as moscas recebam vapor de etanol de forma sincronizada e os comportamentos provocados sejam consistentes. Em quinto lugar, a gravação de vídeo clara e a pontuação precisa do namoro são essenciais. Este protocolo depende fortemente de observações comportamentais, por isso a observância meticulosa ao protocolo padronizado de pontuação do namoro é fundamental para minimizar resultados inconsistentes. Por fim, é altamente recomendável que tanto a exposição ao etanol quanto as etapas de pontuação do namoro sejam realizadas às cegas, onde um experimentador desconhece genótipos de moscas ou tratamentos experimentais, evitando assim viés experimental.

O ensaio flypub tem múltiplas vantagens. Em primeiro lugar, vários grupos de moscas podem ser testados e comparados simultaneamente. Em segundo lugar, é barato, simples de configurar e fácil de aprender, tornando-se altamente passível para experimentadores em todos os níveis, incluindo ensino fundamental, estudantes de graduação e pós-graduação, pós-doutores e professores, bem como laboratórios de ensino com espaço e orçamentos limitados. Em terceiro lugar, pode ser utilizado para medir comportamentos adicionais como o namoro desinibido de moscas fêmeas e o efeito sedativo do etanol ou outros sedativos para avaliar a sensibilidade inicial e o desenvolvimento e manutenção da tolerância31,32. Juntos, o Flypub é um método versátil para estudar diversas características da AUD.

A maior limitação do ensaio flypub é o rigoroso e trabalhoso regime de pontuação de namoro. O comportamento de namoro sob a influência do etanol é altamente dinâmico de uma forma que a duração do namoro varia de menos de um segundo a muitos minutos e as moscas envolvidas no namoro estão mudando com bastante freqüência. O regime de pontuação aqui apresentado foi desenvolvido para incorporar essa natureza dinâmica e fornecer pontuações consistentes sobre exposições individuais de etanol para um determinado genótipo31,32. Conforme observado no protocolo, a atividade de namoro é pontuada manualmente, o que é demorado. Vários programas de pontuação automatizados foram desenvolvidos para facilitar a triagem comportamental imparcial e todos os quais dependem de movimentos e locais individuais de moscas39,,40,,41,,42,,43,,44,45. Também tentamos desenvolver um software de computador para contar automaticamente a atividade do namoro, mas não conseguimos obter resultados consistentes e confiáveis. Isso pode ser devido ao fato de que a pontuação comportamental inclui múltiplos passos de namoro (ou seja, seguindo, extensão unilateral da asa, dobra abdominal e montagem)35,36,46 de múltiplas moscas ao mesmo tempo. Mesmo com essa limitação, um experimentador com treinamento adequado deve ser capaz de quantificar os comportamentos de namoro induzidos pelo etanol com consistência e precisão. No entanto, seria de grande ajuda e importância adotar aprendizado de máquina ou outros algoritmos avançados como acompanhamento.

Semelhante aos modelos de roedores, os estudos sobre etanol no modelo de mosca têm focado em grande parte nos efeitos estimulantes e sedativos do etanol. O ensaio flypub, no entanto, mede o namoro desinibido, um tipo de desinibição cognitiva que é o romance31,32. Portanto, o Flypub pode ajudar a elucidar os jogadores moleculares, vias celulares e circuitos neurais, bem como os fatores de risco (por exemplo, idade, sono, dieta ou ambiente social) críticos para desinibição comportamental e sensibilização. Já demonstramos anteriormente que a sinalização de dopamina é necessária para o EIBS, que está em consonância com os achados em modelos de roedores e indivíduos humanos6,9,31. Também como prova de conceito, examinamos o mutante tβh sem OA (a contrapartida invertebrada da norepinefrina) e descobrimos que a OA também é importante para a sensibilização comportamental para o efeito de desinibição do etanol, embora sua contribuição seja relativamente pequena em comparação com a da dopamina31. Este achado contrasta com a observação de Scholz47 de que as moscas mutantes tβh não apresentam prejuízos óbvios na sensibilização ao efeito ativador locomotor do etanol47. Isso sugere caminhos moleculares, celulares e neurais distintos mediando a sensibilização comportamental para a desinibição versus ativação locomotor. Estudos de acompanhamento devem colaborar ainda mais com essa noção tentadora.

Em resumo, o Flypub é um método de baixo custo, multifacetado e eficaz para investigar as respostas comportamentais ao etanol, particularmente a desinibição e a sensibilização comportamental, que podem ajudar a avançar nossa compreensão da AUD e fornecer insights sobre intervenções eficazes para este transtorno crônico.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pelas bolsas NIAAA 1R15AA020996, NIMH R21MH109953, Brain & Behavior Research Foundation NARSAD e NIMHD 2G12MD007592 NMD Cluster. Também somos gratos ao programa RISE financiado pelo NIH (NIGMS 5R25GM069621) por apoiar o NMD e o CMS, o programa UTEP COURI-SURPASS para apoiar o NMD, o programa MARC financiado pelo NIH (NIGMS 2T34GM008048-31) por apoiar a AA, e o Dr. Keelung Hong Graduate Fellowship para apoiar o EBS. Agradecemos muito o departamento de comunicação da UTEP: Darlene Barajas, Christian Rivera, Karina Moreno, José Loya Fernandez e o departamento de Música: Stephen A. Haddad por sua ajuda na produção de vídeo e dublagem. Por último, somos muito gratos ao Dr. Andreas Thum por compartilhar o mutante tβh no fundo canton-s junto com o controle das moscas canton-S; e Jessica Burciaga por sua valiosa contribuição para os estudos iniciais sobre octopamina e os membros do laboratório Han para discussão e apoio.

Materials

95 % Ethanol VWR Chemicals BDH1158-4LP
Canton-S – – wild-type strain used as a control
Copy stand with arms Kaiser 205411 model RS 2-XA, with one central arm and two lateral arms; to set up a flypub station
Cotton rounds Swisspers COT-027 to deliver ethanol
Excel Microsoft – to analyze data; any worksheet or spreadsheet software can be used
Fluorescent light bulb Lights of America 7108N maximum (120 V-70 W Max.); to illuminate the flypub station
Microsoft LifeCam software Microsoft – version 3.60; to videotape flypubs
Microsoft LifeCam Studio Microsoft Q2F-00013 1080P HD sensor; to videotape flypubs
Minitab 17 Minitab – version 17; to conduct statistical analysis; any statistical analysis software can be used
Nylon mesh sheet Sefar Nitex – model B0043D1TVY, opaque white, 200 microns mesh; to make a flypub
Petri dishes Falcon 08-757-100A 35 x 10 mm; to deliever ethanol
Plastic funnel – mid size Fisher scientific 10-348A 65 mm diameter and 67 mm height; to transfer sedated flies from a flypub into a food vial
Plastic funnel – small Fisher scientific 07-202-121 4 mm diameter and 46 mm height; to transfer flies from a vial into a flypub
Polycarbonate sheet Lexan – 0.762 mm thickness, clear, 610 x 1220 mm Nominal; to make a flypub
Round-bottom bottle Fisher scientific AS115 polypropylene, 103 mm height, 60 mm diameter and 177 ml capacity; to make a flypub
Soldering iron Weller WES51 to make a hole in a flypub
Time code – – .smi file, a subtitle ticking timecode created in Han lab; to monitor time during courtship scoring; any time subtitles may be used
Tyramine b hydroxylase (tbh) – – mutant fly strain (nM18 null allele)deficient in tbh in the wild-type Canton-S background ; obtained from Dr. Andreas Thum (University of Leipzig, Leipzeig, Germany)
VLC media player VideoLAN – version 3.0.8; any media player can be used to score courtship
DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Delgado, N. M., Sierra, C. M., Arzola, A., Saldes, E. B., Han, K., Sabandal, P. R. Flypub To Study Ethanol Induced Behavioral Disinhibition and Sensitization. J. Vis. Exp. (159), e61123, doi:10.3791/61123 (2020).
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