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Behavior

Flypub étudier l’éthanol induit la désinhibition comportementale et la sensibilisation

Published: May 18, 2020
doi:
10.3791/61123
, , , , ,
1Department of Biological Sciences,University of Texas at El Paso

Summary

L’essai Flypub mesure les comportements que la mouche des fruits Drosophila melanogaster affiche sous l’influence de l’éthanol. L’essai peut être facilement maîtrisé par des expérimentateurs à tous les niveaux et appliqué à divers stimuli vaporisés, facilitant l’abus de substances et les études de toxicomanie.

Abstract

Le trouble de consommation d’alcool (AUD) demeure un problème grave dans notre société. Pour développer des interventions efficaces pour la toxicomanie, il est important de comprendre les mécanismes neurobiologiques sous-jacents, pour lesquels diverses approches expérimentales et systèmes modèles sont nécessaires. L’ingrédient principal des boissons alcoolisées est l’éthanol, qui provoque des changements adaptatifs dans le système nerveux central et le comportement sur l’apport chronique. La sensibilisation comportementale (c.-à-d. l’escalade des réponses) en particulier représente un changement adaptatif clé sous-jacent à la dépendance. La plupart des études de sensibilisation comportementale induites par l’éthanol dans les modèles animaux ont été menées sur l’effet d’activation locomoteur de l’éthanol. Un effet proéminent de l’éthanol est la désinhibition comportementale. La sensibilisation comportementale à l’effet désinhibition de l’éthanol, cependant, est sous-représentée. Pour résoudre ce problème, nous avons développé l’essai Flypub qui permet de mesurer l’augmentation de l’augmentation des activités de cour désinhibées sur l’exposition récurrente à l’éthanol dans Drosophila melanogaster. Ici, nous rapportons l’essai Flypub étape par étape comprenant l’assemblage des chambres d’exposition à l’éthanol, la configuration de la station d’analyse, les critères pour les soins et la collecte des mouches, la livraison d’éthanol, la quantification des activités de cour désinhibées, le traitement des données et l’analyse statistique. Sont également fournis comment dépanner les étapes critiques, surmonter les limitations et étendre son utilité pour évaluer les comportements supplémentaires induits par l’éthanol. L’essai Flypub en combinaison avec de puissants outils génétiques dans Drosophila melanogaster facilitera la tâche de découvrir le mécanisme sous-jacent à l’éthanol induit la sensibilisation comportementale.

Introduction

L’alcool est l’une des drogues les plus facilement disponibles et largement consommées au monde. Il a un fort potentiel d’abus et de dépendance; cependant, le mécanisme sous-jacent à ce processus reste incomplet. L’éthanol induit la désinhibition, l’euphorie, l’affaiblissement cognitif, l’hyperactivité, la perte de contrôle moteur et la sédation dans les vers1, les mouches des fruits1,2,3,les souris4, les rats5 et les humains6, indiquant les composants neurobiologiques communs médiateur des effets de l’éthanol des invertébrés aux mammifères, y compris les humains. La prise chronique d’éthanol provoque des adaptations neuronales et des modifications comportementales qui sous-tendent AUD. L’une des adaptations est la sensibilisation comportementale définie comme la réponse augmentée avec des expériences répétées d’éthanol7,8,9 ou d’autres substances addictives10,11,12.

Au fil des décennies, les études sur la sensibilisation comportementale induite par l’éthanol (EIBS) se sont concentrées sur l’effet locomoteur-stimulant, qui est utilisé comme un proxy pour une réponse euphorique7,8,9,13. Par exemple, les rats ou les souris sur répété (tous les 24, 48 ou 72 h) l’administration de l’éthanol affichent l’activité locomotrice augmentée mesurée par la vitesse de marche8,14,15,16,17,18,19,20,21. De même, les mouches des fruits soumises à la deuxième exposition à la vapeur d’éthanol 4 h après la première exposition montrent la réponse locomotrice améliorée mesurée par la vitesse de marche ainsique 22. Bien qu’aucune information n’est disponible sur le mécanisme sous-jacent EIBS à l’effet locomoteur-stimulant chez les mouches des fruits, les études chez les rats et les souris ont mis au jour les composants moléculaires et de signalisation (par exemple, les systèmes dopamine, glutamate et GABA) ainsi que les substrats et circuits neuronaux (par exemple, la zone tegmentale ventrale, les accumbens du noyau, l’amygdale et le cortex préfrontal) qui jouent un rôle majeur pour l’EIBS6,9,23.

La désinhibition est un effet majeur de l’éthanol et conduit à la manifestation des comportements qui sont généralement restreints. L’effet désinhibant est exercé sur les fonctions motrices, émotionnelles, sociales, sexuelles et cognitives, ce qui peut conduire à un comportement sexuel inapproprié, une agression verbale ou physique et des actes impulsifs chez les humains et les modèles animaux24,25,26,27,28,29. La désinhibition induite par l’éthanol a été étudiée dans des modèles animaux pour des études mécanistes et elles incluent l’impulsivité motrice et l’agression chez les rongeurs et les singes ainsi que la désinhibition de recherche de nourriture dans les vers6,9,24,28,29,30. Nous avons démontré que les mouches des fruits montrent un comportement sexuel désinhibé sous l’influence de l’éthanol31. Plus précisément, les mâles de type sauvage volent rarement courtiser d’autres mâles sans éthanol31 et quand ils le font, les tribunaux rejettent activement la cour des mâles. Sous l’influence de l’éthanol, cependant, les mouches mâles montrent plus de cour envers d’autres mâles et les tribunaux montrent moins de rejet, ce qui entraîne une cour intermale améliorée globalement. Notamment, les mouches développent une sensibilisation comportementale à l’effet de désinhibition sur l’exposition récurrente à l’éthanol, qui sert de système unique pour étudier EIBS31,32.

Dans ce rapport, nous décrivons comment mettre en place, effectuer, dépanner et analyser l’essai Flypub et les données pour étudier la désinhibition et la sensibilisation induites par l’éthanol dans la mouche des fruits Drosophila melanogaster. Pour fournir son utilité et son efficacité, nous avons testé le canton-S sauvage(CS; souche de mouche de commande) ainsi que les mouches déficientes en tyramine hydroxylase (th) qui synthétise l’octopamine (OA). L’œil est un neuromodulateur majeur chez les invertébrés33,34 et joue un rôle clé dans le développement de la tolérance à l’éthanol chez les mouches22. Nous rapportons ici pour la première fois que l’OA est importante pour l’EIBS.

Protocol

REMARQUE : La section du protocole détaille les étapes préparatoires, d’analyse et d’analyse de Flypub qui comprennent (1) l’assemblage de la chambre, (2) les soins et la collecte des mouches, (3) la configuration de la station d’analyse, (4) l’exposition à l’éthanol, (5) la notation de cour et l’analyse des données, et (6) l’analyse statistique. Les étapes clés pour effectuer l’essai et l’analyse Flypub sont représentées dans un flux de travail(figure 1). 1. Assemblée de la Chambre(figure 2) Couper la partie inférieure de la bouteille ronde Drosophila à la marque de 25 ml à l’aide d’une lame de rasoir. Faire un trou, de 5 mm de diamètre, à la marque de 50 ml de la bouteille à l’aide d’un fer à souder chaud.REMARQUE : C’est le point d’accès où les mouches seront transférées dans la chambre. Couper une feuille de maille en cercle de 54 mm de diamètre, pour tenir dans la bouteille de Drosophila à la marque de 75 ml. Fixez le maillage à la marque de 75 ml de la bouteille à l’aide de colle chaude. Couper la feuille de plastique en polycarbonate en cercle de 70 mm de diamètre. Attachez la feuille de plastique en polycarbonate à la bouteille à la marque de 25 ml (zone ouverte en bas réalisée à l’étape 1.1) à l’aide de colle chaude. Pression vers le bas à l’aide de poids pour s’assurer que le rond en polycarbonate est fermement attaché au fond. Laver les pubs avec de l’éthanol pour enlever les odeurs et les rincer abondamment plusieurs fois sous l’eau distillée en cours d’exécution. Secouez vigoureusement les pubs pour éliminer l’excès d’eau. Séchez les pubs en les posant horizontalement sur du papier essuie-tout à température ambiante. 2. Soins et collecte de mouches Maintenir les mouches sur un moyen standard de semoule de maïs/agar/sucre/levure (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/harvardfood.html). Recueillir un à deux jours mâles vole dans un groupe de 33, qui représentent un point de données, sous le dioxyde de carbone (CO2) anesthésie. Assurez-vous de sélectionner les mouches avec une morphologie intacte et de les mettre dans une fiole de nourriture pour récupérer.REMARQUE : Deux mouches de moins ou trois plus par groupe sont tolérables. Les comportements peuvent être sensibles aux paramètres expérimentaux, de ce qui, par pub, un nombre total de mouches par pub peut devoir être ajusté avec une ligne de commande.REMARQUE : Assurez-vous que la fiole de nourriture est posée sur le côté afin que les mouches anesthésiés ne soient pas collées à la nourriture. Gardez les mouches dans l’incubateur de 25 oC avec au moins 50% d’humidité relative et un cycle foncé de 12 h léger / 12 h pendant 2 jours avant l’exposition à l’éthanol.REMARQUE : Le dégagement de CO2 est essentiel pour éliminer tout effet physiologique ou comportemental induit par le CO2qui peut modifier les réponses induites par l’éthanol. Utilisez des codes pour aveugler les génotypes de mouche ou les conditions de traitement aux expérimentateurs qui effectuent une exposition à l’éthanol et notationnt des comportements de cour.REMARQUE : Les tests à l’aveugle aident à éliminer les biais expérimentaux. 3. Mise en place de la station Assay(figure 3A) Installez un support de copie avec un bras central attaché sur un dessus de banc dans une pièce bien ventilée.REMARQUE : Le support de copie n’est pas obligatoire. Tout dispositif de mise en scène qui fournit une plate-forme de niveau est suffisant. Serrez les deux bras latéraux jusqu’au stand, chaque bras à environ 18 cm du centre du stand. Placez une lumière fluorescente sur chaque bras du support et un au milieu. Attachez l’enregistreur vidéo au bras central, à environ 38 cm au-dessus du centre de la base. Cela enregistrera les pubs d’une vue de haut niveau. Couvrez la base du support avec du papier blanc, qui aide à visualiser les mouches de couleur foncée pour créer le contraste. Pendant la journée d’exposition, allumez les lampes fluorescentes et l’ordinateur connecté à la caméra vidéo qui est attachée au support de copie(figure 3A).REMARQUE: L’intensité lumineuse 2100-2200 lux fournit une bonne qualité des comportements enregistrés pour la notation. Cependant, les conditions d’éclairage ambiant en laboratoire sont suffisantes pour observer les activités de cour induites par l’éthanol. Préparer les articles à utiliser pour l’exposition à l’éthanol représentés dans la figure 3B. Rassemblez six pubs propres et assemblés pour une série d’expériences et étiquetez-les avec le code 1 à 6.REMARQUE : Assurez-vous de placer les codes randomisés sur les génotypes à la mouche ou les conditions de traitement. 4. Exposition à l’éthanol(figure 3) Transférer délicatement un groupe de 33 mâles dans une chambre Flypub à travers le trou à la marque de 50 ml à l’aide d’un petit entonnoir.REMARQUE : Pour minimiser le stress mécanique pour les mouches, placez un coussin de souris ou tout matériau d’amorti sous le pub pendant le transfert. Couvrir le trou d’une bande.REMARQUE : La bande est utilisée pour fermer le trou, empêchant les mouches de s’échapper du pub. Alignez les pubs sur la scène de 1 à 6. Acclimatez les mouches à la chambre pendant 10 min(figure 3D). Ajuster les paramètres de la caméra, y compris la mise au point, le zoom et la luminosité, et enregistrer les 5 dernières minutes d’acclimation pour mesurer un niveau de cour basale.REMARQUE : Pour éliminer l’éblouissement généré par la réflexion lumineuse d’un pub, placez les lingettes de laboratoire (généralement 4 couches ou moins de 1 mm d’épaisseur) au fond du pub pour ajuster l’angle. Préparer des tampons de coton pour la livraison d’éthanol en coupant un tampon en quatre quadrants égaux avec des ciseaux propres, puis coupez les coins pour le rendre insérer dans un plat Petri pendant l’acclimation(figure 3C).REMARQUE : N’utilisez pas les mains nues pour manipuler les tampons de coton. Utilisez des forceps pour manipuler les tampons de coton pour éviter tout transfert potentiel d’odeurs. Ajouter une garniture en coton dans chaque plat Petri. Ajouter 1 ml d’éthanol à 95 % à chaque tampon de coton, assurez-vous que la solution d’éthanol soit répartie uniformément sur toute la zone du tampon. Couvrir de lingettes de laboratoire à double couche pour éviter l’évaporation rapide de l’éthanol. Placer le petit plat Petri contenant la garniture de coton imbibée d’éthanol et les lingettes de laboratoire à double couche à travers l’ouverture inférieure du pub après l’acclimation. Alignez les pubs sur la scène, commencez à enregistrer et commencez simultanément une minuterie. Enregistrez les pubs contenant des mouches pendant l’exposition à l’éthanol jusqu’à ce que les mouches cessent de courtiser ou de se déplacer en raison de la sédation. Retirez le plat Petri contenant de l’éthanol dans chaque pub avec une spatule lorsque plus de 90 % des mouches sont sous sédatifs. Transférer délicatement les mouches vers leurs flacons assignés à travers le trou à la marque de 50 ml dans le pub.REMARQUE : Placez un entonnoir sur les flacons de nourriture pour faciliter le transfert. Assurez-vous de placer des mouches sous sédatifs sur le côté des flacons de nourriture pour les empêcher de se coincer dans la nourriture. Nettoyez les pubs avec de l’éthanol pour enlever les odeurs et les rincer abondamment plusieurs fois sous l’eau distillée en cours d’exécution. Secouez vigoureusement les pubs pour éliminer l’excès d’eau. Séchez les pubs en les posant horizontalement sur du papier essuie-tout à température ambiante. Gardez les mouches dans l’incubateur de 25 oC avec au moins 50% d’humidité relative et un cycle foncé de 12 h léger / 12 h. Répétez les étapes 4.1-4.17 tous les 24 h pendant six jours consécutifs et assurez-vous d’effectuer l’exposition à l’éthanol en même temps de la journée pour éviter tout effet circadien.REMARQUE : Changez les fioles de nourriture tous les 2 à 3 jours pour maintenir les mouches saines. 5. Analyse de la notation et des données de la cour(figure 4-6) Ouvrez les vidéos enregistrées à l’aide d’un lecteur multimédia (p. ex., VLC) et zoomez sur la vidéo pour observer clairement les mouches à marquer(figure 4A). Attachez le code de temps à la vidéo(figure 4B). Comptez le nombre d’hommes engagés dans des activités de cour, y compris la suite, extension unilatérale de l’aile, chaîne de cour, cercle de cour, flexion abdominale et montage pour chaque bloc de temps 10 s31 (figure 5). Entrez le nombre d’hommes affichant la cour pour chaque bloc de temps de 10 s dans une feuille de travail (figure 6A). Utilisez le nombre maximal d’hommes courtisants dans les trois blocs de temps consécutifs de 10 s comme point de données représentatif(figure 6B). Calculer la moyenne de 10 points de données consécutifs ayant la valeur la plus élevée(figure 6C) et cela représente le pourcentage de cour intermale par pub(figure 6A). 6. Analyse statistique (figure supplémentaire 1) Ouvrez le logiciel d’analyse statistique (p. ex., Minitab 17) et ajoutez des données de cour dans la feuille de travail.REMARQUE : Tout logiciel d’analyse statistique peut être utilisé. Pour déterminer la distribution des données (distribution normale ou non normale), rendez-vous sur l’onglet Stat, sélectionnez les statistiques de baseet cliquez sur l’option Normality Test (Figure supplémentaire 1Ai). Dans Variable, sélectionnez des colonnes individuelles (chaque colonne représentant un ensemble de données d’un génotype ou d’un traitement à l’étude), choisissez le test Anderson-Darling, et cliquez sur OK (Figure supplémentaire 1Aii).REMARQUE : La parcelle de probabilité de normalité affichera la valeur P calculée : si la valeur P est supérieure à 0,05, les données sont normalement distribuées. Si la valeur P est inférieure à 0,05, les données ne sont normalement pas distribuées(figure supplémentaire 1Aiii). Pour la comparaison de plusieurs groupes, empilez les colonnes à comparer en cliquant sur l’onglet Données, sélectionnez Stack,puis Colonnes (figure supplémentaire 1Bi). Dans la fenêtre Stack Columns, sélectionnez les colonnes de données à empiler, sélectionnez l’empilement effectué soit dans la nouvelle feuille de travail ou la colonne de la feuille de travail actuelle avec la colonne suivante désignée pour dénoter sous-scripte (p. ex., identité de groupe de données; Figure supplémentaire 1Bii-1Biii). Cliquez sur l’onglet Stat, sélectionnez le test ANOVA, sélectionnez le modèle linéaire général, puis cliquez sur le modèle linéaire général Fit (figure supplémentaire 1Ci). Dans la fenêtre Du modèle linéaire général, sélectionnez les colonnes à comparer dans la boîte de réponses, sélectionnez la colonne avec sous-scripte dans la boîte Facteurs et cliquez sur OK, ce qui conduit aux résultats d’analyse statistique(Figure supplémentaire 1Cii-1Ciii). Pour la comparaison de deux groupes avec des données normalement distribuées, cliquez sur l’onglet Stat, sélectionnez les statistiques de baseet sélectionnez le2-Échantillon t-test (figure supplémentaire 1Di). Dans le 2-Sample t pour la fenêtre moyenne, sélectionnez Chaque échantillon est dans sa propre colonne, à partir d’une case de dépôt, sélectionnez les deux groupes à comparer dans l’échantillon 1 et l’échantillon 2 boîtes, puis cliquez sur OK, ce qui conduit aux résultats d’analyse statistique(figure supplémentaire 1Dii-1Diii). Pour la comparaison de deux groupes avec des données non normalement distribuées, allez à l’onglet Stat, sélectionnez Nonparametrics et cliquez sur Mann-Whitney (Figure supplémentaire 1Ei) Dans la fenêtre Mann-Whitney, sélectionnez les deux groupes à comparer dans les cases First Sample et Second Sample, puis cliquez sur OK, ce qui conduit aux résultats d’analyse statistique(figure supplémentaire 1Eii-1Eiii). Pour la comparaison de trois groupes ou plus de données non normalement distribuées, allez à l’onglet Stat, sélectionnez Nonparametrics,puis cliquez sur le test Kruskal-Wallis (figure supplémentaire 1Fi). Dans la fenêtre Kruskal-Wallis, sélectionnez les colonnes à comparer dans la boîte de réponse, sélectionnez la colonne avec sous-scripte dans la case Factor et cliquez sur OK, ce qui conduit aux résultats d’analyse statistique(Figure supplémentaire 1Fii-1Fiii).

Representative Results

Cette section démontre les résultats d’une expérience Flypub représentative. Drosophila mâles rarement courtiser d’autres mâles35,36. Lors de la première exposition à l’éthanol, les mâles de type sauvage Canton-S (CS)ont montré une légère mais insignifiante augmentation de la cour intermale désinhibée31 (figure 7A). Cependant, les hommes de CS ont montré l’augmentation accrue de l’activité de cour désinhibée dans les expositions suivantes d’éthanol (ANOVA GLM, CS: R2’0.83, F(5,66) ‘65.21, p ‘lt; 0.0001; n 12; Figure 7A), qui indique la sensibilisation comportementale à l’effet de désinhibition de l’éthanol. Nous avons déjà montré que ce type d’EIBS nécessite de la dopamine et le récepteur de dopamine DopEcR dans les neurones champignons31,32. Pour déterminer si d’autres neuromodulateurs sont impliqués dans l’EIBS, nous avons étudié le rôle de l’œuvre d’oE en testant les mouches(th; nM18 allèle nul)37,38 manquant de tyramine hydroxylase, l’enzyme limitant le taux dans la biosynthèse de l’OA, donc déficiente en œd de œuvre. Les mâles del’école électronique de l’origine génétique du CS (un bon cadeau du Dr Andreas Thum, Université de Leipzig, Allemagne) ont affiché la réponse de cour désinhibée sensibilisée sur les expositions quotidiennes à l’éthanol (ANOVA GLM, th: R20,67, F(5,66) 27,60, p et lt; 0,0001; n 12; Figure 7B) mais au niveau réduit par rapport à CS (ANOVA GLM, effet d’interaction: F 2,50, p ‘lt;0.034). Lors de l’analyse post hoc, les mâles de th ont montré des niveaux inférieurs de cour intermale à chaque exposition qui est le plus évident au cours de la quatrième à la sixième exposition à l’éthanol par rapport à CS (Deux-échantillon t-test: p ‘lt; 0.002 dans EXP4, p ‘lt; 0.004 dans EXP5, p ‘lt; 0.021 dans EXP6; n 12; Figure 7C). Ensemble, ces résultats indiquent que l’œuvre d’oES peut jouer un rôle dans l’EIBS à l’effet de désinhibition de l’éthanol. Plus important encore, ces ensembles de données démontrent clairement l’utilité et l’efficacité de l’essai Flypub dans l’étude de la désinhibition et de la sensibilisation induites par l’éthanol. Figure 1 : Flux de travail d’essai de Flypub. Un diagramme de flux de travail mettant en évidence les étapes clés pour mener l’essai Flypub. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 2 : Matériel et assemblage de chambre Flypub. (A) Matériaux nécessaires pour construire une chambre Flypub comprennent (i) bâton de colle à colle chaude, (ii) pistolet à colle chaude, (iii) lame de rasoir, (iv) soudure fer, (v) règle, (vi) maille, (vii) feuille de plastique en polycarbonate, et (viii) bouteille de Drosophila à fond rond. (B) Représentation schématique de l’assemblée de chambre flypub. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 3 : Exposition à l’éthanol. (A) Une station Flypub entièrement assemblée. (B) Les matériaux requis pour l’exposition à l’éthanolxiiicomprennent (i) la micropipette P1000, (ii) ruban adhésif, (iii) coton pad, (iv) Petri plat, (v) lingettes de laboratoire, (vi) petit entonnoir, (vii) minuterie, (viii) entonnoir de taille moyenne, (ix) tapis de souris, (x) ciseaux, (xi) 95% d’ettholol, (xii) force (C) Étapes sur la façon de couper les tampons de coton. (D) Image de vue supérieure des pubs alignés sur la scène. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 4 : Configuration vidéo pour la notation comportementale. Montré est le guide étape par étape sur (A) comment zoomer sur la vidéo et (B) comment insérer le fichier timecode dans le lecteur multimédia VLC pour la notation comportementale. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 5 : Comportements de cour masculins. Les images représentatives illustrent les comportements de cour masculines Drosophila, y compris la suite et l’extension unilatérale de l’aile pour (A) chanson de cour, (B) chaîne de cour, (C) cercle de cour (D) flexion abdominale et (E) montage qui sont utilisés pour la notation comportementale. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 6 : Entrée et analyse des données. (A) Le nombre d’hommes engagés dans la cour dans le bloc de temps de chaque 10 s est transcrit dans une feuille de travail. Le plus grand nombre de mâles courtisant trois blocs de temps consécutifs de 10 s (flèche verte) est utilisé comme point de données représentatif. La moyenne de 10 points de données consécutifs (support bleu ou orange) ayant la valeur maximale représentent le pourcentage de la cour inter-hommes par pub [support orange; MAX (moyenne), flèche noire).. (B,C) Les formules de feuille de travail utilisées pour calculer le point de données représentatif maximal et la moyenne maximale de 10 points de données représentatifs consécutifs par pub. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 7 : La désinhibition comportementale induite par l’éthanol et la sensibilisation dans CS et th. (A,B) Les mâles CS et th ont montré la désinhibition sensible de cour avec des expositions répétées d’éthanol (ANOVA GLM, CS : R2’0.83, F(5,66)’65.21, p ‘lt; 0.0001; th: R20,67, F(5,66)27,60, p’lt; 0,0001; n 12). (C) Les mâles de th ont montré moins de cour désinhibée par rapport à CS (n -12). Les valeurs p des analyses post hoc sont affichées au-dessus de la ligne. L’activité de cour intermale a été analysée à partir des vidéos générées pour chaque exposition à l’éthanol. Toutes les données sont signalées comme moyens et erreur standard de la moyenne. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure supplémentaire 1 : Analyse statistique. Les étapes du logiciel Minitab 17 sur la façon d’effectuer le test de normalité (A) , (B) empiler les données, (C) modèle linéaire général ANOVA test, (D) Deux échantillons t-test, (E) Mann-Whitney test et (F) Kruskal-Wallis test. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Dans ce rapport, nous avons décrit la configuration et le protocole détaillé de l’essai Flypub; une nouvelle méthode pour mesurer comment l’exposition récurrente à l’éthanol déclenche une cour désinhibée et une sensibilisation comportementale. Bien que l’essai Flypub soit relativement simple, plusieurs étapes nécessitent des soins et une attention pour assurer des résultats fiables. Tout d’abord, les mouches pour les tests doivent être entièrement pigmentées (c.-à-d. mouches adultes entièrement développées), saines et intactes. Les déformations ou les dommages, en particulier dans leurs ailes ou leurs jambes, peuvent affecter la capacité du mâle à courtiser. Deuxièmement, l’âge de la mouche est important et doit être apparié entre les groupes témoins et expérimentaux (âge optimal : 3-5 jours à l’exposition à l’éthanol 1). Deux semaines et plus de mouches mâles de type sauvage ont tendance à afficher les niveaux élevés de cour désinhibée31. Ainsi, une correspondance appropriée entre l’âge des mouches à l’étude est essentielle pour éviter des résultats variables. Troisièmement, le nombre de mouches par pub est vital (optimal: 33 par pub). Les nombres de mouches inférieurs ou plus élevés par pub peuvent grandement fausser les scores de cour (données non montrées). Quatrièmement, les chambres Flypub doivent avoir des volumes identiques comme illustré dans la figure 2B. Cela garantit que les mouches reçoivent la vapeur d’éthanol de façon synchrone et les comportements obtenus sont cohérents. Cinquièmement, un enregistrement vidéo clair et une notation de cour précise sont essentiels. Ce protocole dépend fortement des observations comportementales, de sorte que l’observance méticuleuse au protocole de notation de cour normalisée est fondamentale pour minimiser les résultats incohérents. Enfin, il est fortement recommandé que l’exposition à l’éthanol et les étapes de notation de cour soient exécutées aveuglément, lorsqu’un expérimentateur n’est pas au courant des génotypes de mouche ou des traitements expérimentaux, empêchant ainsi le biais expérimental.

L’essai Flypub a de multiples avantages. Tout d’abord, plusieurs groupes de mouches peuvent être testés et comparés simultanément. Deuxièmement, il est peu coûteux, simple à installer et facile à apprendre, ce qui le rend très favorable aux expérimentateurs à tous les niveaux, y compris l’école primaire à travers les étudiants de premier cycle et de deuxième cycle, postdocs et professeurs ainsi que les laboratoires d’enseignement avec un espace et des budgets limités. Troisièmement, il peut être utilisé pour mesurer des comportements supplémentaires tels que la cour désinhibée des mouches femelles et l’effet sédatif de l’éthanol ou d’autres sédatifs pour évaluer la sensibilité initiale et le développement de tolérance et de maintenance31,32. Ensemble, le Flypub est une méthode polyvalente pour étudier diverses caractéristiques de l’AUD.

La principale limitation de l’essai Flypub est le régime rigoureux et laborieux de notation de cour. Le comportement de cour sous l’influence de l’éthanol est très dynamique d’une manière que la durée de la cour varie de moins d’une seconde à de nombreuses minutes et les mouches engagées dans la cour sont plutôt fréquemment en train de changer. Le régime de notation présenté ici a été développé pour intégrer cette nature dynamique et fournir des scores cohérents sur les expositions individuelles à l’éthanol pour un génotypedonné 31,32. Comme indiqué dans le protocole, l’activité de cour est notée manuellement, ce qui prend beaucoup de temps. Plusieurs programmes de notation automatisés ont été développés pour faciliter un dépistage comportemental impartial à haut débit et qui s’appuient tous sur les mouvements et les emplacements des mouches individuelles39,40,41,42,43,44,45. Nous avons également essayé de développer un logiciel informatique pour compter automatiquement l’activité de cour, mais nous n’avons pas été en mesure d’obtenir des résultats cohérents et fiables. Cela pourrait être dû au fait que la notation comportementale comprend plusieurs étapes de cour (c.-à-d., suite, extension unilatérale de l’aile, flexion abdominale et montage)35,36,46 de mouches multiples à la fois. Même avec cette limitation, un expérimentateur avec une formation adéquate devrait être en mesure de quantifier les comportements de cour induits par l’éthanol avec cohérence et précision. Néanmoins, il serait d’une grande aide et d’une grande importance d’adopter l’apprentissage automatique ou d’autres algorithmes avancés comme un suivi.

Semblable aux modèles de rongeurs, les études sur l’éthanol dans le modèle de mouche ont largement porté sur les effets stimulants et sédatifs de l’éthanol. L’essai Flypub cependant, mesure la cour désinhibée, un type de désinhibition cognitive qui est nouveau31,32. Par conséquent, le Flypub peut aider à élucider les joueurs moléculaires, les voies cellulaires et les circuits neuronaux ainsi que les facteurs de risque (p. ex., âge, sommeil, régime alimentaire ou environnement social) essentiels à la désinhibition comportementale et à la sensibilisation. Nous avons déjà démontré que la signalisation de dopamine est nécessaire pour EIBS, qui est en ligne avec les résultats dans les modèles de rongeurs et les sujets humains6,9,31. Aussi comme une preuve de concept, nous avons examiné le mutant th manquant d’OA (la contrepartie invertébrée de la noradrénaline) et avons constaté que l’œuvre d’œuvre est également importante pour la sensibilisation comportementale à l’effet de désinhibition de l’éthanol bien que sa contribution soit relativement faible par rapport à celle de la dopamine31. Cette constatation contraste avec l’observation de Scholz47 selon laquelle les mouches mutantes tôh ne présentent aucune déficience évidente dans la sensibilisation à l’effet d’activation antifiant de l’éthanol47. Ceci suggère des voies moléculaires, cellulaires et neurales distinctes médiateur la sensibilisation comportementale à la désinhibition contre l’activation locomotrice. Les études de suivi devraient poursuivre la collaboration de cette notion alléchante.

En résumé, le Flypub est une méthode peu coûteuse, multiforme et efficace pour étudier les réponses comportementales à l’éthanol, en particulier la désinhibition et la sensibilisation comportementale, qui peuvent aider à faire progresser notre compréhension de l’AUD et de fournir un aperçu des interventions efficaces pour ce trouble chronique.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par la NIAAA 1R15AA020996, NIMH R21MH109953, Brain and Behavior Research Foundation NARSAD, et NIMHD 2G12MD007592 NMD Cluster grants. Nous sommes également reconnaissants au programme RISE financé par les NIH (NIGMS 5R25GM069621) d’avoir soutenu NMD et CMS, le programme UTEP COURI-SURPASS pour soutenir NMD, le programme MARC financé par les NIH (NIGMS 2T34GM008048-31) pour soutenir l’AA et la Bourse d’études supérieures Dr Keelung Hong pour soutenir EBS. Nous apprécions grandement le service de communication de l’UTEP : Darlene Barajas, Christian Rivera, Karina Moreno, Jose Loya Fernandez et le département musique : Stephen A. Haddad pour leur aide dans la production vidéo et vocale. Enfin, nous sommes très reconnaissants au Dr Andreas Thum d’avoir partagé le mutant detôh dans le contexte de Canton-S avec les mouches de contrôle Canton-S; et Jessica Burciaga pour sa précieuse contribution aux études initiales sur l’octopamine et les membres du laboratoire Han pour la discussion et le soutien.

Materials

95 % Ethanol VWR Chemicals BDH1158-4LP
Canton-S – – wild-type strain used as a control
Copy stand with arms Kaiser 205411 model RS 2-XA, with one central arm and two lateral arms; to set up a flypub station
Cotton rounds Swisspers COT-027 to deliver ethanol
Excel Microsoft – to analyze data; any worksheet or spreadsheet software can be used
Fluorescent light bulb Lights of America 7108N maximum (120 V-70 W Max.); to illuminate the flypub station
Microsoft LifeCam software Microsoft – version 3.60; to videotape flypubs
Microsoft LifeCam Studio Microsoft Q2F-00013 1080P HD sensor; to videotape flypubs
Minitab 17 Minitab – version 17; to conduct statistical analysis; any statistical analysis software can be used
Nylon mesh sheet Sefar Nitex – model B0043D1TVY, opaque white, 200 microns mesh; to make a flypub
Petri dishes Falcon 08-757-100A 35 x 10 mm; to deliever ethanol
Plastic funnel – mid size Fisher scientific 10-348A 65 mm diameter and 67 mm height; to transfer sedated flies from a flypub into a food vial
Plastic funnel – small Fisher scientific 07-202-121 4 mm diameter and 46 mm height; to transfer flies from a vial into a flypub
Polycarbonate sheet Lexan – 0.762 mm thickness, clear, 610 x 1220 mm Nominal; to make a flypub
Round-bottom bottle Fisher scientific AS115 polypropylene, 103 mm height, 60 mm diameter and 177 ml capacity; to make a flypub
Soldering iron Weller WES51 to make a hole in a flypub
Time code – – .smi file, a subtitle ticking timecode created in Han lab; to monitor time during courtship scoring; any time subtitles may be used
Tyramine b hydroxylase (tbh) – – mutant fly strain (nM18 null allele)deficient in tbh in the wild-type Canton-S background ; obtained from Dr. Andreas Thum (University of Leipzig, Leipzeig, Germany)
VLC media player VideoLAN – version 3.0.8; any media player can be used to score courtship
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Delgado, N. M., Sierra, C. M., Arzola, A., Saldes, E. B., Han, K., Sabandal, P. R. Flypub To Study Ethanol Induced Behavioral Disinhibition and Sensitization. J. Vis. Exp. (159), e61123, doi:10.3791/61123 (2020).
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