原発性胚マウス中脳ドーパミンニューロンにおける前形成線維誘導α-シヌクレイン蓄積の研究

すべての動物実験は、フィンランド国立動物実験委員会によって承認され、科学的目的のために使用される動物の保護に関する欧州の法律に従って行われました。 1. 準備 ドーパミンニューロン培地(DPM)を0.46%Dグルコース、1%L-グルタミン、1%N2、0.2%プリモシン、DMEM/F12で調製します。材料を混合した後、DPM をフィルター処理します。4 °CでDPMを保存し、一度だけ各アリコートを温める。注:DPMは、ドーパミンニューロン23におけるα-シヌクレイン蓄積を減少させるので、GDNFを含んではなりません。 非常に疎水性のシリコンガラスピペットを調製し、胚性ニューロンの初期処理中に細胞の表面への付着と損失を最小限に抑えます。 蒸留水1Lに10mLのシリコーン流体を加え、2L容器で撹拌して混ぜます。ガラスピペットをシリコン化溶液に15分間浸しておきます。 ピペットを蒸留水で3~5倍にすすります。ピペットを室温(RT)で一晩乾燥させるか、100〜120°Cの加熱された無菌空間で1〜2時間乾燥し、乾燥をスピードアップします。 密閉されたオートクレーブ袋に標準オートクレーブによってピペットを殺菌する。 ポリL-オルニチン(PO)コーティングされた96ウェルプレートを透明な底で、ニューロンの播種に使用する96ウェルプレートの中間ウェルウェルに60 μLを加え、エッジ効果を避けるためにプレートの端に少なくとも1列/列のウェルを残します。コーティングされたプレートをRTで4°Cまたは4時間で一晩保管してください。 細胞をめっきする前に、POを完全に吸引し、1x PBSの100 μLで細胞を3回洗浄します。井戸から1x PBSを吸引し、完全な乾燥のためにプレートの蓋を開けておきます。注:使用済みPOを収集し、再利用するためにフィルタすることができます。これは、同じ PO ソリューションに対して 2 回繰り返すことができます。 以前にコーティングされた井戸にDPMの50 μLを加えます。100 μLのプラスチックチップを備えた井戸からDPMを吸引し、同時に円の動きで井戸の底を傷つけ、各ウェルの周囲のコーティングを取り除きます。POコートの島は井戸の真ん中に残ります。 ラミナルフードの下に、各コーティングされた島の真ん中に10 μLのDPMを加えて、マイクロアイランドを作ります。注: DPM で覆われたマイクロアイランドを持つプレートは、細胞の分離中に 1 ~ 2 時間、層流フードの下に保持することができます。 2. E13.5マウス胚からの腹側中脳床の分離 メモ:中脳の床解剖手順については 、図1 を参照してください。 解剖する前に、10cmのペトリ皿にダルベッコの緩衝液を入れ、氷の上に置いておきます。 E13.5妊娠中の女性マウスを施設のガイドラインに従って安楽死させる。マウスを背中に平らに置き、前体に70%エタノールを吹き付けます。鉗子で子宮の上の皮膚を持ち上げ、子宮を露出させるために外科用ハサミで切開を行います。 慎重に子宮を取り除き、以前に準備したペトリ皿に氷の上に置きます。 RTの層状フードの下に外科用ハサミを使用して、慎重に子宮から胚を取り除きます。鉗子で胚からすべての胎盤残渣を取り除き、Dulbeccoの緩衝液で満たされた新しい10cmペトリ皿に入れます。 解剖鉗子または針を使用して、図1Aの黒い矢印でマークされた場所から頭の後方を切り取る。切断部分を残りの胚から取り除く(図1B)。 カット片の後部を観察者(図1C)に向かって置き、尾蓋から頭蓋までそっと切り開く(図1D)。頭蓋開口部の 0.5 mm 下から、図 1Eに示すように 2 mm2-3 mm2領域をカットします。 腹側の中脳の床( 図1Fを参照)を空の1.5 mLマイクロ遠心分離管に取り付けます。すべての中脳の床が集まるまで、氷の上にマイクロ遠心チューブを保管してください。注:あるいは、中脳床は、すべての胚脳の解剖後に1 mLマイクロピペットで収集することができます。 図1:E13.5マウス胚からの中脳床の解剖(A) 頭部の後方の切断位置は、黒い矢印と白い破線でマークされています。(B)胚の残りの部分から切片を取り除いた。取り外した部分は丸で囲まれた。(C)この作品は、観察者に向かって後部に向かって90°回転した。(D) 黒い矢印から、尾頭から頭蓋まで(白い破線でマーク)開かれた。(E)開口部の下方0.5 mm~1mmから、2mm2~4mm2 の領域がカットされた(黒い線でマーク)。(F)腹側中脳床が隔離された(黒い破線の正方形でマーク)。スケールバー= 1 mm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 3. E13.5マウス胚からの一次胚性中脳培養を96のウェルプレート形式で確立する 同じ1.5 mLチューブ内のすべての胚から中脳床を採取した後、残りのダルベッコの緩衝液を取り除き、Ca2+、Mg 2+フリーハンクスバランス塩溶液2+(HBSS)の500 μLで組織片を3回洗浄します。 HBSSを取り外し、500 μLの0.5%トリプシンをチューブに加えます。37°Cで30分間インキュベートします。 インキュベーション中、37°Cで牛胎児血清(FBS)の1.5mLを温め、30μLのDNase IをFBSに加えて混合します。また、シリコンガラスピペットの先端を火で磨きます。穴に鋭いエッジがなく、1 mLマイクロピペットチップと同じサイズになっていることを確認します。注:代替として、低接着1 mLマイクロピペットチップは、トリアーレーションに使用することができます。しかし、シリコンガラスピペットは最良の結果を与えるようです。 ステップ3.2のインキュベーションが終了するとすぐに、FBS/DNaseミックスの500 μLを部分的に消化された組織に加えます。ガラスピペットを使用して、FBS/トリプシンミックスの組織をトリチュレートします。組織が小さな、かろうじて目に見える粒子に解体するまで三分酸塩。トリアージ中に泡を避けてください。 残った粒子を重力によってマイクロ遠心分離管の底に沈殿させます。底部の沈殿物をピペット化することなく、上清を空の15 mLのコニカルポリプロピレンチューブに集める。 ステップ 3.3 (98:2) から HBSS の 1,000 μL を希釈して FBS/DNase-I/HBSS (49:1:50) を取得します。上下にピペットを入れ、混ぜます。マイクロ遠心分離管の残った粒子に新しいミックスの1,000 μLを加えます。もう一度トリチュレートし、ステップ3.5を繰り返します。 前の手順をもう一度繰り返して、すべての FBS/DNase-I/HBSS を使い切ります(49:1:50)。 15 mLチューブ内(ステップ3.5、3.7、3.8)内ですべての上清を採取したら、卓上遠心分離機を使用して上清(〜3mL)を100 x gでスピンダウンし、5分間、下部のペレットセルに触れることなく上清を除去します。 DPMの2mLをチューブに加えて細胞ペレットを洗浄し、100 x g で5分間回転させます。メモ: 培養ニューロンには、常に新鮮で温められたDPMを使用してください。洗浄工程では、DPMは新鮮である必要はありませんが、37°Cに予感する必要があります。 新鮮で温かいDPMで細胞を希釈し、マイクロ遠心分離チューブに移します。希釈のためのDPMの量は、組織解剖に使用される胚の数に依存する。例えば、150 μL の DPM を使用して、10 個の胚から得られた細胞を希釈します。 DPM内の細胞10μLをマイクロ遠心チューブに移します。0.4%トリパンブルーの汚れの10 μLとそれらを混ぜます。ヘモサイトメーターまたは自動セルカウンターを使用して、生細胞(すなわちトリパンブルー陰性)をカウントします。注:ウェルあたり〜1,000ドーパミンニューロンを得るためにウェルあたりめっきのための30,000細胞を使用してください。細胞密度が6μL当たり30,000個以上の細胞である場合は、さらに細胞をメッキする前にDPMで希釈し、播種体積が6μL以上になるようにします。 井戸の底部に触れることなく、ステップ1.6で作成されたマイクロアイランドからDPMを取り除きます。 各ウェルで再現性のある細胞密度を得るために、ウェル内でめっきする前に穏やかなピペットで細胞を混合する。1~10 μLのマイクロピペットを使用して、各マイクロアイランドの位置に6μLの細胞をウェルの真ん中に加えます。 プレートの端にある空の井戸を150 μLの水または1x PBSで満たし、神経培養物を含むウェルからの蒸発を最小限に抑えます。プレートをインキュベーターで37°C、CO2を5%1時間イン2キュベートします。 1時間後、インキュベーターからプレートを取り出し、細胞を含む各ウェルに100μLのDPMを加え、インキュベーターに戻します。 めっきの2日後(インビトロ2、またはDIV2)、25 μLを取り除き、75 μLの新鮮なDPMを加えて、最終的なメディアボリュームを150 μLにし、蒸発をできるだけ避けてください。 DIV5で新鮮なDPM(すなわち、75 μLを取り除き、75 μLの新鮮なDPMを加える)と媒体の半分を交換します。DIV5 の後にメディアを変更しないでください。 4. 原発性胚性ドーパミンニューロンにおけるα-シヌクレイン凝集体の誘導による、前形のフィブリルによる播種 Pff の取得と検証のためのプロトコルは、綿密に説明され、いくつかの最近の出版物11、28、2929、30で議論されています。Pff の作業に続いて、層のフードや 1% SDS で Pff に接触した可能性のある機器をクリーニングし、その後 70% エタノール31を使用します。 実験の前に、PPFを1x PBSで希釈して、最終濃度100μg/mLにします。マイクロ遠心分離管で希釈されたFPFを、4°Cで水浴冷却して高電力で10サイクル、30 s ON/30 s OFFで超音波処理します。注:フィブリルが50 nmの長さ約10nmの断片を生成するために適切に超音波処理されていることが重要です。超音波処理されたPfFのサイズは、Patterson et al.30.で記載されているように染色された FPF の透過型電子顕微鏡画像から直接測定できます。超音波処理は、高出力バス超音波処理器で上記のように達成することができます。あるいは、チップ超音波処理器は30を使用することができます。超音波処理されたPfFは、複数の凍結/解凍サイクルを避けるために、小さなアリコートで-80°Cで保存することができます。 DIV8では、ウェルあたり100 μg/mLの3.75 μLをウェル内の150 μLの培地に加え、最終濃度の2.5 μg/mLにします。対照群に同量の1x PBSを使用する。 4%パラホルムアルデヒド(PFA)を1x PBSで調製し、アリコートを-20°Cで保存します。これを行うには、次の手順に従います。注: PFA は毒性があります。準備中にマスクと手袋を着用し、常に層状フードの下で作業し、施設の指示に従ってすべての固体および液体PFA廃棄物を処分する。 1L容器内で1x PBSの500mLを温める。容器に攪拌棒を入れ、加熱機能を備えた磁気攪拌機に容器を置きます。40~60°Cの温度を調整して、溶液を暖かく保ちながら沸騰を防ぎます。 使い捨てプラスチック製の測定容器に入れ、ボンネットの下に20gのPFA粉末を測定します。慎重に、1x PBSで満たされた容器にPFA粉末を追加します。溶液の攪拌を開始します。 溶液に200μLの水酸化ナトリウムを加え、PFAが完全に溶解するまで約15分間撹拌を続けます。 溶液が均質に見えた後、168 μLの5M塩化水素を加えてpHを~7のバランスを取ります。使い捨て可能な色固定pHインジケータストリップでpHをチェックしてください。 ヒーターから容器を取り外し、RTに冷却できるようにします。使用前にRTでアリコートを解凍し、その後再凍結しないでください。 DIV15では、ピペッティングで井戸からすべてのメディアを取り除きます。各ウェルに4%PFAの50 μLを加えて細胞を固定し、RTで20分間インキュベートします。インキュベーション後、ウェルからPFAを取り出し、1x PBSの100 μLを各ウェルに加えて細胞を洗浄します。1倍のPBSを取り出し、さらに2倍洗います。 乾燥を避けるために、各ウェルに1x PBSの100 μLを残します。免疫化学が行われるまでプレートを4°Cで保存します。 5. 96ウェルプレートにおける一次胚性ドーパミンニューロンの免疫蛍光染色と自動イメージング 1x PBSを取り除き、1ウェルあたりPBS(PBST)に0.2%トリトンX-100の100 μLを加え、RTで15分間インキュベートして細胞を透過させます。 PBSTを取り除き、PBSTに1井戸あたり5%ノーマルホース血清(NHS)の50 μLを加えます。非特異的抗原活性を遮断するために、RTで1時間インキュベートする。 PBSTで5%NHSでTHおよびpS129-αsyn(1:2,000)に対する一次抗体を希釈します。希釈した抗体を50μLずつ各ウェルに加え、4°Cで一晩インキュベートします。 抗体を除去し、各ウェルに1x PBSの100 μLを加えて細胞を洗浄します。1x PBSを取り出し、2倍の洗浄を繰り返します。 蛍光分子の漂白を防ぐために、最小限の光条件下で作業を開始します。PBSTで二次蛍光標識抗体(1:400)を希釈します。希釈した抗体を50 μLずつ各ウェルに加え、RTで1時間インキュベートします。 抗体溶液を取り除き、1x PBSを100μLずつ1倍にして細胞を洗浄します。1x PBSを取り出し、2倍の洗浄を繰り返します。 1x PBSを取り除き、200 ng/mL 4’、6-ジミジノ-2フェニリンドール(DAPI)を1ウェルあたり50 μL加えて培養細胞の核を染色し、RTで10分間インキュベートします。 1x PBSの100 μLをそれぞれ5分間洗浄します。最後の洗浄後、各ウェルに1x PBSの100 μLを保管してください。プレートをアルミホイルで覆い、イメージングまで4°Cで保管します。 画像の一次胚性ドーパミンニューロンは、10倍の目的を有する高コンテンツプレートスキャナ( 材料表を参照)を有する96ウェルビュープレート内で。 プレートタイプ、メーカー、サイズ、ウェル間の距離、メディアの種類と量など、96ウェルプレートの仕様に基づいて設定を調整します。 マイクロアイランド内のすべての細胞をカバーするためにウェルのイメージング領域を選択します。例を選択して、オートフォーカスを調整します。DAPI に最初のフォーカスを基にします。 制御ウェルの染色の強度に基づいて、各蛍光チャネルの取得時間を較正する。PFF処理されたコントロールウェルでpS129-αsyn凝集体を含むドーパミン細胞を明確に区別できるようにパラメータを調整し、pS129-αsyn陽性細胞とpS129-αsyn陰性細胞の明確な定量化を可能にする。注: Pff を含まないウェルには、pS129-αsyn の染色を行う必要はありません。したがって、これらのウェルは、pS129-αsyn強度を調節するための陰性制御として使用することができる。 全く同じパラメータで染色免疫蛍光を持つすべてのチャネルに対して、10xの目的で選択したすべてのウェルを同時に画像化します。 場合により、フィライン型α-シヌクレインに特異的な抗体を有するウェルのサブセット内にα-シヌクレインを含む標識を使用して、pS129-αsyn-αシンのリン酸化または脱リン酸化の阻害ではなくタンパク質蓄積の減少を反映することを確認する。 ステップ 5.3 を、α-シヌクレインフィラメント抗体と置き換える pS129-αsyn 抗体 (1:2,000) を繰り返す。ステップ5.13のように染色された凝集したα-シヌクレインを画像化する。 6. 高コンテンツ画像解析 注: このステップは、オープンアクセスソフトウェアのCellProfilerバージョン3.15およびセルプロファイルアナリストバージョン2.2.1で実行されます。2727、32。,ただし、ある程度の経験では、類似の画像解析パイプラインを別のバージョンまたは同様のソフトウェアで設定できます。詳細な説明については、ソフトウェアのページを参照してください(資料一覧を参照)。 ダウンロードして、セルプロファイルとセルプロファイルのアナリストのソフトウェアをインストールします。 セルプロファイルを開きます。 ファイルを選択する|インポート|ファイルからパイプライン を実行し、提供されているサンプル パイプライン TH_LB_V1.cpipe ファイルを読み込みます ( 補足ファイルを参照)。注: サンプル パイプラインでは、取得した画像のプロパティと画像取得プラットフォームに応じて、特定の調整が必要になります。 Example_Imagesソフトウェアの最初の試用に使用することができます。 分析する画像を 画像モジュールにドラッグして読み込みます。フィルタ オプションを使用して、読み込まれたフォルダからイメージ ファイルのみを選択します。 メタデータ モジュールを使用して、イメージ ファイル名からウェル、視野、およびチャネル情報を抽出します。虫眼鏡シンボルをクリックし、ファイル名からプレート、井戸、イメージングサイトとチャンネル情報を抽出するための正規表現を入力します。注: 正規表現は、プレート顕微鏡のファイル命名規則に依存します。虫眼鏡の横にある疑問符をクリックすると、構文の詳細が表示されます。 名前と種類モジュールで、DAPI、TH、および pS129-αsyn 染色 (デフォルト チャネル1、2 2、および3)の正しいチャネル番号を選択します。[グループ] モジュールで、[いいえ] を選択します。 細胞ソーマのTH染色を使用してドーパミンニューロンをセグメント化するために 識別プライマリオブジェクトモジュール を使用してください。注: 特定の値は、プレートの染色とイメージに基づいて、初期の最適化が必要になります。後続のプレートが同様に処理される場合、それ以上の調整は必要ありません。 測定オブジェクト強度モジュールを使用して、THおよびDAPIチャンネルから蛍光強度情報を取得します。 セグメントドーパミンニューロンのサイズと形状の特徴を測定するには 、MeasureObjectSizeShapeモジュール を使用します。 MeasureTexture モジュールを使用して、セグメント化されたドーパミンニューロンから TH チャネルからテクスチャ機能情報を測定します。 データベース に測定値を 保存するには、データベースモジュールを使用します。 実験の命名スキーマ (例: ExperimentNumber001_PlateNumber1_databaseFile1.db) に従ってデータベースファイルに名前を付けます。データベース ファイルの [出力フォルダー] を選択します。データベース ファイルは数ギガバイトの大きさになる可能性があり、イメージ ファイルの親フォルダーに保存することをお勧めします。 CellProfiler Analyst を開き、手順 6.8 で作成した V1_THCells.properties ファイルを選択します。 ツールを開く|分類子。 セグメント化された細胞を2つのカテゴリに分類する:正(すなわち、正しくセグメント化されたドーパミンニューロン細胞体)および陰性(すなわち、セグメンテーションおよび染色アーティファクト)図 2A および 2Bを参照。 取得したセルの数を 50個の ランダムセル に設定し 、Fetch (ステップ 6.4 でセグメント化されたセルのイメージをロード) をクリックします。各ビンのセルを少なくとも 30 個 並べ替えるには、ウィンドウの下部にある対応するビンにドラッグします。必要に応じて、より多くのセルをフェッチします。 ドロップダウン メニューで、[50 の最大ルールで高速穏やかなブーストを使用する] を選択し、[トレーニング] をクリックします。 “Fetch”を50 個の正のセルに設定し、Fetchキーを押して、分類器に従って TH 陽性セルを取得します (図 2A)。得られた結果を使用して、トレーニング済み分類器の品質を評価します。 ステップ 6.10.1 ~ 6.10.3 を繰り返し、結果が満足できるまで分類器をトレーニングするための新しいサンプル セルを追加します。 [詳細設定] を選択します。ルールを編集します。をクリックし、新しいウィンドウですべてのテキスト(Ctrl + a) を選択し、それをコピーします ( Ctrl-c) をメモ帳(Ctrl-v) にコピーします。TH_rules.txt ファイルとして保存する注: 神経細胞培養の密度や染色やイメージングの質によっては、ステップ 6.4 でパラメータを設定して TH 陽性細胞のみを高精度にセグメント化することができるため、この手順は必要ない場合があります。この場合、TH_LB_V1.cpipe の実行全体は必要ありませんTH_LB_V2。 IdentifyPrimaryObjects modules 図2:DAPI、TH、およびpS129-αsyn免疫蛍光に基づくCellProfilerアナリストソフトウェアによるドーパミンニューロンおよびpS129-αsyn陽性ドーパミンニューロンの定量化。陽性ビン中の(A)TH細胞は、画像で選択された最初の細胞と、ソーマでの周囲TH染色(灰色)で小さな正方形でマークされたDAPI染色(青)に基づいて選択した。(B) 非細胞アーチファクトを負のビンに入れた。(C)pS129-αsyn陽性THニューロンは、画像で選択された最初の細胞で小さな正方形でマークされたpS129-αsyn染色(赤)の大きな包含に基づいて選択された、核または細胞ソーマで。C(D)このようなpS129-αsyn含入を含まないTH細胞を、ネガティブビンに入れた。スケールバー= 10 μmこの図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 セルプロファイラを開き、[ファイル|インポート|ファイルからパイプラインを実行し、TH_LB_V2.cpipeファイルを読み込みます。ステップ 6.3 ~ 6.7 を繰り返します。パイプラインのこの部分は、TH_LB_V1.cpipeと同じである必要があります。 FilterObjects モジュールを使用して、真の TH 陽性セルのみを渡して、さらに分析します。 [フィルタモードの選択]を[ルール]に設定します。[規則または分類子ファイル名] で、手順 6.10.5 で作成したTH_rules.txtファイルを選択します。 TH の正のセルが左下のウィンドウに並べ替えられた場合は、[ クラス番号 ] フィールドを 1 に設定します。 測定オブジェクト強度モジュールを使用して、pS129-αsynチャネルから蛍光強度情報を取得します。 MeasureTexture モジュールを使用して、フィルタされたセルから TH チャネルからテクスチャ機能情報を測定します。 フィルター処理されたセルのサイズと形状の機能を測定するには 、MeasureObjectSizeShape モジュール を使用します。 データベース に測定値を 保存するには、データベースモジュールを使用します。 実験の命名スキーマ (例えば、ExperimentNumber001_PlateNumber1_databaseFile2.db) に従ってデータベースファイルに名前を付けます。データベース ファイルの出力フォルダーを選択します。 セルプロファイル分析を開き 、V2_THpos.properties ファイルを選択します。 セグメント化されたセルを 2 つのカテゴリに分類する – pS129-αsyn 陽性と pS129-αsyn 陰性細胞 (図 2C,D)。 取得したセルの数を 50 個の ランダムセル に設定し 、Fetch (ステップ 4 でセグメント化されたセルのイメージをロード) をクリックします。各ビンのセルを少なくとも 30 個 並べ替えるには、ウィンドウの下部にある対応するビンにドラッグします。 ドロップダウンメニューで、[50 の最大ルールで高速穏やかなブーストを使用] または[ランダム フォレスト分類子] を選択します。[トレーニング] をクリックします。 「フェッチ」を50個の正のセルに設定し、Fetchを押すと、分類器に従ってpS129-αsyn陽性セルが得られます(図2C)。”Fetch”を50 個の負のセルに設定し、Fetchキーを押して、分類器に従って pS129-αsyn 負のセルを取得します (図 2D)。トレーニング済み分類子の品質を評価します。 手順 6.17.2 ~ 6.17.4 を繰り返し、結果が満足できるまで分類器をトレーニングする新しい例のセルを追加します。 [ スコアをすべて ] をクリックすると、各ウェルの pS129-αsyn 陽性および負のドーパミンニューロンの数を要約した結果テーブルが表示されます。