Studio pre-formato Fibril indotta accumulazione di z-sinucleina in primario embrionale Midbrain Dopamine Neuroni
Summary
Qui, vi presentiamo un protocollo dettagliato per studiare l’accumulo neuronale di sinucleina nei neuroni primari della dopamina del topo. Gli aggregati di sibbonucleina fosfolati nei neuroni sono indotti con fibrille pre-formate e sinucleina. L’imaging automatizzato di cellule etichettate immunofluorescentmente e l’analisi imparziale dell’immagine rendono questo protocollo robusto adatto per lo screening della produttività medio-alta di farmaci che inibiscono l’accumulo di sinucleina.
Abstract
L’obiettivo di questo protocollo è quello di stabilire un modello robusto e riproducibile di accumulo di sivinucleina nei neuroni primari della dopamina. Combinato con l’immunostaining e l’analisi automatizzata imparziale dell’immagine, questo modello consente l’analisi degli effetti dei farmaci e delle manipolazioni genetiche sull’aggregazione di sisnucleina nelle colture neuronali. Le colture primarie di midbrain forniscono una fonte affidabile di neuroni della dopamina embrionale in buona fede. In questo protocollo, il segno distintivo dell’istopatologia del morbo di Parkinson, le corpi di Lewy (LB), è imitato dall’aggiunta di fibrille preformate (FPF) direttamente ai mezzi di coltura neuronale. L’accumulo di fosforeoee endogeno nel soma dei neuroni della dopamina viene rilevato mediante immunostaining già a 7 giorni dopo l’aggiunta di PFF. Le condizioni di coltura delle cellule in vitro sono adatte anche per l’applicazione e la valutazione di trattamenti che prevengono l’accumulo di sinucleina, come farmaci di piccole molecole e fattori neurotrofici, nonché vettori di lentivirus per la manipolazione genetica (ad esempio, con CRISPR/Cas9). Coltivare i neuroni in 96 piastre di pozzo aumenta la robustezza e la potenza delle configurazioni sperimentali. Alla fine dell’esperimento, le cellule sono fissate con paraformaldeide per l’immunocitochimica e l’imaging della microscopia a fluorescenza. Le immagini a fluorescenza multispettrale sono ottenute tramite microscopia automatizzata di 96 lastre di pozzo. Questi dati sono quantificati (ad esempio, contando il numero di neuroni della dopamina contenenti fosforo-sinucleina per bene) con l’uso di software libero che fornisce una piattaforma per l’analisi imparziale del fenotipo ad alto contenuto. La modellazione indotta dal PFF dell’accumulo di fosfore-sinucleina nei neuroni primari della dopamina fornisce uno strumento affidabile per studiare i meccanismi sottostanti che mediano la formazione e l’eliminazione delle inclusioni di sinunucleina, con l’opportunità di screening farmacologico ad alto rendimento e analisi del fenotipo cellulare.
Introduction
Il morbo di Parkinson (PD) è una malattia neurodegenerativa caratterizzata dalla morte dei neuroni della dopamina midbrain nella sostanziale nigra (SN), successiva perdita di tono della dopamina nei gangli basali e conseguenti disturbi motori1,2. Una caratteristica istopatologica importante nel cervello dei pazienti affetti da PD sono gli aggregati intracellulari di proteine/lipidi trovati nel soma neuronale, chiamato corpi Lewy (LB), o nei neuriti, neuriti di Lewy (LN), collettivamente noti come patologia Lewy3. La patologia lewy nel cervello sembra progredire con l’avanzamento della PD simile alla diffusione di fattori patogeni attraverso connessioni neuronali. Abbondante patologia Lewy si trova nei neuroni della dopamina nel SN e le cellule in altre aree colpite da neurodegenerazione4. Tuttavia, durante la progressione della malattia, la diffusione e l’insorgenza dell’aggregazione proteica non sempre sono correlate alla morte neuronale e l’esatto contributo della patologia lewy alla morte neuronale non è ancora chiaro5.
LB e LN erano stati indicati per essere costituiti da componenti membranosi e proteici3. I primi sono frammenti di membrana, strutture vescicolari (forse lisosomi e autofanosomi) e mitocondri3. Quest’ultimo è costituito da almeno 300 diverse proteine6. Uno studio di Spillantini et al.7 ha dimostrato che la principale componente proteica della patologia di Lewy è la sinucleina. Altamente espresso nei neuroni, e collegato con la fusione della membrana e il rilascio del neurotrasmettitore, la z-sinucleina nella patologia di Lewy è presente per lo più in forma di fibrilla mile ariamiide, la maggior parte dei quali è fosforolato a Ser129 (pS129- ssyn)4,8.
È importante sottolineare che, a causa delle sue proprietà simili a prioni, le funzioni di synucleina piegate in modo improprio potrebbero avere un ruolo causale nella formazione patologica di Lewy4. Le proprietà prion-like di misfolded synuclein sono state mostrate con estratti midbrain da pazienti e fibrille preformate di tipo sisianone (PfF) preparate in modo corretto per indurre aggregati di sinucleina in neuroni in coltura e in vivo9,10. I PFF presentano un modello affidabile e robusto per studiare la progressione della patologia di sinucleina z nei neuroni della dopamina. Quando i PfF vengono applicati ai neuroni primari coltivati o iniettati nel cervello animale, portano alla formazione di inclusioni contenenti z-sinucleina nei neuriti e nel soma cellulare11 che ricapitolano molte caratteristiche osservate nella patologia di Lewy. Le inclusioni osservate sono detergenti insolubili nel Tritone X, ubiquitinated, macchiate con la colorante specifica amiloide Thioflavin S e contengono iperfosforoslato a z-synuclein a Ser12911,12. È importante sottolineare che queste inclusioni non si formano negli animali da urlo di tipo11di synucleina , indicando la dipendenza della loro formazione sulla sinucleina endogena.
Tuttavia, è difficile confrontare direttamente le inclusioni indotte da PFF e la patologia Lewy riscontrata nei pazienti affetti da PD perché le LB e le LN umane sono altamente eterogenee3. L’eterogeneità osservata della patologia lewy potrebbe essere causata da diverse fasi della formazione, da diverse posizioni anatomiche o da differenze nella conformazione di misfolded z-sinucleina che iniziano il processo di aggregazione. Gli stessi fattori potrebbero influenzare le inclusioni positive di pS129-syn indotta da PFF. Infatti, recentemente è stato dimostrato che le inclusioni positive pS129-syn indotte da PFF nelle colture neuronali primarie rappresentano fasi molto iniziali della patologia che possono maturare in strutture molto simili a LB dopo un periodo di incubazione prolungato12,13.
Modellare la diffusione precoce e l’accumulo di errori di tipo synucleina con i PFF è prezioso per lo sviluppo di farmaci, poiché la diffusione della patologia di Lewy è considerata uno dei marcatori della malattia in fase iniziale. Pertanto, i trattamenti di prevenzione delle aggregazioni possono essere promettenti per fermare o rallentare la progressione della PD nelle fasi molto precoce. Sono in corso diversi studi clinici volti a rallentare o fermare l’accumulo di sinucleina14. Per i pazienti in fase successiva, il trapianto di progenitori neuronali della dopamina può essere una migliore alternativa di trattamento15. Tuttavia, la patologia Lewy è stata documentata nei neuroni embrionali trapiantati durante l’analisi post-mortem dei cervelli dei pazienti della PD16,17, indicando anche la necessità di protezione contro l’accumulo di sinucleina.
In vitro, i PFF di sivinucleina sono noti per indurre l’aggregazione in linee cellulari immortalate, o più comunemente, nei neuroni ippocampali primari roditori o corticali. Nessuno di questi sono vicini a ricapitolare i neuroni della dopamina10. Coltivare questi neuroni richiede placcatura densa di alcuni numeri di neuroni in vitro18. Per ottenere un’elevata densità di placcatura con materiale limitato (ad esempio, neuroni primari della dopamina), il metodo di coltura micro isola è comunemente utilizzato. Nel microisolato, le cellule sono inizialmente placcate in una piccola goccia di media (di solito alcuni microlitri) tenute insieme dalla tensione superficiale nel mezzo di un grande pozzo18. Dopo che i neuroni si attaccano, l’intero pozzo viene riempito con il mezzo mentre le cellule rimangono confinate ad alta densità nella piccola area di placcatura. Oltre ad ottenere un’elevata densità di placcatura, le micro isole impediscono anche la placcatura vicino ai bordi dei pozze, dove le variazioni nella densità cellulare e nella sopravvivenza sono frequenti. Le micro isole sono spesso utilizzate in pozzi o piatti relativamente grandi; tuttavia, stabilire colture neuronali midbrain in microisole in 96 formato ben piastra consente lo studio della patologia di Lewy in neuroni della dopamina in buona fede con potenza di medio-alto rendimento. Gli esperimenti in vitro con questi neuroni ci hanno permesso di scoprire il fattore neurotrofico derivato dalla linea cellulare gliale (GDNF), che promuove la sopravvivenza dei neuroni della dopamina maturi in vitro e in vivo19,20,21,22e impedisce anche la formazione di aggregati di sibita nella dopamina23.22 I neuroni della dopamina derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dal paziente umano costituiscono un modello più accurato a causa della loro origine umana e del più lungo tempo di sopravvivenza in vitro. Tuttavia, l’induzione della patologia di sinucleina nei neuroni umani è osservata dopo più mesi, rispetto a una settimana nei neuroni embrionali del topo e/o con più fattori di stress (ad esempio, combinazione di sovraespressione di synucleina e PFF)24,25. Inoltre, il mantenimento dei neuroni della dopamina umana è più costoso e laborioso rispetto ai neuroni embrionali primari, limitando essenzialmente il loro uso in applicazioni ad alta velocità.
Inoltre, le colture neuronali primarie della dopamina possono essere geneticamente modificate (ad esempio, con CRISPR/Cas9) e/o trattate con agenti farmacologici23. Costituiscono una piattaforma veloce e riproducibile per applicazioni come la dissezione delle vie molecolari e lo screening della libreria dei farmaci. Anche se da queste colture è possibile ottenere materiale limitato, è ancora possibile condurre analisi genomiche/proteomiche di piccole dimensioni. Coltivare i neuroni primari in 96 benno è meglio per le tecniche di immunocitochimica e microscopia a fluorescenza, seguita da analisi fenotipo ad alto contenuto. Le immagini a fluorescenza multispettrale derivate dall’imaging automatizzato di 96 lastre di pozzo possono essere convertite in risultati quantitativi (ad esempio, il numero di neuroni contenenti LB per pozzo). Tali analisi possono essere eseguite con software libero, come CellProfiler26,27. Nel complesso, le colture primarie di midbrain embrionali placcate in 96 placche di pozzo forniscono una piattaforma robusta ed efficiente per studiare i neuroni della dopamina e l’aggregazione di sinucleina con l’opportunità di screening del fenotipo ad alto rendimento.
Protocol
Representative Results
Discussion
La diffusione della patologia lewy, di cui il pS129-ssyn è un elemento costituente principale, è un segno distintivo istopatologico della PD. L’arresto o il rallentamento dell’accumulo di pS129-syn aggregati può rallentare la degenerazione dei neuroni della dopamina e la progressione della alfa-sinucleinopatia. Tuttavia, una comprensione meccanicistica di come l’aggregazione di pS129-ssyn contribuisce alla scomparsa dei neuroni della dopamina deve ancora essere stabilita. Le evidenze di studi postmortem umani su campioni cerebrali da pazienti in diversi stadi della malattia, nonché l’osservazione dell’inclusione positiva di pS129-zsyn nei neuroni fetali trapiantati suggeriscono fortemente la diffusione della patologia lewy tra le cellule16,17,33. Di conseguenza, la diffusione di pS129-ssyn è stata recentemente ricapitolata utilizzando FPF9,,10. La creazione di un modello robusto, conveniente, e relativamente ad alta o media velocità di diffusione e accumulo di pS129-zsyn, in particolare nei neuroni della dopamina, può accelerare notevolmente la ricerca di nuovi trattamenti e composti che modificano questo processo.
Perché la perdita di neuroni della dopamina è la causa principale dei sintomi motori nella PD e queste cellule possiedono molte proprietà uniche2,34,35, modellazione della diffusione prion-like di pS129- ssyn nei neuroni della dopamina è il tipo più rilevante di modello dal punto di vista traslazionale. I protocolli che utilizzano micro colture di isole di neuroni midbrain embrionali su 4 placche e quantificazioni semiautomatiche sono stati descritti in precedenza18. Il protocollo qui descritto è stato adattato a 96 lastre di pozzo e fornisce una preparazione meno laboriosa di micro isole, consentendo la preparazione di un massimo di quattro piastre contenenti 60 pozze ciascuna da un ricercatore esperto durante una giornata lavorativa. Coltura di neuroni della dopamina in 96 piastre bene consente di testare i farmaci a quantità inferiori e consente alti tassi di trasduzione con vettori lentivirus. È anche possibile combinare diversi trattamenti per eseguire esperimenti più complessi.
Prima di applicare qualsiasi trattamento (compresi i PFF), la qualità della coltura deve essere verificata con la microscopia a campo luminoso. Se il sistema di microscopia non utilizza una camera di CO2 con riscaldamento, le cellule non devono essere tenute al di fuori dell’incubatrice per più di un paio di minuti, perché i neuroni primari della dopamina del topo sono delicati e facilmente stressati. Per lo stesso motivo, si consiglia di fare la prima imaging dopo 24 h di incubazione (tra DIV1-DIV3). Le cellule dovrebbero sembrare vive con i corpi cellulari presenti e si diffondono omogeneamente all’interno della micro isola. I neuroni primari si sarebbero stabilizzati sul terreno rivestito di PO e hanno iniziato a stabilire proiezioni neuronali. È possibile osservare piccoli grumi di cellule (cioè diametro inferiore a 150-200 m) che possono essere formate se il processo di triturazione non viene eseguito correttamente o la densità di placcatura è superiore a quella raccomandata. Questi piccoli grumi non influenzerebbero l’esperimento, a meno che non siano più di pochi per bene e / o più grande. Le cellule raggruppate rendono molto difficile identificare i marcatori immunoistochimici e le singole cellule durante l’analisi dell’immagine. È essenziale evitare tali grumi mediante un’attenta rivestimento, trituratura e controllo della densità di placcatura. Se l’uniformità di queste condizioni non può essere osservata in alcuni pozzi, non includere questi pozzi difettosi nell’esperimento. Tale esclusione dovrebbe essere effettuata prima dell’esecuzione di qualsiasi trattamento.
Inoltre, l’utilizzo di 96 lastre di pozzo consente un comodo uso di pipette multicanale durante le procedure di colorazione e la visualizzazione diretta con microscopi a piastre automatiche, aumentando ulteriormente la produttività. L’utilizzo della quantificazione automatica delle immagini è indispensabile per l’analisi dei dati provenienti da piattaforme di imaging ad alto contenuto. Oltre alla capacità di elaborare migliaia di immagini ottenute da ogni esperimento, garantisce una quantificazione imparziale e identica di tutti i gruppi di trattamento. Il flusso di lavoro proposto per l’analisi dell’immagine si basa su semplici principi di segmentazione dei neuroni della dopamina, filtraggio delle cellule segmentate correttamente mediante l’apprendimento automatico supervisionato e successivamente la quantificazione dei fenotipi (pS129-syn positivo e pS129-‘syn negativo), sempre dall’apprendimento automatico supervisionato. Anche se diversi approcci diversi per questo compito possono essere immaginati, abbiamo trovato la combinazione di segmentazione con l’apprendimento automatico per essere il più robusto per le colture di dopamina a causa di alta densità di placcatura, le diverse forme di neuroni della dopamina, e la presenza di neuriti fortemente macchiati. L’algoritmo di analisi delle immagini proposto è stato implementato in CellProfiler e CellProfiler Analyst, open source, software di analisi delle immagini ad alto contenuto liberamente disponibile26,27. L’algoritmo potrebbe anche essere implementato con altri software di analisi delle immagini, sia open source (ad esempio, ImageJ/FIJI, KNIME) o proprietario. Tuttavia, nella nostra esperienza queste funzionalità di personalizzazione spesso sacrificano per facilità d’uso, e quindi potrebbero non funzionare bene in analisi complicate. Abbiamo scoperto che i pacchetti software CellProfiler e CellProfiler Analyst forniscono risultati particolarmente affidabili combinando un numero considerevole di algoritmi implementati, estrema flessibilità nella progettazione del flusso di lavoro e la gestione simultanea e l’elaborazione efficiente dei dati di imaging ad alto contenuto.
Il protocollo descritto potrebbe anche essere adattato per la quantificazione di altri fenotipi cellulari caratterizzati dall’immunostaining con diversi anticorpi, come marcatori di altre popolazioni neuronali (ad esempio, DAT, GAD67, 5-HT ecc.) e aggregati proteici (ad esempio, fospo-Tau, ubiquitina). Più marcatori fluorescenti potrebbero anche essere combinati per distinguere fenotipi multipli (ad esempio, cellule con inclusioni in diverse fasi di maturazione). La classificazione automatizzata di fenotipi multipli dovrebbe anche essere facile da implementare nelle pipeline di analisi delle immagini descritte semplicemente aggiungendo un canale contenente immagini immunofluorescenti di marcatori aggiuntivi per le fasi di misurazione e l’ordinamento delle cellule in più contenitori. L’utilizzo di più marcatori contemporaneamente richiederebbe tuttavia l’ottimizzazione delle condizioni di immunostaining e imaging. Inoltre, per una migliore qualità nell’imaging immunofluorescenza, si raccomanda l’uso di speciali piastre da 96 pozze con pareti nere esplicitamente progettate per il microscopio fluorescente. Tuttavia, questi possono essere notevolmente più costosi rispetto alle piastre di coltura cellulare standard, che sono sufficienti per l’analisi descritta nel nostro protocollo.
Il tipo e la qualità dei PFF utilizzati sono fondamentali per il risultato degli esperimenti. I PFF possono influire sia sulla robustezza del saggio che sull’interpretazione dei risultati. Le condizioni di preparazione potrebbero influenzare l’efficienza di seeding dei PFF e, in effetti, sono stati segnalati “ceppi” Di PFF con diverse proprietà fisiologiche36. Ciò nonostante, la preparazione e la convalida dei PFF esulano dall’ambito di questo articolo e sono state descritte in diverse pubblicazioni11,28,29,30. Oltre al protocollo di preparazione, la specie di origine della sinucleina di synucleina nei PFF (ad esempio, topo, umano) e l’uso di proteine di tipo selvatico o mutate (ad esempio, a53T umano – sinucleina) devono essere considerate, a seconda delle particolari condizioni sperimentali. L’induzione dell’accumulo di pS129-ssyn da parte dei PFF è risultata dipendere dall’età della coltura (cioè, giorni in vitro), con colture più mature che mostrano un’induzione più pronunciata11. Ciò è probabilmente dovuto all’aumento del numero di connessioni neuronali in colture più mature, e all’aumento dei livelli di proteine di sionucleina. Nelle nostre mani, il trattamento con PfF a DIV8 ha dato i risultati più robusti, con un accumulo pronunciato di pS129- ssyn nel soma del neurone della dopamina, pur non compromettendo la sopravvivenza neuronale. Il protocollo descritto è adatto allo studio di trattamenti che modificano i primi eventi che portano all’aggregazione di endogenine z-sinucleina perché quantifichiamo le inclusioni positive di pS129-zsyn in un momento relativamente precoce, 7 giorni dopo l’inoculazione con i PFF. A questo punto, le inclusioni intrasomiche sono presenti in una frazione significativa di cellule e possono essere facilmente distinte dall’immunostaining mentre non si osserva la morte cellulare indotta dal PFF, semplificando l’interpretazione dei risultati. È importante sottolineare che, poiché la morfologia e la composizione delle inclusioni indotte da PFF possono cambiare nel tempo12,,13, il protocollo descritto potrebbe, in linea di principio, essere modificato per studiare inclusioni più mature per fissazione e immunostaining nei punti successivi. Tuttavia, mantenere i neuroni della dopamina in coltura per più di 15 giorni richiede estrema cura, e potrebbe indurre ulteriore variazione a causa di cellule che non riescono a sopravvivere indipendentemente dall’inoculazione PFF. Inoltre, colture più estese complicano i programmi di trattamento farmacologico. Molti composti hanno limitato o non mal caratterizzato stabilità nel mezzo di coltura cellulare, e il rifornimento di un farmaco non è banale perché lo scambio completo di mezzo compromette la sopravvivenza delle culture della dopamina.
La fosforolante della synucleina a Ser129 è costantemente riportata nei modelli basati sul PFF dell’aggregazione z-sinucleina e colocalizza con marcatori di misfolding e aggregazione come Thioflavin S, ubiquitina o anticorpi specifici della conformazione11,12. Nelle nostre mani, l’immunostaining per pS129-zsyn dà anche il segnale più forte con lo sfondo più basso ed è più semplice da analizzare, dando risultati robusti quando più trattamenti vengono sottoposti a screening. È importante sottolineare che l’immunostaining con anticorpo pS129-ssyn non rileva i PFF che rimangono al di fuori delle cellule, riducendo significativamente lo sfondo. Tuttavia, è importante ricordare che la fosfororylazione Ser129 è probabilmente uno dei primi processi collegati al misfolding di synuclein e potrebbe essere regolata in modo diverso in condizioni specifiche. Pertanto, tutti i risultati che mostrano effetti positivi su pS129-ssyn dovrebbero essere confermati da altri marcatori.
L’analisi statistica dovrebbe essere adattata in base alla progettazione sperimentale. È essenziale effettuare esperimenti in almeno tre repliche biologiche indipendenti (cioè colture neuronali primarie separate). Queste repliche devono essere placcate su piastre diverse e trattate in modo indipendente. Analizziamo i dati ottenuti da repliche su diverse piastre con design a blocchi casuali ANOVA37 per tener conto dell’abbinamento dei dati per diverse piastre sperimentali.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Prof. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni da 3i-Rigeneration da parte di Business Finland (Agenzia finlandese di finanziamento per l’innovazione), Academy of Finland #309489, #293392, #319195; Fondazione Sigrid Juselius e i fondi statutari dell’Istituto Maj di Farmacologia, PAS, Polonia.
Materials
| 0.4% Trypan Blue stain | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 15250061 | |
| 15 ml CELLSTAR Polypropylene tube | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | 188261 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 10236276001 | |
| 5 M HCl | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
| 5 M NaOH | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
| 96-well ViewPlate (Black) | PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA | 6005182 | |
| 99.5% Ethanol (EtOH) | Altia Oyj, Rajamäki, Finland | N/A | |
| AquaSil Siliconizing Fluid | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | TS-42799 | |
| Autoclaved 1.5 ml microcentrifuge tube | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
| Bioruptor sonication device | Diagenode, Liege, Belgium | B01020001 | |
| Ca2+, Mg2+ free Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 14175-053 | |
| CellProfiler and CellAnalyst software packages | N/A | N/A | free open-source software |
| Centrifuge 5702 | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 5702000019 | |
| CO2 Incubator | HeraCell, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | N/A | |
| Counting chamber | BioRad Inc., Hercules, California, USA | 1450015 | |
| DeltaVision Ultra High Resolution Microscope with air table and cabinet | GE Healthcare Life Sciences, Boston, Massachusetts, USA | 29254706 | |
| Deoxyribonuclease-I (Dnase I) | Roche, Basel, Switzerland | 22098700 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | G8769 | |
| DMEM/F12 | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 21331–020 | |
| donkey anti-mouse AlexaFluor 488 | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | A21202 | |
| donkey anti-rabbit AlexaFluor 647 | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | A31573 | |
| donkey anti-sheep AlexaFluor 488 | Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | A11015 | |
| Dulbecco's buffer | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 10500056 | |
| Fisherbrand Plain Economy PTFE Stir Bar | fisher scientific, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 11507582 | |
| ImageXpress Nano Automated Imaging System | Molecular Devices, San Jose, California, USA | N/A | |
| L-glutamine | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 25030–032 | |
| mouse monoclonal anti-tyrosine hydroxylase | Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, German | MAB318 | |
| N2 supplement | Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 17502–048 | |
| Normal Horse Serum | Vector Laboratories Inc., Burlingame, California, United States | S-2000 | |
| paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 158127 | |
| paraformaldehyde powder, 95% | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 158127 | |
| pH-Fix, color-fixed indicator strips | Macherey-Nagel, Düren, Germany | 92110 | |
| Phospohate Buffer Saline (PBS) | N/A | N/A | Media kitchen, Institute of Biotechnology, University of Helsinki |
| poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | P4957 | |
| Primocin | InvivoGen, San Diego, California, USA | ant-pm-1, ant-pm-2 | |
| rabbit monoclonal anti-alpha-synuclein filament | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab209538 | |
| rabbit monoclonal anti-phospha-serine129-alpha-synuclein | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab51253 | |
| RCT Basic, IKA Magnetic Stirrer | IKA®-Werke GmbH, Staufen, Germany | 3810000 | |
| recombinant human glia-derived neurotrophic factor (hGDNF) | PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA or Prospec, Ness-Ziona, Israel | 450-10 (PeproTech), CYT-305 (Prospec) | |
| recombinant mouse alpha synuclein Pre-Formed Fibrils (PFFs) | N/A | N/A | Gift from collaborator, Prof. Kelvin C Luk |
| Research Stereomicroscope System | Olympus Corporation, Tokyo, Japan | SZX10 | |
| sheep polyclonal anti-tyrosine hydroxylase | Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, German | ab1542 | |
| TC 20 Automated Cell Counter | BioRad Inc., Hercules, California, USA | 1450102 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | 11332481001 | |
| trypsin | MP Biomedicals, Valiant Co., Yantai, Shandong, China | 2199700 |
References
- Fearnley, J. M., Lees, A. J. Ageing and Parkinson’s disease: substantia nigra regional selectivity. Brain. 114, 2283-2301 (1991).
- Dauer, W., Przedborski, S. Parkinson’s disease: mechanisms and models. Neuron. 39 (6), 889-909 (2003).
- Shahmoradian, S. H., et al. Lewy pathology in Parkinson’s disease consists of crowded organelles and lipid membranes. Nature Neuroscience. 22 (7), 1099-1109 (2019).
- Goedert, M., Spillantini, M. G., Del Tredici, K., Braak, H. 100 years of Lewy pathology. Nature Reviews Neurology. 9 (1), 13-24 (2013).
- Surmeier, D. J., Obeso, J. A., Halliday, G. M. Selective neuronal vulnerability in Parkinson disease. Nature Reviews Neurosciences. 18 (2), 101-113 (2017).
- Leverenz, J. B., et al. Proteomic identification of novel proteins in cortical lewy bodies. Brain Pathology. 17 (2), 139-145 (2007).
- Spillantini, M. G., et al. Alpha-synuclein in Lewy bodies. Nature. 388 (6645), 839-840 (1997).
- Anderson, J. P., et al. Phosphorylation of Ser-129 is the dominant pathological modification of alpha-synuclein in familial and sporadic Lewy body disease. Journal of Biological Chemistry. 281 (40), 29739-29752 (2006).
- Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338 (6109), 949-953 (2012).
- Volpicelli-Daley, L. A., et al. Exogenous alpha-synuclein fibrils induce Lewy body pathology leading to synaptic dysfunction and neuron death. Neuron. 72 (1), 57-71 (2011).
- Volpicelli-Daley, L. A., Luk, K. C., Lee, V. M. Addition of exogenous alpha-synuclein preformed fibrils to primary neuronal cultures to seed recruitment of endogenous alpha-synuclein to Lewy body and Lewy neurite-like aggregates. Nature Protocols. 9 (9), 2135-2146 (2014).
- Osterberg, V. R., et al. Progressive aggregation of alpha-synuclein and selective degeneration of lewy inclusion-bearing neurons in a mouse model of parkinsonism. Cell Reports. 10 (8), 1252-1260 (2015).
- Mahul-Mellier, A. L., et al. The process of Lewy body formation, rather than simply alpha-synuclein fibrillization, is the major driver of neurodegeneration in synucleinopathies. J bioRxiv. , (2019).
- Elkouzi, A., Vedam-Mai, V., Eisinger, R. S., Okun, M. S. Emerging therapies in Parkinson disease – repurposed drugs and new approaches. Nature Reviews Neurology. 15 (4), 204-223 (2019).
- Barker, R. A., Gotz, M., Parmar, M. New approaches for brain repair-from rescue to reprogramming. Nature. 557 (7705), 329-334 (2018).
- Kordower, J. H., Chu, Y., Hauser, R. A., Olanow, C. W., Freeman, T. B. Transplanted dopaminergic neurons develop PD pathologic changes: a second case report. Movement Disorders. 23 (16), 2303-2306 (2008).
- Li, J. Y., et al. Lewy bodies in grafted neurons in subjects with Parkinson’s disease suggest host-to-graft disease propagation. Nature Medicine. 14 (5), 501-503 (2008).
- Planken, A., Porokuokka, L. L., Hanninen, A. L., Tuominen, R. K., Andressoo, J. O. Medium-throughput computer aided micro-island method to assay embryonic dopaminergic neuron cultures in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 194 (1), 122-131 (2010).
- Lin, L. F., Doherty, D. H., Lile, J. D., Bektesh, S., Collins, F. GDNF: a glial cell line-derived neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurons. Science. 260 (5111), 1130-1132 (1993).
- Hoffer, B. J., et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor reverses toxin-induced injury to midbrain dopaminergic neurons in vivo. Neuroscience Letters. 182 (1), 107-111 (1994).
- Kearns, C. M., Gash, D. M. GDNF protects nigral dopamine neurons against 6-hydroxydopamine in vivo. Brain Research. 672 (1-2), 104-111 (1995).
- Kirik, D., Rosenblad, C., Bjorklund, A., Mandel, R. J. Long-term rAAV-mediated gene transfer of GDNF in the rat Parkinson’s model: intrastriatal but not intranigral transduction promotes functional regeneration in the lesioned nigrostriatal system. Journal of Neuroscience. 20 (12), 4686-4700 (2000).
- Chmielarz, P., et al. GDNF/RET signaling pathway activation eliminates Lewy Body pathology in midbrain dopamine neurons. J bioRxiv. , 752899 (2019).
- Ganjam, G. K., et al. Mitochondrial damage by α-synuclein causes cell death in human dopaminergic neurons. Cell Death & Disease. 10 (11), 865 (2019).
- Bieri, G., et al. LRRK2 modifies α-syn pathology and spread in mouse models and human neurons. Acta Neuropathologica. 137 (6), 961-980 (2019).
- Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).
- McQuin, C., et al. CellProfiler 3.0: Next-generation image processing for biology. PLoS Biology. 16 (7), 2005970 (2018).
- Kumar, S. T., Donzelli, S., Chiki, A., Syed, M. M. K., Lashuel, H. A. A simple, versatile and robust centrifugation-based filtration protocol for the isolation and quantification of alpha-synuclein monomers, oligomers and fibrils: Towards improving experimental reproducibility in alpha-synuclein research. Journal of Neurochemistry. , (2020).
- Polinski, N. K., et al. Best Practices for Generating and Using Alpha-Synuclein Pre-Formed Fibrils to Model Parkinson’s Disease in Rodents. Journal of Parkinsons Disease. 8 (2), 303-322 (2018).
- Patterson, J. R., et al. Generation of Alpha-Synuclein Preformed Fibrils from Monomers and Use In Vivo. Journal of Visualized Experiments. (148), e59758 (2019).
- Bousset, L., Brundin, P., Bockmann, A., Meier, B., Melki, R. An Efficient Procedure for Removal and Inactivation of Alpha-Synuclein Assemblies from Laboratory Materials. Journal of Parkinsons Disease. 6 (1), 143-151 (2016).
- Jones, T. R., et al. Scoring diverse cellular morphologies in image-based screens with iterative feedback and machine learning. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 106 (6), 1826-1831 (2009).
- Braak, H., et al. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson’s disease. Neurobiology of Aging. 24 (2), 197-211 (2003).
- Liss, B., Roeper, J. Individual dopamine midbrain neurons: functional diversity and flexibility in health and disease. Brain Research Reviews. 58 (2), 314-321 (2008).
- Sulzer, D., Surmeier, D. J. Neuronal vulnerability, pathogenesis, and Parkinson’s disease. Movement Disorders. 28 (1), 41-50 (2013).
- Peelaerts, W., et al. alpha-Synuclein strains cause distinct synucleinopathies after local and systemic administration. Nature. 522 (7556), 340-344 (2015).
- Lew, M. Good statistical practice in pharmacology. Problem 1. British Journal of Pharmacology. 152 (3), 295-298 (2007).
