نموذج القُزلة السنخية البشرية متعددة الخلايا يتكون من الخلايا الظهارية والخلايا المناعية الأولية لتقييم المخاطر
Summary
قدم هنا هو بروتوكول لعزلة أحادية الدم الإنسان الأولية وكذلك تمايزها في الضامة والخلايا التشعبية والتجميع مع الخلايا الظهارية في نموذج الرئة البشرية متعددة الخلايا. وتقارن الاستجابات البيولوجية لثقافات النقوش المكونة من خلايا مناعية متمايزة عن الخلايا الأحادية المعزولة حديثا أو المذابة، عند التعرض للمحفزات البهوية.
Abstract
ويرد هنا نموذج لزراعة الخلايا القُصَلية البشرية لمحاكاة حاجز الأنسجة الظهارية السنخية المكون من خلايا ظهارية من النوع الثاني واثنين من أنواع الخلايا المناعية (أي الضامة المشتقة من أحادية الخلايا البشرية [MDMs] والخلايا التكينة [MDDCs]). يتم توفير بروتوكول لتجميع النموذج متعدد الخلايا. تنمو الخلايا الظهارية السنخية (خط الخلية A549) وتتمايز في ظل ظروف مغمورة على إدراج نفاذي في آبار من غرفتين، ثم جنبا إلى جنب مع MDMs متفاوتة وDDCS. وأخيراً، تتعرض الخلايا لواجهة هوائية سائلة لعدة أيام. كما الخلايا المناعية الأولية البشرية تحتاج إلى عزل من المعاطف بافي الإنسان، يتم مقارنة الخلايا المناعية التي تم تمييزها من إما أحاديات الطازجة أو المذابة من أجل تكييف الأسلوب على أساس الاحتياجات التجريبية. تظهر النماذج ثلاثية الأبعاد ، المكونة من خلايا قُزَّرة إما معزولة حديثًا أو مذابة خلايا مناعية مشتقة من أحادية السُنَة ، زيادة كبيرة إحصائيًا في السيتوكين (إنترلوكين 6 و 8) عند التعرض للمحفزات البروتينية (liplysaccharide وعامل نخر الورم α) مقارنة بالخلايا غير المعالجة. من ناحية أخرى، لا يوجد فرق مهم إحصائيا بين الإفراج السيتوكين لوحظ في الثقافات. وهذا يدل على أن النموذج المقدم يستجيب للمحفزات البروينفلية في وجود MDMs و MDDCs التي تميّز من ذوبان أو ذوبان ونُسج الدم المحيطي الطازجة (PBMs). وبالتالي، فهو أداة قوية للتحقيق في الاستجابة البيولوجية الحادة لمختلف المواد، بما في ذلك العقاقير الهباءية أو المواد النانوية.
Introduction
في الثقافات في خلايا الرئة في المختبر تقدم فعالة من حيث التكلفة، قوية، ومنصات تسيطر عليها بشكل جيد لتقييم مخاطر الهباء الجوي1. كنظام الخلايا النموذجية لثنوموسيات الأمهرة السنخية البشرية، وغالبا ما يستخدم خط الخلية A549 الظهارية المعزولة من غدية رئوية2. هذه الخلايا تمثل الخلايا الظهارية من النوع الثاني الحرشفية من المنطقة القُصيبية3 وهي عبارة عن خط خلايا الرئة المستخدم على نطاق واسع لتقييم الخطر والسمية1،4،5,،6،7،8،9،10. يمتلك خط الخلية A549 ميزات ذات صلة من خلايا النوع الظهاري الثاني السنخية ، مثل وجود أجسام لميلاس مميزة تحتوي على فوسفوليبيدات معبأة بكثافة3.
وقد تبين أنه عندما يتم استزراع الخلايا في واجهة الهواء السائل (ALI)، يتم تحرير السطحي على الجانب apical من الخلايا الظهارية الهواء المكشوفة، والحد من التوترالسطحي 11،12،13. هذه الميزة هي ذات أهمية خاصة في المواد النانوية في التنفس وفحوصات السمية. مرة واحدة يتم ترسيس المواد النانوية المستنشقة / المواد السامة في منطقة السنخية، فإنها تتفاعل أولا مع السطح الرئوي ويتم تشريدها من قبل قوات التبول في hypophase مائي، حيث التفاعل مع الخلايا الرئوية يحدث14،15. على الرغم من أن الخلايا A549 تشكل أحادية الطبقة (التي يمكن أن overgrow في multilayers في وقت لاحق من النقاط الزمنية عندما تزرع في ALI) وإنتاج السطحي، والعيب هو عدم كفاية تشكيل تقاطع ضيق، مما أدى إلى انخفاض قيم المقاومة الكهربائية transepithelial، ولكن لا يزال تقديم حاجز وظيفي ضد بين الخلايا (نانو) الجسيمات نقل المواقع16،17،18.
في الرئتين، هناك مجموعة متنوعة من مجموعات الخلايا المناعية، بما في ذلك الخلايا التي تقدم المستضدات بالبلعية والمهنية (أي الضامة والخلايا التشعبية) التي تتواصل مباشرة من خلال الاتصال الخلوي أو الإشارات بين الخلايا للتحكم في التوازن والحفاظ عليه. الضامة والخلايا التشعبية هي الآثار المناعية الفطرية الحرجة والمبادرين من الاستجابة المناعية التكيفية19. يمكن للخلايا التشعبية المقيمة داخل أو تحت الظهارة أن تشكل نتوءات عبر الظهارة إلى التجويف لالتقاط المستضدات. تقع الضامة السنوية على السطح الكبي للظهارة وتعمل كخلايا خرابة ، تمثل أول دفاع خلوي ضد المواد الأجنبية وكذلك العدوى البكتيرية والفيروسية والفطرية. اللدونة phenotypic يسمح التعريفي بسرعة من ردود الفعل proinflammatory ردا على هذه المحفزات وكذلك التحول إلى اثارة مضادة للالتهابات (أي، مثبطة) ردود الفعل20.
لمحاكاة حاجز الأنسجة الظهارية السنخية البشرية، أنشأنا نموذج تربية الأحياء الثلاثية مع الخلايا A549 تكملها الضامة المشتقة من الدم البشري (MDMs) والخلايا التشعبية (MDDCs) على الجانبين apical والقاعدة، على التوالي17. وقد تم الإبلاغ سابقا عن زراعة هذا النموذج في ALI16، حتى تصل إلى 72 ساعة بعد التعرض21. وقد تعززت الاستجابات المناعية الحادة للتعرض للأنابيب النانوية الكربونية بشكل كبير في زراعة الخلايا المعرضة لـ ALI مقارنة بالظروف المغمورة22. نموذج تربية الأحياء، المستزرعة والمعرضة لمواد مختلفة في ALI، وقد استخدمت سابقا للتحقيق في السمية الخلوية، والإجهاد التأسدي والاستجابات الالتهابية على التعرض لأكسيد الزنك،23 المواد ذات الصلة الجرافين24، الذهب الجسيمات النانوية25،26، الكربون نانوتيوب21، والرماد البركاني وجزيئات العادمالديزل 27.
وعلاوة على ذلك، تم تأكيد الدور الهام لل الضامة والخلايا التشعبية كخلايا مناعية في نموذج الرئة البشري في المختبر. على وجه الخصوص، لوحظ استجابة proinflammatory زيادة في النموذج فقط في وجود الخلايا المناعية بالمقارنة مع نظم أحادية الاستزراع7. تتمثل العيوب المحتملة لاستخدام الخلايا المناعية الأولية المشتقة من أحادية الخلايا في محدودية إمكانية الوصول إلى PBMs وكذلك الاختلاف بين المانحين والمتبرعين. كحل لهذه العيوب المحتملة ، المقدمة هنا هو بروتوكول إدخال حفظ التبريد من PBMs المعزولة حديثا28 لثقافة الخلية نموذج التجميع. الهدف من هذه الدراسة هو إثبات 3D الإنسان 3D الأنسجة الظهارية الجمعية الظهارية، بما في ذلك عزل PBMs من المعاطف بافي الإنسان. وتقارن الاستجابة للمحفزات الحفزية بالنموذج المؤلف من الـ MDMs وMDDCs المتمايزة عن برامج العمل الناشئة أو المتمايزة عن PBMs المجمدة/المذابة.
ويتطلب العمل مع عينات دم بشرية لم تختبر بعد رعاية محددة لمنع انتقال الأمراض المعدية المحتملة، مثل فيروس نقص المناعة البشرية والتهاب الكبد B والتهاب الكبد C. ولذلك، فإن استخدام تدابير الحماية الشخصية مثل القفازات والعباءات والأقنعة وحماية العين أمر بالغ الأهمية ويجب أن يكون وفقا لمبادئ الممارسة المختبرية الجيدة. هذه الحماية تقلل من خطر تعريض الجلد أو الأغشية المخاطية للسوائل المعدية المحتملة. بالإضافة إلى ذلك، بالنسبة لأولئك الذين يشاركون في التعامل مع المعاطف البافي وPMS، فإن التطعيم ضد فيروس التهاب الكبد B إلزامي، ومستويات تتر الدم من الأجسام المضادة لالتهاب الكبد B يجب أن تكون فوق 100 وحدة دولية /لتر (يجب معالجة المتطلبات التشريعية الخاصة بالبلد). وبالإضافة إلى ذلك، يجب أن يتم تنفيذ جميع الأعمال في مختبرات السلامة الأحيائية 2 (يلزم معالجة المتطلبات التشريعية الخاصة بكل بلد). وينبغي عند إجراء البروتوكول بأكمله اعتماد احتياطات معيارية للصحة والسلامة ترتبط بالعمل في بيئة مختبرية ومناولة ثقافة خلايا الثدييات، بما في ذلك مناولة النفايات.
Protocol
Representative Results
Discussion
10- إن إنتاج المواد الجديدة، بما في ذلك المواد الكيميائية والعقاقير، يزيد تدريجياً من الحاجة إلى نماذج تنبؤية في المختبر. الامتثال للمبادئ الثلاثة للاحلال، والحد، وصقل اختبار الحيوانات32، في المختبر نماذج الخلايا أصبحت أدوات قوية فيما يتعلق بجانب الاستبدال والحد من آليات توضيح المخدرات أو المادة العمل8،9،10،11. هنا هو بروتوكول مفصل لتجميع نموذج متعدد الخلايا باستخدام الخلايا المناعية التي هي إما معزولة حديثا أو إذابة من monocytes المجمدة سابقا. كما وصف زراعة النموذج في ALI. وأخيراً، يوضح البروتوكول مثالاً على التعرض للمحفزات البهوية ويقارن استجابة النموذجين اللذين يحتويان إما على وحدات أحادية جديدة أو مجمدة.
وقد أجريت دراسات مختلفة لتأكيد وتبرير القيمة المضافة للتعقيدات المعززة للنماذج التي نمت وتتعرض في ظل ظروف ALI مقارنة بالتعرض المغمور التقليدي7,22,31. مراقبة استجابة بروتينفلاmmatory أعلى في الثقافات المشتركة بالمقارنة مع الثقافات الأحادية للخلايا الظهارية تؤكد دراسة سابقة. واستخدمت الدراسة نموذج استزراع التكتهين (حفز مع LPS) وأظهرت استجابة أعلى عند مستويات التعبير الجيني لـ TNF و IL1B مقارنة بنموذج مكافئ A549 أحادي الثقافة7. من ناحية أخرى، أظهر كلا النموذجين اختلافات أعلى داخل قيم إطلاق الوسيط البروفلورية المقاسة مقارنة بزراعة A549 الأحادية. ويمكن تفسير ذلك باستخدام الخلايا المناعية من المتبرعين المختلفين (المعاطف البافية) ضمن التكرار البيولوجي (أي التكرار، متبرع واحد)، كما هو مبينسابقاً 7. إذا رغبت في ذلك، يمكن التغلب على الاختلافات بين التكرارات من قبل 1) باستخدام PBMs المذاب من نفس المانح أو 2) تجميع PBMs من مختلف المانحين قبل تجميد الخلايا، ثم استخدام لاحق لنفس التجمع في كل تكرار. كما يوصى أيضاً بإدراج المزيد من التكرارات البيولوجية.
يمكن اعتبار تقنية تجميد الخلايا كخطوة حاسمة; ومع ذلك، فمن إجراء مختبري مشترك للحفاظ على الخلايا لتحليل ظاهري وظيفية. وقد أظهرت الدراسات المختلفة أن نوعية PBMs المجمدة أمر حيوي لبقائهم، وتقنية التجميد المناسبة هي المفتاح لنجاح عمليات الفحص اللاحقة مع نفس الخلايا28,32. ويمكن إجراء تعديل للبروتوكول عن طريق تجميد PBMs، مما يوفر المرونة في الإعداد التجريبي، حيث أن توافر المعاطف البافي عادة ما يكون محدودا. ميزة أخرى لاستخدام PBMs المجمدة (في عدة قوارير) على تلك المعزولة حديثا هو أنها يمكن استخدامها في التجارب اللاحقة حتى بعد 1 سنة. ويقلل هذا الأمر من المسألة المحتملة للتباين بين المانحين والمانحين إذا كان هذا المعلمة مرغوباً أو مطلوباً في تجربة.
تظهر نتائج مقارنة بين الاحتياد التي أجريت بعد ما يصل إلى 13 شهراً أن PBMs، عندما تخزن بشكل صحيح في خزان النيتروجين السائل، يمكن استخدامها على مدى فترة طويلة دون أي تأثير على جدوى الخلية أو استعادة الخلايا33. قد تكون أوقات التخزين الأطول (أكثر من سنة) ممكنة عند التحقق من صحة الخلية وسرعة الاستجابة لها قبل إجراء تجربة. أيضا، يجب أن تظل درجة الحرارة في خزان النيتروجين السائل مستقرة في جميع الأوقات. ووجد أن العامل الرئيسي الذي يؤثر على صلاحية نظام PBMs المبردة هو تركيز نظام إدارة الاستدامة المالي، مع التركيز الأمثل من 10% إلى 20% (v/v)28. للتقليل من الآثار الضارة المحتملة للتجميد، مصادر مختلفة من البروتينات، FBS أو BSA (مع مجموعة واسعة من التركيز من 40٪ تصل إلى 100٪34)غالبا ما تضاف إلى وسيطة تجميد كمكونات وقائية طبيعية يمكن أن تزيد من بقاء الخلايا.
نظراً لإمكانية السمية الخلوية العالية لـ DMSO، فمن المستحسن أولاً تشتيت PBMs في FBS، ثم إضافة DMSO إلى PBMs المنتشرة بالفعل في FBS. وتجدر الإشارة إلى أنه على الرغم من وجود تركيزات عالية من FBS (> 40%) لم تظهر أي تحسن في جدوى الخلية، في الوقت نفسه، فإنها لم تسبب ضررا للخلايا28. ومع ذلك، تجميد monocytes هو نهج ممكن للتغلب على قضايا توافر معطف بافي محدودة. ومع ذلك، إذا كان استخدام MDDCs وMM من PBMs الطازجة هو المطلوب، يمكن أن تكون متباينة الخلايا المناعية واستخدامها 5-8 أيام بعد العزل7،16،17،35،36،37. وإذا سمح التخطيط التجريبي، يوصى بتمايز 6 أيام على الأقل في كل من البلدان المتعددة الأطراف للبلدان النامية الجزرية المتعددة الأطراف وMDMs. ومع ذلك، فإن الاتساق بين التكرارات المختلفة في نفس التجربة، إلى جانب عمليات التفتيش الروتينية لتعابير علامات سطحها المحددة، أمر بالغ الأهمية. وينبغي أيضا أن يتم التحقق بانتظام من الاستجابة للحافز البروينفلوري، مثل LPS، بعد وقت التمايز.
وقد أجريت العديد من التحقيقات باستخدام خط الخلية A549 في ALI، إما باعتبارها أحادية أو جنبا إلى جنب مع أنواع الخلايا الأخرى (الضامة، الخلايا التشعبية، أو الخلايا الليفية) في نموذج 3D تربية الأحياء22،24،29،38. باستخدام هذا النموذج 3D coculture، السمية الخلوية، والأكسدة، أو آثار proinflammatory من (نانو-) وقد تم التحقيق في المواد لمدة تصل إلى 72 ح1،,17،,21،,24،,29. وقد سبق التحقيق في التشابه في نموذج في الأنسجة الجسمية استنادا إلى التصوير الضوئي بالليزر confocal من نموذج16. عند تجميع النموذج، من المهم النظر في كل من انتشار الخلايا (التي يمكن أن تؤثر على A549 في النموذج المعروض هنا) وكذلك أداء الخلايا المناعية الأولية (لا تتكاثر) (هنا، MDDCs وMDMs). ومن المهم أيضاً أن تؤخذ في الاعتبار أن الخلايا غير جميع الوحديات الموجبة CD14 تفرق إلى مراكز متعددة الأطراف للأدوية وMDMs، وأن الخلايا يمكن أن تكون موجودة في كل من النماذج المرفقة والموقفة. استناداً إلى طبيعة الجمعية لزراعة نقّال (هنا، كلا النوعين من الخلايا بحاجة إلى إرفاق الطبقة الظهارية الموجودة)، فمن المستحسن استخدام فقط أتباع السكان الفرعية من كلا النوعين من الخلايا المناعية. بالإضافة إلى ذلك، فإن التحليلات الروتينية للوحدات الأحادية و MDDC و MDM استجابة أحادية الثقافة LPS، والتعبير عن علامات سطحية محددة (CD14، CD163، CD86، CD93، أو CD206، البيانات غير مبينة) قد اقترحت أن 6 و 7 أيام من التمييز هي النقاط الزمنية المثلى.
على الرغم من أن عددا واقعيا من الخلايا الظهارية القُزُلية في الرئتين البشرية يتوافق مع ~ 160،000 الخلايا / سم2، وعدد الخلايا A549 عد في النموذج هو ~ 1،000،000 الخلايا / سم2 بعد 9 أيام مثقف على إدراج16،18. وبالتالي، يجب النظر في هذا القيد في النموذج في المختبر. أولاً، تم تأسيس كثافة الخلايا الظهارية بناء على قدرتها على تشكيل طبقة التقاء على الغشاء المتنامي. ومن المهم أيضا أن نذكر أن A549 يمثل خلية من النوع الظهاري الثاني مع شكل الظهارية، على عكس الخلايا الظهارية الأولى، والتي هي مسطحة و outspread. من ناحية أخرى ، تم تأسيس العدد المطلوب من الخلايا المناعية على أساس الأدب وعرضها في هذا البروتوكول كرقم الخلية / مساحة السطح39،40،41. كثافة الخلية من MDDCs في نطاق 400 الخلايا / ملم2 (4 خلايا / سم2)16 هو مماثل للثابتة حالة كثافة الخلايا من 500-750 خلايا / مم2 (5- 7 الخلايا / سم2)ذكرت من في دراسات vivo39. كثافة MDMs في هذا النموذج ضمن نفس النطاق من في حالة في الجسم الحي في المنطقة السنخية البشرية40.
لوحظ تلطيخ علامة الضامة الناضجة (25F9) في الجانب الزفيري (حيث توجد MDMs) وكذلك الجانب القاعدي (أي، في موقع الخلايا المتججرة). نقل الخلايا المناعية من خلال الغشاء إدراج المسام من الممكن ، وقد لوحظ أيضا باستخدام هذا النموذج16، والتي قد تفسر الاختلافات الملاحظة في كثافة تلطيخ. ومع ذلك، تفسير آخر ممكن هو أن علامة الضامة الناضجة يمكن أيضا أن أعرب عن خلايا التشعب، ولكن التعبير هو المانحة للغاية42محددة . أيضا، فإن كثافة التعبير 25F9 أعلى بكثير في MDMs (الشكل 7، الشكل 8). كل من المحفزات proinflammatory (LPS و TNF-α) أثرت على سلامة حاجز الظهارية الرئوية في كل من الثقافات(الشكل 7، الشكل 8). وكان هذا متوقعا على أساس المنشورات السابقة43،44 تبين أن السيتوكينات proinflammatory والمنتجات البكتيرية تعطيل سلامة الحواجز الظهارية.
نموذج متعدد الخلايا 3D من ظهارة السنخية البشرية، التي أنشئت وتتميز سابقا17،وقد خدم كأداة قوية ومفيدة لتقييم الاستجابات البيولوجية (أي، ردود الفعل proinflammatory الحاد، استجابة الإجهاد التأسدي، وتوزيع الجسيمات، والاتصالات الخلوية) في المختبر21،24،25،45. وتؤكد النتائج على إعادة النقية من نماذج تربية الأحياء إلى المحفزات proinflammatory (هنا، LPS و TNF-α). وزادت الاستجابة قليلا عند استخدام الخلايا المناعية من PBMs جديدة; ومع ذلك، لم يكن هناك فرق إحصائياً هاماً بين الثقافات المشتركة باستخدام PBMs العذبة مقابل المذابة. وعلاوة على ذلك، كانت ردود الفعل البروينفلورية لكلا النموذجين لزراعة تربية الظهارة أعلى من تلك التي كانت من الظهارية أحادية الخلية المزروعة في ظل نفس الظروف (ALI). وباختصار، يصف البروتوكول تجميع نموذج تربية ظهارية بشرية ثلاثية الأبعاد ثلاثية الأبعاد باستخدام برامج عمل ثنائية عذبة أو مذابة للتمايز في MDMs و MDDCs. وتبين أن كلا النموذجين يستجيبان بدرجة عالية للمحفزات البهائية. ولذلك، يمكن أن تكون بمثابة أدوات قوية لتقييمات المخاطر المحتملة والسمية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود المؤلفون أن يشكروا الدكتور ميغيل سبوش – كالفار على مخطط تربية الأحياء في الشكل 3 وللدكتورة بيديا بيغوم كاراكوكاك على القراءة النقدية. وقد دعم هذه الدراسة مشروع الدوريات، وبرنامج الاتحاد الأوروبي للبحوث والابتكار في أفق 2020 بموجب اتفاقية المنحة رقم 760813، ومؤسسة أدولف ميركل. B.D. يشكر بيتر أوند ترادل إنغلهورن مؤسسة للدعم المالي.
Materials
| Benchmark microplate reader | does not have to be specific, for example BioRad, Cressier, Switzerland | ||
| Cell culture Incubator | does not have to be specific | ||
| Cell freezing container (for example Mr. Frosty) | does not have to be specific | ||
| Centrifuge | does not have to be specific | ||
| Confocal laser scanning microscope | does not have to be specific, for example | Zeiss LSM 710 meta | |
| Heamatocytometer, or automatic cell counter | does not have to be specific | ||
| Laminar bio-safety hood class II | does not have to be specific | ||
| MultiStand Macs (Macs Cell Separator) | Miltenyi, Germany | 130-042-303 | |
| pH meter | does not have to be specific | ||
| Phase contrast inverted light microscope | does not have to be specific | ||
| Pipette boy, pipettors (different volumes) | do not have to be specific | ||
| Scissors | do not have to be specific | ||
| Vacuum pump | does not have to be specific | ||
| Water bath | does not have to be specific | ||
| Disposable small equipment/glassware | Catalogue Number | ||
| 15 mL and 50 mL conical centrifuge tubes | does not have to be specific | ||
| 6- and 12-well cell culture plates, flat bottom, low evaporation lid, sterile | Falcon, Switzerland | 353046 and 353043 | |
| Cell culture inserts, transparent PET membrane, 12-well, 3 μm pore size | Falcon, Switzerland | 353181 | |
| Cell scrapper | does not have to be specific, for example VWR, Switzerland | 353085 | |
| Cryovials | do not have to be specific | ||
| Glass autoclaved Petri Dishes | do not have to be specific | ||
| LS Columns | Miltenyi, Germany | 130-042-401 | |
| Sterile filtration cup for vacuum filtration, 0.2 μm pore size | does not have to be specific, for example VWR, Switzerland | 10040-446 | |
| Sterile Lab Bottle compatible with Filtration cup (min. 100 mL) | does not have to be specific | ||
| Sterile pipettes | do not have to be specific | ||
| Chemicals | |||
| Bovine serum albumine (BSA) | Sigma-Aldrich, Switzerland | A7030-100g | |
| CD14+ MicroBeads human – magnetic beads | Miltenyi, Germany | 130-097-052 | |
| Deattachnig agent Trypsin-EDTA, 0.05%, phenol red | Gibco, Switzerland | 25300054 | |
| Density gradient medium Lymphoprep | Alere Technologies AS, Norway | 1114547 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich, Switzerland | D5879_1L | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich, Switzerland | E6758-100g | |
| Fetal bovine serum (heat inactivated) | Gibco, Switzerland | 10270-106 | |
| Human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), premium grade | Miltenyi, Germany | 130-093-864 | |
| Human Interleukin 4 (IL-4), premium grade | Miltenyi, Germany | 130-095-373 | |
| Human macrophage colony-stimulating factor (M-CSF), premium grade | Miltenyi, Germany | 130-096-485 | |
| L-glutamine | Gibco, Switzerland | 25030-024 | |
| Lipopolysaccharid (LPS) from Escherichia coli | Sigma-Aldrich, Switzerland | 4524-5mg | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, Switzerland | 158127 | |
| Penicilin-Streptomycin | Gibco, Switzerland | 31870-025 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Gibco, Switzerland | 14190-094 | |
| Roswell Park Memorial Institute-1640 Medium (RPMI) | Gibco, Switzerland | 11875093 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, Switzerland | T8787 | |
| Trypan blue solution (0.4%) | Sigma Aldrich, Switzerland | ||
| Tumor necrosis factor alpha (TNF-α) | Immunotools | 11343015 | |
| Assays used for cytotoxicity, (pro-)inflammatory response | |||
| Cytotoxicity Detection Kit (LDH) | Roche, Switzerland | 11644793001 | |
| Human IL-6 DuoSet ELISA | R&D, Biotechne, Switzerland | DY206 | |
| Human IL-8/CXCL8 DuoSet ELISA | R&D, Biotechne, Switzerland | DY208 | |
| Immunostaining | |||
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), concentration 2 μg/mL | Sigma-Aldrich, Switzerland | 28718-90-3 | |
| Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 647 conjugated, concentration 20 μg/mL | Abcam, UK | ab150115 | |
| Goat anti-rabbit IgG antibody (H+L) Dylight 488 conjugated, concentration 10 μg/mL | Agrisera, Sweden | AS09 633 | |
| Mature Macrophage Marker Monoclonal Antibody, concentration 50 μg/mL | eBioScience, Thermo Fischer, Switzerland | 14-0115-82 | |
| Phalloidin rhodamine, concentration 0.264 µM | Molecular Probes, Life Technologies, Switzerland | R415 | |
| Recombinant Anti-CD83 antibody, 1:50 dillution | Abcam, UK | ab244204 |
References
- Rothen-Rutishauser, B., Blank, F., Mühlfeld, C., Gehr, P. In vitro models of the human epithelial airway barrier to study the toxic potential of particulate matter. Expert Opinion on Drug Metabolism and Toxicology. 4 (8), 1075-1089 (2008).
- Giard, D., et al. In vitro cultivation of human tumors: establishment of cell lines derived from a series of solid tumors. Journal of National Cancer Institute. 51 (5), 1417-1423 (1973).
- Ochs, M., Weibel, E. R., Grippi, M. A. Ch. 2: Functional Design of the Human Lung for Gas Exchange . Fishman’s Pulmonary Diseases and Disorders, 5e. , (2008).
- Foster, K. A., Oster, C. G., Mayer, M. M., Avery, M. L., Audus, K. L. Characterization of the A549 Cell Line as a Type II Pulmonary Epithelial Cell Model for Drug Metabolism. Experimental Cell Research. 243 (2), 359-366 (1998).
- Guo, X. Y., Lu, M., Chen, X. Q., He, F. D., Li, A. Correlation study of biological characteristics of non-small cell lung cancer A549 cells after transfecting plasmid by microbubble ultrasound contrast agent. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine. 9 (6), 582-586 (2016).
- Cooper, J. R., et al. Long Term Culture of the A549 Cancer Cell Line Promotes Multilamellar Body Formation and Differentiation towards an Alveolar Type II Pneumocyte Phenotype. PLoS ONE. 11 (10), 0164438 (2016).
- Bisig, C., Voss, C., Petri-Fink, A., Rothen-Rutishauser, B. The crux of positive controls – Proinflammatory responses in lung cell models. Toxicology In Vitro. 54, 189-193 (2019).
- Rothen-Rutishauser, B., et al. A newly developed in vitro model of the human epithelial airway barrier to study the toxic potential of nanoparticles. ALTEX. 25, (2008).
- Braakhuis, H. M., et al. Progress and future of in vitro models to study translocation of nanoparticles. Archives of Toxicology. 89 (9), 1469-1495 (2015).
- Thai, P., Chen, Y., Dolganov, G., Wu, R. Differential regulation of MUC5AC/Muc5ac and hCLCA-1/mGob-5 expression in airway epithelium. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 33 (6), 523-530 (2005).
- Wu, J., et al. Characterization of air-liquid interface culture of A549 alveolar epithelial cells. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 51 (2), 6950 (2017).
- Shapiro, D. I., Nardone, L. L., Rooney, S. A., Motoyama, E. K., Munoz, J. L. Phospholipid biosynthesis and secretion by a cell line (A549) which resembles type II aleveolar epithelial cells. Biochimica and Biophysica Acta. 530 (2), 197-207 (1978).
- Balis, J., Bumgarner, S. D., Paciga, J. E., Paterson, J. F., Shelley, S. A. Synthesis of lung surfactant-associated glycoproteins by A549 cells: description of an in vitro model for human type II cell dysfunction. Experimental Lung Research. 6 (3-4), 197-213 (1984).
- Schurch, S., Gehr, P., Im Hof, V., Geiser, M., Green, F. Surfactant displaces particles toward the epithelium in airways and alveoli. Respiration Physiology. 80 (1), 17-32 (1990).
- Gehr, P., Schurch, S., Berthiaume, Y., Hof, V. I., Geiser, M. Particle Retention in Airways by Surfactant. Journal of Aerosol Medicine. 3 (1), 27-43 (2009).
- Blank, F., Rothen-Rutishauser, B., Gehr, P. Dendritic Cells and Macrophages Form a Transepithelial Network against Foreign Particulate Antigens. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 36 (6), (2007).
- Rothen-Rutishauser, B. M., Kiama, S. G., Gehr, P. A three-dimensional cellular model of the human respiratory tract to study the interaction with particles. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 32, (2005).
- Blank, F., Rothen-Rutishauser, B. M., Schurch, S., Gehr, P. An optimized in vitro model of the respiratory tract wall to study particle cell interactions. Journal of Aerosol Medicine. 19, (2006).
- Jardine, L., et al. Lipopolysaccharide inhalation recruits monocytes and dendritic cell subsets to the alveolar airspace. Nature Communications. 10 (1), 1999 (2019).
- Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nature Immunology. 16 (1), 36-44 (2015).
- Chortarea, S., et al. Repeated exposure to carbon nanotube-based aerosols does not affect the functional properties of a 3D human epithelial airway model. Nanotoxicology. 9 (8), 983-993 (2015).
- Hilton, G., Barosova, H., Petri-Fink, A., Rothen-Rutishauser, B., Bereman, M. Leveraging proteomics to compare submerged versus air-liquid interface carbon nanotube exposure to a 3D lung cell model. Toxicology In Vitro. 54, 58-66 (2019).
- Brandenberger, C., et al. Effects and uptake of gold nanoparticles deposited at the air-liquid interface of a human epithelial airway model. Toxicology and Applied Pharmacology. 242, (2010).
- Drasler, B., et al. Single exposure to aerosolized graphene oxide and graphene nanoplatelets did not initiate an acute biological response in a 3D human lung model. Carbon. 137, 125-135 (2018).
- Durantie, E., et al. Carbon nanodots: Opportunities and limitations to study their biodistribution at the human lung epithelial tissue barrier. Biointerphases. 13, (2018).
- Brandenberger, C., et al. Quantitative evaluation of cellular uptake and trafficking of plain and polyethylene glycol-coated gold nanoparticles. Small. 6 (15), 1669-1678 (2010).
- Tomašek, I., et al. Combined exposure of diesel exhaust particles and respirable Soufrière Hills volcanic ash causes a (pro-)inflammatory response in an in vitro multicellular epithelial tissue barrier model. Particle and Fibre Toxicology. 13 (1), 67 (2016).
- Nazarpour, R., et al. Optimization of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs) Cryopreservation. International Journal of Molecular and Cellular Medicine. 1 (2), 88-93 (2012).
- Endes, C., et al. An in vitro testing strategy towards mimicking the inhalation of high aspect ratio nanoparticles. Particle and Fibre Toxicology. 11 (1), (2014).
- Ju, X., et al. The Analysis of CD83 Expression on Human Immune Cells Identifies a Unique CD83+-Activated T Cell Population. Journal of Immunology. 197 (12), 4613-4625 (2016).
- Lenz, A. G., et al. Inflammatory and Oxidative Stress Responses of an Alveolar Epithelial Cell Line to Airborne Zinc Oxide Nanoparticles at the Air-Liquid Interface: A Comparison with Conventional, Submerged Cell-Culture Conditions. BioMed Research International. , 12 (2013).
- Germann, A., Schulz, J. C., Kemp-Kamke, B., Zimmermann, H., von Briesen, H. Standardized serum-free cryomedia maintain peripheral blood mononuclear cell viability, recovery, and antigen-specific T-cell response compared to fetal calf serum-based medium. Biopreservation and Biobanking. 9 (3), 229-236 (2011).
- Weinberg, A., et al. Optimization and Limitations of Use of Cryopreserved Peripheral Blood Mononuclear Cells for Functional and Phenotypic T-Cell Characterization. Clinical and Vaccine Immunology. 16 (8), 1176 (2009).
- Freshney, R. I., Freshney, R. I. . Culture of animal cells: a manual of basic technique. , 321-334 (2005).
- Lehmann, A. B. C., Blank, F., Gehr, P., Rothen-Rutishauser, B., Yarmush, M. L., Langer, R. S. . Alternatives to animal testing. , 239-260 (2010).
- Steiner, S., et al. Reduction in (pro-)inflammatory responses of lung cells exposed in to diesel exhaust treated with a non-catalyzed diesel particle filter. Atmospheric Environment. 81, 117-124 (2013).
- Martinez, F. O., Gordon, S., Locati, M., Mantovani, A. Transcriptional Profiling of the Human Monocyte-to-Macrophage Differentiation and Polarization: New Molecules and Patterns of Gene Expression. The Journal of Immunology. 177 (10), 7303 (2006).
- Chortarea, S., et al. Profibrotic activity of multi-walled carbon nanotubes upon prolonged exposures in different human lung cell types. Applied In Vitro Toxicology. 5 (1), (2019).
- Holt, P. G. Pulmonary Dendritic Cells in Local Immunity to Inert and Pathogenic Antigens in the Respiratory Tract. Proceedings of the American Thoracic Society. 2 (2), 116-120 (2005).
- Pinkerton, K. E., Gehr, P., Castañeda, A., Crapo, J. D., Parent, R. A. . Comparative Biology of the Normal Lung (Second Edition). , 105-117 (2015).
- Crapo, J., Barry, B., Gehr, P., Bachofen, M., Weibel, E. R. Cell number and cell characteristics of the normal human lung. American Review of Respiratory Disease. 126 (2), 332-337 (1982).
- Maniecki, M. B., Møller, H. J., Moestrup, S. K., Møller, B. K. CD163 positive subsets of blood dendritic cells: The scavenging macrophage receptors CD163 and CD91 are coexpressed on human dendritic cells and monocytes. Immunobiology. 211 (6), 407-417 (2006).
- Chignard, M., Balloy, V. Neutrophil recruitment and increased permeability during acute lung injury induced by lipopolysaccharide. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 279 (6), 1083-1090 (2000).
- Coyne, C. B., et al. Regulation of Airway Tight Junctions by Proinflammatory Cytokines. Molecular Biology of the Cell. 13 (9), 3218-3234 (2002).
- Durantie, E., et al. Biodistribution of single and aggregated gold nanoparticles exposed to the human lung epithelial tissue barrier at the air-liquid interface. Particle and Fibre Toxicology. 14 (49), (2017).
