Describimos una técnica para perfilar microARN en embriones de ratón tempranos. Este protocolo supera el desafío de la entrada de células bajas y el enriquecimiento de ARN pequeño. Este ensayo se puede utilizar para analizar los cambios en la expresión de miRNA a lo largo del tiempo en diferentes linajes celulares del embrión de ratón temprano.
Los microARN (MIRNAs) son importantes para la compleja regulación de las decisiones sobre el destino celular y el momento del desarrollo. Los estudios in vivo de la contribución de los miRNAs durante el desarrollo temprano son técnicamente difíciles debido al número de células limitantes. Además, muchos enfoques requieren que se defina un miRNA de interés en ensayos como la hinchazón del norte, el microarray y el qPCR. Por lo tanto, la expresión de muchos miRNAs y sus isoformas no se han estudiado durante el desarrollo temprano. Aquí, demostramos un protocolo para la secuenciación de ARN pequeño de células ordenadas de embriones de ratón tempranos para permitir el perfil relativamente imparcial de miRNAs en las primeras poblaciones de células de cresta neural. Superamos los desafíos de la baja entrada de células y la selección de tamaño durante la preparación de la biblioteca utilizando amplificación y purificación a base de gel. Identificamos la edad embrionaria como una contabilidad variable de la variación entre réplicas y los embriones de ratón coincidentes con la etapa deben utilizarse para perfilar con precisión los miRNAs en réplicas biológicas. Nuestros resultados sugieren que este método se puede aplicar ampliamente para perfilar la expresión de miRNAs de otros linajes de celdas. En resumen, este protocolo se puede utilizar para estudiar cómo los miRNAs regulan los programas de desarrollo en diferentes linajes celulares del embrión de ratón temprano.
Una cuestión central de la biología del desarrollo es cómo una sola célula indiferenciada puede dar lugar a todo un organismo con numerosos tipos celulares complejos. Durante la embriogénesis, el potencial de desarrollo de las células se restringe progresivamente a medida que el organismo se desarrolla. Un ejemplo es el linaje de la cresta neural, que se diferencia progresivamente de una población celular multipotente en varios derivados terminales, como las neuronas periféricas, la glia, el hueso craneal y el cartílago. Las células de la cresta neural se especifican desde el ectodermo durante la gastrulación y luego se someten a una transición epitelial a la transición mesenquimal y migran a través del embrión a lugares discretos en todo el cuerpo donde se diferenciarán terminalmente1. Décadas de trabajo han descubierto una red reguladora de genes transcripcionales, pero mucho menos se sabe sobre los mecanismos de regulación post-transcripción que controlan el momento del desarrollo de la cresta neural.
El trabajo anterior sugiere que los microRNAs (miRNAs) reprimen la expresión génica para el tiempo adecuado del desarrollo y las decisiones de destino celular2,3,4,5,6. Los estudios de miRNAs en el desarrollo de la cresta neural se han centrado en gran medida en etapas posteriores del desarrollo craneofacial. Por ejemplo, miR-17-92 y miR-140 son críticos para la palatogénesis durante el desarrollo craneofacial en ratones y peces cebra, respectivamente7,8. La contribución de los miRNAs a las primeras decisiones de destino de la cresta neural del embrión no se ha investigado a fondo. Los estudios de los miRNas en las decisiones de destino temprano se han visto limitados por desafíos técnicos como el bajo número de células presentes en los primeros embriones.
Los MiRNas se han perfilado in vitro a partir de líneas celulares utilizando cuerpos embrionados en diferentes etapas de diferenciación para modelar el desarrollo temprano del ratón9. La investigación de los pequeños ARN in vivo durante el desarrollo temprano de los mamíferos ha sido relativamente limitada. Los métodos anteriores para perfilar los miRNAs han llevado al sesgo, ya que una secuencia conocida se utiliza para analizar la expresión de un miRNA específico en métodos como qPCR, microarrays y manchas septentrionales10. La secuenciación de próxima generación y la mejora de las herramientas moleculares ahora permiten un análisis relativamente imparcial de la expresión de miRNA para estudiar su contribución al desarrollo temprano de mamíferos y a las decisiones sobre el destino celular.
Aquí, informamos de una técnica para cosechar y secuenciar pequeños ARN expresados en células de cresta neural desde embriones de ratón temprano que abarcan la gastrulación (E7.5) hasta el comienzo de la organogénesis (E9.5). Esta técnica es sencilla y combina el trazado de linaje, la clasificación de celdas y la selección de tamaños basados en gel para preparar bibliotecas de secuenciación de ARN pequeñas a partir de un número mínimo de celdas para la secuenciación de próxima generación. Destacamos la importancia de la coincidencia estricta de la etapa de somita de embriones para resolver intervalos de tiempo de 6 horas para obtener una visión completa de los miRNAs durante los rápidos cambios de desarrollo temprano. Este método se puede aplicar ampliamente a los estudios genéticos y de desarrollo y evita la agrupación de embriones. Describimos una manera de superar los desafíos de los métodos actuales, como el enriquecimiento de miRNA mediante la purificación basada en gel, la cuantificación de bibliotecas y la minimización del sesgo introducido desde la PCR. Este método se ha utilizado para identificar patrones de expresión de miRNA a lo largo del tiempo para estudiar cómo los miRNAs controlan el tiempo de desarrollo en el linaje de cresta neural de los embriones de ratón.
Los procesos de desarrollo pueden proceder rápidamente, y las células están siendo sometidas a muchas especificaciones secuenciales, de tal manera que para capturar una visión completa de los miRNAs que contribuyen a las decisiones de destino temprano, se necesita una puesta en escena más específica que el incremento de medio día ampliamente utilizado. Un estudio reciente ha realizado la secuenciación de ARN de Theiler etapa 12 embriones que van desde tener 3 a 6 somites11. Encontramos que durante este período de tiempo, se especifican las células de la cresta neural (3 somites de edad), delaminar (4 somites de edad) y migrar (5-6 somitas de edad). También encontramos que además del controlador Cre utilizado para linaje rastrear las poblaciones celulares, la edad es la mayor fuente de variación entre muestras biológicas, y sólo los embriones emparejados con somita deben considerarse como réplicas. Esto también debe tenerse en cuenta al comparar embriones transgénicos con controles de tipo salvaje.
Los métodos anteriores para perfilar los miRNAs durante el desarrollo temprano han utilizado entre 10-100 ng de entrada de ARN para la preparación de la biblioteca de secuenciación de ARN pequeño y han agrupado varios embriones en una muestra13,,14. Demostramos aislamiento de ARN y preparación de bibliotecas a partir de un solo embrión E7.5 o de células de cresta neural ordenadas en E8.5 y E9.5 utilizando aproximadamente 100 ng de ARN total como entrada. Al disociar embriones para la clasificación, uno debe tener cuidado de observar la disociación bajo un microscopio y apagar la reacción para observar cuando se obtienen células individuales. Encontramos que la disociación de la región craneal de los embriones E8.5-E9.5 es casi instantánea con pipeteo manual suave como se describe en el protocolo. Para los tejidos más grandes y los embriones cada vez más antiguos, el tiempo de disociación puede ser más largo dependiendo de la porción del embrión que se está disociando. Para los embriones E7.5-E9.5, los grupos de células son fácilmente visibles bajo el microscopio y la disociación debe continuar hasta que no se vean más grumos. Las celdas individuales son visibles en la solución si ajusta el enfoque a través de la solución en su pozo en cualquier lugar de 5-10x. Los métodos anteriores ordenan las células directamente en el búfer de leis para la secuenciación de ARN para preparar el ARN a granel de un número bajo de células14. Aquí nos clasificamos directamente en la solución de lisis de extracción de ARN para que el ARN pueda aislarse antes del inicio de la preparación de la biblioteca. El uso de mini columnas con un volumen de elución de 11 l permitió una concentración de ARN lo suficientemente alta como para que una sola preparación de ARN pudiera dividirse entre la secuenciación de ARN pequeño y ARN a granel.
Una limitación de corriente de la mayoría de los métodos de secuenciación de ARN pequeños es la amplificación PCR del ADNc convertido. Nuestro método no supera esta limitación, pero pudimos minimizar el número de ciclos de PCR desde el máximo de 25 hasta 16 ciclos. Esta reducción en la amplificación disminuye el sesgo de amplificación artificial introducido por pcR. Otra fuente de sesgo es la ligadura de adaptadores, donde se sabe que las secuencias específicas ubicadas en los extremos de los adaptadores y los miRNAs pueden ligar junto con una mayor eficiencia que otras secuencias. Para evitar esto, los adaptadores utilizados en este protocolo tienen 4 bases aleatorias incorporadas al final de cada adaptador para evitar el sesgo en las reacciones de ligadura. Además, otro problema común es la cantidad de dimers de adaptador que se forman cuando la entrada de ARN es baja. El kit de preparación de la biblioteca incluye pasos para reducir la formación de dimer del adaptador, como la inactivación del adaptador y las limpiezas de cuentas para eliminar el exceso de adaptadores después de cada ligadura. También diluimos los adaptadores 3′ y 5′ 4N en 1/4 para reducir la cantidad de dimer adaptador que se puede formar. Encontramos que cuando no se diluye, la intensidad de la banda de 130 bp aumenta haciendo difícil distinguir de la banda de 150 bp que contiene las pequeñas bibliotecas de ARN deseadas en un gel.
Otro desafío actual de la preparación de bibliotecas de secuenciación es la cuantificación precisa del producto antes de la secuenciación. Hemos encontrado que diferentes métodos dan resultados variables en la misma biblioteca. Sugerimos que los investigadores utilizan múltiples métodos de cuantificación para obtener una estimación precisa de la concentración.
Este protocolo se puede aplicar ampliamente a estudios genéticos, de desarrollo u otras aplicaciones donde el ARN se está cosechando de un número bajo de células. Este enfoque simplifica los estudios temporales evitando la agrupación de embriones y se puede aplicar fácilmente tanto a células no ordenadas como ordenadas.
The authors have nothing to disclose.
Este proyecto fue apoyado por la Fundación Andrew McDonough B+ y el NIH (R01-HD099252, R01-HD098131. R.J.P. es becaria cprit en investigación del cáncer (RR150106) y V scholar in Cancer Research (V Foundation). Los autores también desean reconocer el núcleo de citometría y clasificación celular en BCM por proporcionar el equipo necesario para este proyecto.
#5 Forceps Fine Science Tools | Fisher Scientific | NC9277114 | |
0.4% Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | |
10 cm Petri dishes | Fisher Scientific | 07-202-011 | |
2-Propanol | Miilapore Sigma | I9516-500ML | |
5 % Criterion TBE Polyacrylamide Gel, 12+2 well, 45 µL | Bio-Rad | 3450047 | |
5200 Fragment Analyzer | Agilent | M5310AA | |
96 well PCR plates high profile semi skirted clear/clear | Bio-Rad | HSS9601 | |
BD FACSAria II | bdbiosciences | ||
Bovine Serum Albumin, fraction V | Fisher Scientific | BP1600100 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Gendepot | CA008-300 | |
Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
Ethanol Pure, 200 proof anhydrous | Sigma Aldrich | E7023-500ml | |
FC-404-2001 | Illumina | FC-404-2001 | |
HS NGS Fragment kit | Agilent | DNF-474-0500 | |
HS RNA Kit | Agilent | DNF-472-0500 | |
miRNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 217004 | |
NEXTflex Small RNA-Seq Kit v3 (48 barcodes) | Fisher Scientific | NC1289113 | |
NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2 (150 cycles) | Illumina | FC-404-2001 | |
NGS Fragment kit | Agilent | DNF-473-1000 | |
Papain | Worthington | LK003176 | resuspend in 5 mL of Ca/Mg free PBS for a final concentration of 27 U/mL |
SYBR Gold nucleic acid gel stain | ThermoFisher | S11494 | |
Trizol LS | ThermoFisher | 10296028 | |
UVP Benchtop UV Transilluminators: Single UV | Fisher Scientific | UVP95044701 | |
Vannas Scissors Straight Fine Science Tools #91500-09 | Fisher Scientific | NC9609583 |