Descrevemos uma técnica para traçar perfis de microRNAs em embriões de camundongos primitivos. Este protocolo supera o desafio da baixa entrada celular e do pequeno enriquecimento do RNA. Este ensaio pode ser usado para analisar alterações na expressão miRNA ao longo do tempo em diferentes linhagens celulares do embrião do camundongo primitivo.
MicroRNAs (miRNAs) são importantes para a complexa regulação das decisões de destino celular e do tempo de desenvolvimento. Estudos in vivo sobre a contribuição de miRNAs durante o desenvolvimento precoce são tecnicamente desafiadores devido ao número de células limitantes. Além disso, muitas abordagens exigem um miRNA de interesse a ser definido em ensaios como manchas do norte, microarray e qPCR. Portanto, a expressão de muitos miRNAs e seus isoformes não foram estudadas durante o desenvolvimento precoce. Aqui, demonstramos um protocolo para o sequenciamento de pequenas células classificadas de células classificadas de embriões de camundongos primitivos para permitir o perfil relativamente imparcial de miRNAs em populações primitivas de células de crista neural. Superamos os desafios da baixa entrada celular e seleção de tamanho durante a preparação da biblioteca usando amplificação e purificação baseada em gel. Identificamos a idade embrionária como uma variável que contabiliza a variação entre réplicas e embriões de camundongos em estágios devem ser usados para traçar com precisão miRNAs em réplicas biológicas. Nossos resultados sugerem que este método pode ser amplamente aplicado para traçar o perfil da expressão de miRNAs de outras linhagens de células. Em resumo, este protocolo pode ser usado para estudar como miRNAs regulam programas de desenvolvimento em diferentes linhagens celulares do embrião inicial do rato.
Uma questão central da biologia do desenvolvimento é como uma única célula indiferenciada pode dar origem a um organismo inteiro com numerosos tipos de células complexas. Durante a embriogênese, o potencial de desenvolvimento das células torna-se progressivamente restrito à medida que o organismo se desenvolve. Um exemplo é a linhagem da crista neural, que se diferencia progressivamente de uma população celular multipotente em vários derivados terminais, como neurônios periféricos, glia, osso craniano e cartilagem. As células de crista neural são especificadas a partir do ectoderme durante a gastruação e, em seguida, passam por uma transição epitelial para a transição mesenquimal e migram através do embrião para locais discretos em todo o corpo onde irão diferenciar terminalmente1. Décadas de trabalho descobriram uma rede de regulação genética transcricional, mas muito menos se sabe sobre os mecanismos de regulação pós-transcrição que controlam o tempo de desenvolvimento de crista neural.
Trabalhos anteriores sugerem que microRNAs (miRNAs) reprimem a expressão genética para o tempo de desenvolvimento adequado e decisões de destino celular2,,3,4,,5,6. Estudos de miRNAs no desenvolvimento de crista neural têm se concentrado em grande parte em estágios posteriores do desenvolvimento craniofacial. Por exemplo, miR-17~92 e miR-140 são fundamentais para a palatogênese durante o desenvolvimento craniofacial em camundongos e zebrafish,respectivamente 7,8. A contribuição dos miRNAs para as primeiras decisões de destino da crista neural do embrião não foi investigada minuciosamente. Estudos de miRNAs em decisões de destino precoce têm sido limitados por desafios técnicos, como o baixo número de células presentes em embriões precoces.
MiRNAs foram perfiladas in vitro a partir de linhas celulares usando corpos embrióides em diferentes estágios de diferenciação para modelar o desenvolvimento precoce do mouse9. A investigação de pequenas RNAs in vivo durante o desenvolvimento precoce de mamíferos tem sido relativamente limitada. Métodos anteriores para traçar miRNAs levaram ao viés, pois uma sequência conhecida é usada para analisar a expressão de um miRNA específico em métodos como qPCR, microarrays e manchas do norte10. O sequenciamento da próxima geração e a melhoria das ferramentas moleculares agora permitem uma análise relativamente imparcial da expressão miRNA para estudar sua contribuição para o desenvolvimento precoce de mamíferos e decisões de destino celular.
Aqui, relatamos uma técnica para colher e sequenciar pequenas RNAs expressas em células de crista neural desde embriões de camundongos primitivos que abrangem gastrulação (E7.5) até o início da organogênese (E9.5). Esta técnica é simples e combina rastreamento de linhagem, classificação celular e seleção de tamanho baseado em gel para preparar pequenas bibliotecas de sequenciamento de RNA a partir de um número mínimo de células para sequenciamento de próxima geração. Destacamos a importância da rigorosa correspondência de estágios de embriões para resolver intervalos de tempo de 6 horas para obter uma visão abrangente das miRNAs durante as rápidas mudanças do desenvolvimento precoce. Este método pode ser amplamente aplicado a estudos genéticos e de desenvolvimento e evita o agrupamento de embriões. Descrevemos uma maneira de superar desafios dos métodos atuais, como o enriquecimento de miRNA usando purificação baseada em gel, quantificação de biblioteca e minimização do viés introduzido do PCR. Este método tem sido usado para identificar padrões de expressão de miRNA ao longo do tempo para estudar como miRNAs controlam o tempo de desenvolvimento na linhagem de crista neural de embriões de camundongos.
Os processos de desenvolvimento podem prosseguir rapidamente, e as células estão passando por muitas especificações sequenciais, de modo que, para capturar uma visão abrangente das miRNAs que contribuem para decisões de destino precoce, é necessário um estágio mais específico do que o incremento de meio dia amplamente utilizado. Um estudo recente realizou sequenciamento de RNA a partir de embriões estágio 12 theiler que variam de 3 a 6 somites11. Descobrimos que durante esse período de tempo, as células da crista neural são especificadas (3 somites de idade), delaminadas (4 somitas de idade) e migram (5-6 somites de idade). Também descobrimos que, além do condutor de Cre usado para a linhagem de populações celulares, a idade é a maior fonte de variação entre amostras biológicas, e apenas embriões comidos por somite devem ser considerados como réplicas. Isso também deve ser levado em consideração ao comparar embriões transgênicos com controles de tipo selvagem.
Métodos anteriores para perfilar miRNAs durante o desenvolvimento precoce usaram entre 10-100 ng de entrada de RNA para a preparação da biblioteca de sequenciamento de RNA pequeno e juntaram vários embriões em uma amostra13,,14. Demonstramos o isolamento do RNA e a preparação da biblioteca de um único embrião E7.5 ou de células de crista neural classificadas em E8.5 e E9.5 usando aproximadamente 100 ng de RNA total como entrada. Ao dissociar embriões para classificação, deve-se tomar cuidado para observar a dissociação sob um microscópio e saciar a reação para observar quando células únicas são obtidas. Descobrimos que a dissociação da região craniana dos embriões E8.5-E9.5 é quase instantânea com tubos manuais suaves como descrito no protocolo. Para tecidos maiores e embriões cada vez mais antigos, o tempo de dissociação pode ser maior dependendo da parte do embrião ser dissociada. Para embriões E7.5-E9.5, aglomerados de células são facilmente visíveis sob o microscópio e a dissociação deve continuar até que não sejam visíveis mais aglomerados. Células únicas são visíveis em solução se você ajustar o foco através da solução em seu poço em qualquer lugar de 5-10x. Métodos anteriores classificam as células diretamente no tampão de lise para sequenciamento de RNA para preparar RNA em massa de um número baixo de células14. Aqui classificamos diretamente na solução de lise de extração de RNA para que o RNA possa ser isolado antes do início da preparação da biblioteca. O uso de mini colunas com volume de eluição de 11 μL permitiu uma concentração de RNA alta o suficiente, de forma que uma única preparação de RNA pudesse ser dividida entre o pequeno RNA e o sequenciamento de RNA a granel.
Uma limitação atual da maioria dos pequenos métodos de sequenciamento de RNA é a amplificação PCR do cDNA convertido. Nosso método não supera essa limitação, mas conseguimos minimizar o número de ciclos de PCR dos 25 máximos recomendados até 16 ciclos. Essa redução na amplificação diminui o viés de amplificação artificial introduzido pelo PCR. Outra fonte de viés é a ligadura dos adaptadores, onde se sabe que sequências específicas localizadas nas extremidades dos adaptadores e miRNAs podem se unir com maior eficiência do que outras sequências. Para evitar isso, os adaptadores utilizados neste protocolo possuem 4 bases aleatórias incorporadas no final de cada adaptador para evitar viés nas reações de ligadura. Além disso, outro problema comum é a quantidade de dimers adaptadores que se formam quando a entrada RNA é baixa. O kit de preparação da biblioteca inclui etapas para reduzir a formação de dimer adaptador, como a inativação do adaptador e limpeza de contas para remover o excesso de adaptadores após cada ligadura. Também diluímos os adaptadores de 3′ e 5′ 4N em 1/4 para reduzir a quantidade de dimer adaptador que pode se formar. Descobrimos que, quando não diluída, a intensidade da banda de 130 bp aumenta, dificultando a distinção da banda de 150 bp contendo as pequenas bibliotecas de RNA desejadas em um gel.
Outro desafio atual de preparar bibliotecas de sequenciamento é a quantificação precisa do produto antes do sequenciamento. Descobrimos que diferentes métodos dão resultados variados na mesma biblioteca. Sugerimos que os pesquisadores usem múltiplos métodos de quantificação para obter uma estimativa precisa da concentração.
Este protocolo pode ser amplamente aplicado a estudos genéticos, de desenvolvimento ou outras aplicações onde o RNA está sendo coletado de um baixo número de células. Essa abordagem simplifica os estudos temporais, evitando o agrupamento de embriões e pode ser facilmente aplicada em células não classificadas e classificadas.
The authors have nothing to disclose.
Este projeto foi apoiado pela Andrew McDonough B+ Foundation e pelo NIH (R01-HD099252, R01-HD098131. R.J.P. é um Cprit Scholar in Cancer Research (RR150106) e V Scholar in Cancer Research (V Foundation). Os autores também gostariam de reconhecer o Núcleo de Citometria e Triagem celular da BCM para fornecer equipamentos necessários para este projeto.
#5 Forceps Fine Science Tools | Fisher Scientific | NC9277114 | |
0.4% Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | |
10 cm Petri dishes | Fisher Scientific | 07-202-011 | |
2-Propanol | Miilapore Sigma | I9516-500ML | |
5 % Criterion TBE Polyacrylamide Gel, 12+2 well, 45 µL | Bio-Rad | 3450047 | |
5200 Fragment Analyzer | Agilent | M5310AA | |
96 well PCR plates high profile semi skirted clear/clear | Bio-Rad | HSS9601 | |
BD FACSAria II | bdbiosciences | ||
Bovine Serum Albumin, fraction V | Fisher Scientific | BP1600100 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Gendepot | CA008-300 | |
Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
Ethanol Pure, 200 proof anhydrous | Sigma Aldrich | E7023-500ml | |
FC-404-2001 | Illumina | FC-404-2001 | |
HS NGS Fragment kit | Agilent | DNF-474-0500 | |
HS RNA Kit | Agilent | DNF-472-0500 | |
miRNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 217004 | |
NEXTflex Small RNA-Seq Kit v3 (48 barcodes) | Fisher Scientific | NC1289113 | |
NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2 (150 cycles) | Illumina | FC-404-2001 | |
NGS Fragment kit | Agilent | DNF-473-1000 | |
Papain | Worthington | LK003176 | resuspend in 5 mL of Ca/Mg free PBS for a final concentration of 27 U/mL |
SYBR Gold nucleic acid gel stain | ThermoFisher | S11494 | |
Trizol LS | ThermoFisher | 10296028 | |
UVP Benchtop UV Transilluminators: Single UV | Fisher Scientific | UVP95044701 | |
Vannas Scissors Straight Fine Science Tools #91500-09 | Fisher Scientific | NC9609583 |