הכנת ספריות RNA קטנות לצורך רצף של עוברי עכבר מוקדם

כל הליכי המחקר והטיפול בבעלי חיים אושרו על ידי המכללה לרפואה ביילור מוסדי טיפול ובעלי חיים הוועדה לשימוש ושוכנו האגודה להערכה והסמכה של מעבדה בעלי חיים שאושרו טיפול בבעלי חיים מתקן במכללת ביילור לרפואה. כל הזנים נשמרו על רקע C57BL6. 1. פירוק עובר (E7.5-E9.5) הסר את קרני הרחם מעכבר נקבה בהריון, עיקור הבטן עם 70% אתנול שבו יש לחתך. לנקות את הרחם על ידי שטיפה עם תמיסת מלח פוספט אגירה (PBS). מניחים את הרחם בצלחת פלסטיק סטרילית ב-10 ס”מ. באמצעות מספריים microdissection, להפריד כל החלטה המכילה אזור אחד מהשני. מקלפים את שריר הרחם וחושפים את כל ההחלטות. אחד אחרי השני, הסירו את ההכרעה מכל עובר. מוציאים את שאק החלמון מכל עובר ושמור על גנוטיפינג. להעביר את כל העוברים לתוך צלחת חדשה של PBS טרי להדמיה. תדמיתי את כל ההמלטה. תדמינו כל עובר בנפרד ותספור את מספר הנוכלים של כל עובר. שמור על הגדלה וחשיפה (לפלואורסצנס) זהה בין ניסויים.הערה: אנו מוצאים כי חשיפה של 50-200 ms מתאימה לפלואורססנטיות וש-20 ms מתאימה להגדרת שדה בהיר. 2. פירוק עובר ומיון תאים כדי שכל עובר ימיין, עשה את הפעולות הבאות. ערפו את ראשם ממש מעל המקודד העילית עבור עוברים מעל E8.0 (אם רק תאים המסווים בתווית של אזור הגולגולת רצויים). עבור עוברי E7.5, הסר מבנים אקסטרמבריים (אם רק העובר הנכון רצוי). הזז את הראש בעוצמה מינימלית של PBS מעל לבאר נקייה של צלחת 48 באר. להוסיף 250 μL של פפאין (27 U /mL). פיפטה למעלה ומטה בעדינות באמצעות p200. בדוק מתחת למיקרוסקופ וחפש גושים ותאים בודדים. חזור על pipetting עדין למעלה ומטה עד מתלה תא יחיד מושגת (בדרך כלל שלושה סיבובים של pipetting למעלה ומטה אשר צריך להשוות בין 30 s ל 1 דקות עבור E7.5-E9.5). הרווה עם 250 μL של סרום בקר עוברי (FBS). חזור על שלבים 2.1.1-2.1.5 עבור כל עובר למיון. מסנן 500 μL של מתלה תא באמצעות צינור מכסה מסנן רשת ניילון 35 μm כדי להסיר גושים. קח את הסינון ולעבור חדש 1.5 מ”ל שפופרת ספין ב 200 x g במשך 5 דקות. הסר supernatant בזהירות ולהעביר צינור חדש (לשמור עד תאים חיים ידועים להיות גלולה). גלולת תא resspend ב 300 μL של PBS המכיל 0.5-1% אלבומין סרום בקר ולשמור על קרח עד מיון (למזער את הזמן מעכשיו ועד סוף המיון). אם תרצה, לקחת 10 μL של מתלה תא ולשלב עם 10 μL של כחול Trypan (0.4%) ולספור באמצעות hemocytometer לזהות כימות תאים משוערים וכדאיות כמו כחול Trypan רק מכתים תאים מתים. רגע לפני המיון, לסנן כל דגימה שוב דרך צינור מכסה מסנן ולהוסיף כתם DAPI עבור תאים חיים. מיין כל דגימה לתוך 500 μL של פתרון ליסיס חילוץ RNA (ראה טבלת חומרים) על סדרן תאים עם זרבובית 70 μm. מערבבים ומאחסנים ב-80°C עד שנקצרים את כל הדגימות. המשך לנקודה זו רק כאשר כל הדגימות הדרושות לניסוי נקצרות כדי להפחית את השונות הטכנית בין סבבי הכנת הספרייה. 3. חילוץ RNA הערה: הפרוטוקול מותאם מערכת הבידוד של RNA; ראה טבלת חומרים. להוסיף 500 μL של פתרון ליסיס חילוץ RNA (ראה טבלת חומרים)לכל מדגם כדי להפוך את אמצעי האחסון הכולל 1000 μL. להפשיר כל דגימה בטמפרטורת החדר. מערבולת כל דגימה במשך 1.5 דקות, לוודא כי הכובע הוא מאובטח על כל צינור לפני תחילת homogenization. דגירה הומוגנית בטמפרטורת החדר (15-25 °C) במשך 5 דקות. להוסיף 140 μL של כלורופורם, צינור כובע בבטחה לנער במרץ עבור 15 s. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 3 דקות. צנטריפוגה למשך 15 דקות ב-12,000 x גרם ב-4°C. מעבירים את שלב המים העליון לצינור אוסף חדש על קרח. אין להעביר כל שלב בין-פאזה או כל שלב אורגני. כאשר מתקרבים לשלב האורגני הוורוד, הקצה את הצינור לצד ולהסיר aliquots קטן עד לא ניתן לאסוף שלב מים ברור. מדוד את אמצעי האחסון של RNA המכיל שלב מים שנאסף מכל דוגמה עבור החישוב הנכון בשלב הבא. להוסיף 1.5 כרכים (בדרך כלל 525 μL אבל יכול להיות קצת פחות או יותר) של 100% אתנול ולערבב ביסודיות על ידי pipetting. פיפט עד 700 מדגם μL, כולל כל משקע, לתוך עמודה בצינור אוסף 2 מ”ל. סגור את המכסה ואת הצנטריפוגה ב-≥,000 x g עבור 15 שניות בטמפרטורת החדר. תמחק את הזרימה. חזור על שלב 3.8 באמצעות שאר הדגימה. שטוף את העמודה בהתאם להוראות היצרן. יבש את העמודה על ידי סיבוב במהירות מלאה במשך 1 דקות. העבר את העמודה לצינור קולקציה חדש של 1.5 מ”ל. פיפט 11 μL של מים חינם גרעין על מרכז הממברנה. מאפשרים לשבת בטמפרטורת החדר במשך דקה אחת. סובב מהירות מרבית למשך דקה אחת כדי להמריא מהעמודה. למדוד ריכוז RNA באמצעות ספקטרופוטומטר ומכשיר אלקטרופורזה נומי מקביל(טבלת חומרים). 4. הכנת הספרייה הערה: הפרוטוקול מותאם ממדריך קטן של ערכת הכנה לספריית RNA; ראה טבלת חומרים. השלם את ההתרסה ואת קשירה מתאם 3′ כאמור במדריך ערכת הכנה ספריית RNA קטן באמצעות דילול 1/4 של מתאם 3′ . המשך להסרת מתאם עודף של 3′. השלם את ריקון המתאם כאמור במדריך הכנת ספריית RNA הקטן. הקפד להשתמש טרי מוכן 80% אתנול לניקוי חרוז, כי כל האתנול העודף מוסר לחלוטין רק לפני resuspension במים ללא גרעין מבלי לייבש יתר על פני החרוזים (פיצוח של גלולת החרוז נצפתה על ייבוש יתר). המשך ישירות להשבתת מתאם עודף. השלם את אי-הפעלה עודפת המתאם כאמור במדריך הכנת ספריית RNA הקטן הרכבת כל reagents על קרח. המשך ל-5′ קשירה מתאם 4N. השלם 5′ קשירה מתאם כאמור במדריך הכנת ספריית RNA קטן להיות בטוח להשתמש 1/4 דילול של מתאם 5 ‘ והרכבת כל reagents על קרח. המשך לתמלול הפוך. סינתזת גדיל ים-ראשון שעתוק הפוך מלא כאמור במדריך ערכת הכנה ספריית RNA קטן וטיפול להרכיב את כל reagents על קרח ולא לשמור את האנזים מחוץ למקפיא לפרקי זמן ממושכים.הערה: בשלב זה, ניתן לעצור את הפרוטוקול, עם דגימות המאוחסנות למשך הלילה ב- 4 °C. לחלופין המשך להגדלת PCR. השלם את ההגדלה של PCR על-ידי הרכבת הריגנטים כאמור במדריך קטן של ערכת הכנת ספריית RNA ומזעור מספר מחזורי PCR. יש לקבוע באופן ניסיוני את מספר מחזורי PCR עבור כל יישום ויש להשתמש במספר המחזורים המינימלי. כאן השתמשנו ב-16 מחזורים כדי להגביר בהצלחה את ספריות ה-RNA הקטנות שלנו. המשך ישירות לבחירת גודל. 5. בחירת גודל לכל דוגמה, להוסיף 5 μL של 6x ג’ל טעינת צבע פיפטה לערבב. טען 10 μL של סולם לבאר הראשונה של הג’ל, עוזב את הבאר מיד ימינה ריקה. טען את כל המוצר מ שלב 5.1 על 6% Tris / borate / אתילנדיאמיןtraacetic חומצה – ג’ל polyacrylamide (TBE-PAGE) ולהשאיר נתיב אחד בין כל מדגם.הערה: שמור את המיכל שהז’ל נכנס לצעדים הבאים. הפעל את הג’ל ב- 150 V למשך כ- 30-40 דקות במאגר ריצה של 0.5x TBE (עד שרצועה נמוכה יותר של צבע קרוב לתחתית הג’ל, 0.5-1 ס”מ). הפוך 1 L של תמיסת כתמים בזמן הג’ל פועל: זהב SYBR מדולל 1:10,000 ב 0.5x TBE. כאשר הג’ל סיים לרוץ (כלומר, רצועה בצבע נמוך יותר הוא ליד החלק התחתון של הג’ל), בזהירות להסיר את הג’ל מהצלחות זכוכית, ציון הכיוון של הג’ל. מניחים ג’ל במגש האריזה המקורית שלו. הסר את ה- TBE 0.5x והחלף בפתרון הכתמים בשלב 5.5. ג’ל כתם למשך 15 דקות. ייתכן שיהיה צורך להגדיל את זמן ההכתמה. מניחים את הג’ל על טרנסילום UV, דואגים לא לקרוע את הג’ל ולשמור על הכיוון ציין לעיל (כתם מחדש לזמן נוסף אם להקות של סולם לא ניתן לראות בבירור). תמונה הג’ל פעם הכתמה הושלמה על טרנסילום UV עם מצלמה. אם נדרשת תמונה טובה יותר, השתמש תחילה בהדמיה מלבד טרנסילומבינטור UV כדי ללכוד תמונה של הג’ל לפני חיתוך הרצועות על טרנסילומינגור UV כמו הדמיה ישירות על טרנסילום UV גורם צביעה משתנה של הרקע כפי שמצג איור 3A-B. אין להזיז את הג’ל פעמים רבות מדי כפי שהוא עדין עלול לקרוע. זהה והסר את הרצועה ~ 150 bp באמצעות סכין גילוח נקי ומקום לתוך צינור נקי 1.5 מ”ל. אל תחתוך את פס ~ 130 bp (מוצר dimer מתאם). תדמיינו שוב את הג’ל לאחר הסרת הפרוסות המכילות את מוצר הספרייה למטרות תיעוד. סובבו את צינורות המיקרו-צנטריפוגה המכילים את פרוסת הג’ל במהירות מרבית של 30 שניות כדי לאסוף את הפרוסות בתחתית כל שפופרת. השתמש בעצה p200 עבור כל דגימה כדי לרסק את פרוסת הג’ל לתוך הסיביות הקטנות ביותר האפשריות. תפלוט כל קצה לתוך כל צינור. לכל שפופרת, להוסיף 300 μL של חוצץ חוצץ, טיפול לשטוף חתיכות ג’ל מהצד של הצינור ולצרף מחדש את קצה p200 ולשטוף את הקצה עבור כל דגימה. מניחים את דגימות ההתחכך באינקובטור רועד ל-25 מעלות צלזיוס. דגירה לילה עם 1000 סל”ד רועד. הסר צינורות מהאינקובטור וסובב במהירות מרבית למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. העבר את supernatant המכיל את מוצר הספרייה לצלחת 2 מ”ל RNase חינם 96 באר. תדאג לא להעביר ג’ל. להוסיף 50 μL חרוזי ניקוי לכל מדגם ולערבב על ידי pipetting. מיד, להוסיף 350 μL של isopropanol ולערבב על ידי pipetting. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות עם נדנדה. צלחת ספין דופק לחרוזי כדורי ולאחר מכן מגנטיזציה במשך 2 דקות. הסירו בזהירות וזרקו את הסופרנטנט. להוסיף 950 μL של 80% אתנול. דגירה ל-30 שניות. הסר את כל הסופרנטנטים. חזור על הפעולה עם שתי שטיפה אתנול. מייבשים את הדגימה למשך 3 דקות. בשלב זה יש לדאוג להסיר כל שאריות אתנול האוסף בתחתית כל באר (לא יותר מפעם אחת) ולא לייבש יתר על כן את החרוזים (ייבוש יתר יגרום לפיצוח של גלולת החרוז). הסר את כל שאריות הנוזל בתחתית הבאר. הסר את הלוח מהעמדה המגנטית. תוסתה מחדש את הכדור ב-13 μL של מאגר תגמול מחדש. מערבבים לפיפט עד להומוגני. דגירה במשך 2 דקות ולאחר מכן מגנטיזציה במשך 3 דקות. להעביר 12 μL של supernatant לצינור נקי או גם של צלחת נקייה לאחסון הבא. אחסן את כל הדגימות ב- 4°C בלילה או -20 °C לטווח ארוך. בדוק את הגודל והריכוז של שברים הנוכחים בכל ספרייה באמצעות אלקטרופורזה נימה רגישות גבוהה DNA אסה. אשר את הריכוז ביותר משיטה אחת.הערה: השתמשנו מדי פעם בערכת הרגישות הסטנדרטית כדי להימנע מעומס יתר על האלקטרופורזה של נימה.