Vorbereitung kleiner RNA-Bibliotheken für die Sequenzierung von frühen Mausembryonen
Summary
Wir beschreiben eine Technik zur Profilierung von microRNAs in frühen Mausembryonen. Dieses Protokoll überwindet die Herausforderung des niedrigen Zelleingangs und der kleinen RNA-Anreicherung. Dieser Assay kann verwendet werden, um Veränderungen in der miRNA-Expression im Laufe der Zeit in verschiedenen Zelllinien des frühen Mausembryons zu analysieren.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) sind wichtig für die komplexe Regulierung von Entscheidungen über das Zellschicksal und das Entwicklungstiming. In-vivo-Studien über den Beitrag von miRNAs während der frühen Entwicklung sind aufgrund der begrenzten Zellzahl technisch anspruchsvoll. Darüber hinaus erfordern viele Ansätze eine miRNA von Interesse in Assays wie Northern Blotting, Microarray und qPCR. Daher wurden die Expression vieler miRNAs und ihre Isoformen in der frühen Entwicklung nicht untersucht. Hier zeigen wir ein Protokoll zur kleinen RNA-Sequenzierung von sortierten Zellen aus frühen Mausembryonen, um eine relativ unvoreingenommene Profilierung von miRNAs in frühen Populationen von neuralen Kammzellen zu ermöglichen. Wir überwinden die Herausforderungen der geringen Zelleingabe und Größenauswahl während der Bibliotheksvorbereitung mit Verstärkung und gelbasierter Reinigung. Wir identifizieren das embryonale Alter als eine variable Bilanz ierung von Variationen zwischen Replikationen und stufenseitig abgestimmten Mausembryonen, die verwendet werden müssen, um miRNAs in biologischen Replikationen genau zu profilieren. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass diese Methode allgemein angewendet werden kann, um die Expression von miRNAs aus anderen Zelllinien zu profilieren. Zusammenfassend lässt sich untersuchen, wie miRNAs Entwicklungsprogramme in verschiedenen Zelllinien des frühen Mausembryons regulieren.
Introduction
Eine zentrale Frage der Entwicklungsbiologie ist, wie eine einzelne undifferenzierte Zelle einen ganzen Organismus mit zahlreichen komplexen Zelltypen hervorrufen kann. Während der Embryogenese wird das Entwicklungspotenzial der Zellen mit der Entwicklung des Organismus zunehmend eingeschränkt. Ein Beispiel ist die neuronale Kammlinie, die sich schrittweise von einer multipotenten Zellpopulation in verschiedene terminale Derivate wie periphere Neuronen, Glia, Schädelknochen und Knorpel unterscheidet. Neurale Kammzellen werden während der Gastrulation aus dem Ektoderm spezifiziert und durchlaufen dann einen epitheliaden mesenchymalen Übergang und wandern durch den Embryo zu diskreten Stellen im ganzen Körper, wo sie endlos1differenzieren. Jahrzehntelange Arbeit hat ein transkriptionsspezifisches Gen-Regulierungsnetzwerk aufgedeckt, aber weit weniger ist über die Mechanismen der post-transkriptionellen Regulierung bekannt, die den Zeitpunkt der Entwicklung des neuronalen Kamms steuern.
Frühere Arbeiten legen nahe, dass microRNAs (miRNAs) die Genexpression für das richtige Entwicklungstiming und die Entscheidungen über das Zellschicksal2,3,4,,5,6. Studien über miRNAs in der Entwicklung des neuronalen Kamms haben sich weitgehend auf spätere Stadien der craniofacial Entwicklung konzentriert. Zum Beispiel sind miR-17-92 und miR-140 entscheidend für die Palatogenese während der craniofacial Entwicklung bei Maus und Zebrafisch, bzw.7,8. Der Beitrag von miRNAs zu den frühesten neuralen Kammschicksalentscheidungen des Embryos wurde nicht gründlich untersucht. Studien über miRNAs bei Entscheidungen über das frühe Schicksal wurden durch technische Herausforderungen wie die geringe Zellzahl in frühen Embryonen begrenzt.
MiRNAs wurden in vitro aus Zelllinien mit embryoiden Körpern in verschiedenen Stadien der Differenzierung profiliert, um die frühe Mausentwicklung zu modellieren9. Die Untersuchung kleiner RNAs in vivo während der frühen Entwicklung von Säugetieren war relativ begrenzt. Frühere Methoden zum Profilieren von miRNAs haben zu Verzerrungen geführt, da eine bekannte Sequenz verwendet wird, um die Expression einer bestimmten miRNA in Methoden wie qPCR, Mikroarrays und nördlichen Blots10zu analysieren. Die Sequenzierung der nächsten Generation und die verbesserung der molekularen Werkzeuge ermöglichen nun eine relativ unvoreingenommene Analyse der miRNA-Expression, um ihren Beitrag zur frühen Entwicklung von Säugetieren und Entscheidungen über das Zellschicksal zu untersuchen.
Hier berichten wir über eine Technik zur Ernte und Sequenzierung kleiner RNAs, die in neuralen Kammzellen von frühen Mausembryonen über die Gastrulation (E7.5) bis zum Beginn der Organogenese (E9.5) exprimiert werden. Diese Technik ist einfach und kombiniert Linienverfolgung, Zellsortierung und gelbasierte Größenauswahl, um kleine RNA-Sequenzierungsbibliotheken aus einer minimalen Anzahl von Zellen für die Sequenzierung der nächsten Generation vorzubereiten. Wir betonen, wie wichtig es ist, dass Embryonen in der strikten Anfangsphase 6-Stunden-Zeitintervalle auflösen, um einen umfassenden Überblick über miRNAs während der raschen Veränderungen der frühen Entwicklung zu erhalten. Diese Methode kann in genetischen und Entwicklungsstudien weit verbreitet werden und vermeidet die Bündelung von Embryonen. Wir beschreiben einen Weg, um Herausforderungen aktueller Methoden wie miRNA-Anreicherung mit gelbasierter Reinigung, Bibliotheksquantifizierung und Minimierung von Voreingenommenheit, die von PCR eingeführt wurde, zu überwinden. Diese Methode wurde verwendet, um miRNA-Expressionsmuster im Laufe der Zeit zu identifizieren, um zu untersuchen, wie miRNAs das Entwicklungstiming in der neuronalen Kammlinie von Mausembryonen steuern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Entwicklungsprozesse können schnell voranschreiten, und Zellen durchlaufen viele sequenzielle Spezifikationen, so dass eine spezifischere Inszenierung als das weit verbreitete Halbtags-Inkrement erforderlich ist, um einen umfassenden Überblick über die miRNAs zu gewinnen, die zu frühen Schicksalsentscheidungen beitragen. Eine aktuelle Studie hat eine RNA-Sequenzierung von Theiler-Stadium-12-Embryonen durchgeführt, die von 3 bis 6 Sos11reichen. Wir stellen fest, dass in diesem Zeitraum die neuralen Kammzellen spezifiziert werden (3 Soden des Alters), delaminat (4 Soes des Alters) und migrieren (5-6 Soden des Alters). Wir stellen auch fest, dass neben dem Cre-Treiber, der zur Abstammung von Spurenzellpopulationen verwendet wird, das Alter die größte Quelle für Variationen zwischen biologischen Proben ist und nur so abgestimmte Embryonen als Wiederholungen betrachtet werden sollten. Dies sollte auch beim Vergleich transgener Embryonen mit Wildtypkontrollen berücksichtigt werden.
Frühere Methoden zur Profilierung von miRNAs während der frühen Entwicklung haben zwischen 10-100 ng RNA-Eingang für die kleine RNA-Sequenzierungsbibliotheksvorbereitung verwendet und mehrere Embryonen in einer Probe13,14gepoolt. Wir demonstrieren DIE RNA-Isolation und Bibliotheksvorbereitung aus einem einzelnen E7.5-Embryo oder aus sortierten neuralen Kammzellen bei E8.5 und E9.5 unter Verwendung von ca. 100 ng gesamter RNA als Input. Bei der Trennung von Embryonen zum Sortieren sollte man darauf achten, die Dissoziation unter dem Mikroskop zu beobachten und die Reaktion zu löschen, um zu beobachten, wann einzelne Zellen erhalten werden. Wir stellen fest, dass die Dissoziation der Schädelregion von E8.5-E9.5 Embryonen mit sanfter manueller Pipettierung, wie im Protokoll beschrieben, fast augenblicklich erfolgt. Bei größeren Geweben und immer älterwerdenden Embryonen kann die Dissoziationszeit je nach dem Teil des embryonalen Embryos länger sein. Bei E7.5-E9.5-Embryonen sind Zellklumpen unter dem Mikroskop gut sichtbar und die Dissoziation sollte so lange fortgesetzt werden, bis keine Klumpen mehr sichtbar sind. Einzelne Zellen sind in der Lösung sichtbar, wenn Sie den Fokus durch die Lösung in Ihrem Brunnen überall zwischen 5-10x einstellen. Frühere Methoden sortieren Zellen direkt in Lysepuffer für die RNA-Sequenzierung, um Massen-RNA aus einer geringen Anzahl von Zellenvorzubereiten 14. Hier sortieren wir direkt in rna-Extraktionslyselösung, so dass RNA vor Beginn der Bibliotheksvorbereitung isoliert werden kann. Die Verwendung von Mini-Säulen mit 11 L Elutionsvolumen ermöglichte eine ausreichend hohe RNA-Konzentration, so dass eine einzelne RNA-Vorbereitung zwischen kleiner RNA und Bulk-RNA-Sequenzierung aufgeteilt werden konnte.
Eine aktuelle Einschränkung der meisten kleinen RNA-Sequenzierungsmethoden ist die PCR-Verstärkung der umgewandelten cDNA. Unsere Methode überwindet diese Einschränkung nicht, aber wir konnten die Anzahl der PCR-Zyklen von den empfohlenen 25-Maximum-Zyklen auf 16 Zyklen minimieren. Diese Verringerung der Amplifikation verringert die künstliche Amplifikationsverzerrung, die durch PCR eingeführt wird. Eine weitere Quelle der Verzerrung ist die Ligation von Adaptern, wo bekannt ist, dass bestimmte Sequenzen an den Enden von Adaptern und miRNAs zusammen mit einer größeren Effizienz als andere Sequenzen ligaten können. Um dies zu vermeiden, verfügen die in diesem Protokoll verwendeten Adapter über 4 zufällige Basen, die am Ende jedes Adapters integriert sind, um Verzerrungen bei Ligationsreaktionen zu verhindern. Darüber hinaus ist ein weiteres häufiges Problem die Menge an Adapterdimermern, die sich bilden, wenn der RNA-Eingang niedrig ist. Das Bibliotheksvorbereitungskit enthält Schritte zur Reduzierung der Adapterdimerbildung, z. B. Adapterinaktivierung und Perlenbereinigung, um überschüssige Adapter nach jeder Ligation zu entfernen. Wir haben auch die 3′ und 5′ 4N Adapter um 1/4 verdünnt, um die Menge an Adapter-Dimer zu reduzieren, die sich bilden kann. Wir fanden heraus, dass die Bandbreite von 130 bp erhöht wird, wenn sie nicht verdünnt wird, was es schwierig macht, von dem 150 bp-Band zu unterscheiden, das die gewünschten kleinen RNA-Bibliotheken auf einem Gel enthält.
Eine weitere aktuelle Herausforderung bei der Vorbereitung von Sequenzierungsbibliotheken ist die genaue Quantifizierung des Produkts vor der Sequenzierung. Wir haben festgestellt, dass verschiedene Methoden unterschiedliche Ergebnisse auf der gleichen Bibliothek liefern. Wir schlagen vor, dass die Forscher mehrere Methoden der Quantifizierung verwenden, um eine genaue Schätzung der Konzentration zu erhalten.
Dieses Protokoll kann weit verbreitet auf genetische, Entwicklungsstudien oder andere Anwendungen angewendet werden, bei denen RNA aus einer geringen Anzahl von Zellen geerntet wird. Dieser Ansatz vereinfacht zeitliche Studien, indem das Zusammenwerden von Embryonen vermieden wird, und kann leicht sowohl auf nicht sortierte als auch auf sortierte Zellen angewendet werden.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dieses Projekt wurde von der Andrew McDonough B+ Foundation und dem NIH (R01-HD099252, R01-HD098131) unterstützt. R.J.P. ist CPRIT-Stipendiat in Der Krebsforschung (RR150106) und V-Stipendiat in der Krebsforschung (V Foundation). Die Autoren möchten auch den Cytometrie- und Zellsortierungskern am BCM für die Bereitstellung der für dieses Projekt erforderlichen Ausrüstung würdigen.
Materials
| #5 Forceps Fine Science Tools | Fisher Scientific | NC9277114 | |
| 0.4% Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | |
| 10 cm Petri dishes | Fisher Scientific | 07-202-011 | |
| 2-Propanol | Miilapore Sigma | I9516-500ML | |
| 5 % Criterion TBE Polyacrylamide Gel, 12+2 well, 45 µL | Bio-Rad | 3450047 | |
| 5200 Fragment Analyzer | Agilent | M5310AA | |
| 96 well PCR plates high profile semi skirted clear/clear | Bio-Rad | HSS9601 | |
| BD FACSAria II | bdbiosciences | ||
| Bovine Serum Albumin, fraction V | Fisher Scientific | BP1600100 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Gendepot | CA008-300 | |
| Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Ethanol Pure, 200 proof anhydrous | Sigma Aldrich | E7023-500ml | |
| FC-404-2001 | Illumina | FC-404-2001 | |
| HS NGS Fragment kit | Agilent | DNF-474-0500 | |
| HS RNA Kit | Agilent | DNF-472-0500 | |
| miRNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 217004 | |
| NEXTflex Small RNA-Seq Kit v3 (48 barcodes) | Fisher Scientific | NC1289113 | |
| NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2 (150 cycles) | Illumina | FC-404-2001 | |
| NGS Fragment kit | Agilent | DNF-473-1000 | |
| Papain | Worthington | LK003176 | resuspend in 5 mL of Ca/Mg free PBS for a final concentration of 27 U/mL |
| SYBR Gold nucleic acid gel stain | ThermoFisher | S11494 | |
| Trizol LS | ThermoFisher | 10296028 | |
| UVP Benchtop UV Transilluminators: Single UV | Fisher Scientific | UVP95044701 | |
| Vannas Scissors Straight Fine Science Tools #91500-09 | Fisher Scientific | NC9609583 |
References
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