إعداد مكتبات RNA الصغيرة لتسلسل من أجنة الماوس المبكر
Summary
نحن نصف تقنية لتوصيف microRNAs في الأجنة الماوس في وقت مبكر. هذا البروتوكول يتغلب على التحدي المتمثل في انخفاض مدخلات الخلايا وإثراء الحمض النووي الريبي الصغيرة. يمكن استخدام هذا الفحص لتحليل التغيرات في التعبير ميرنا مع مرور الوقت في أنساب الخلايا المختلفة للجنين الماوس المبكر.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) مهمة لتنظيم معقدة من القرارات مصير الخلية وتوقيت النمو. في دراسات الجسم الحي من مساهمة miRNAs خلال التنمية المبكرة هي صعبة من الناحية الفنية بسبب عدد الخلايا الحد. وعلاوة على ذلك، تتطلب العديد من المقاربات أن يتم تعريف الرنا ذات الاهتمام في عمليات الفحص مثل النشاف الشمالي، والمجهر، وQPCR. ولذلك، فإن التعبير عن العديد من miRNAs وisoforms لها لم تدرس خلال التنمية المبكرة. هنا، نحن نُظهر بروتوكولاً لتسلسل الحمض النووي الريبي الصغير للخلايا المخزّنة من أجنة الماوس المبكرة لتمكين التنميط غير المتحيز نسبياً من الـ miRNAs في مجموعات السكان المبكرة من خلايا القمم العصبية. نحن التغلب على التحديات من انخفاض مدخلات الخلية واختيار حجم خلال إعداد المكتبة باستخدام التضخيم وتنقية على أساس هلام. نحن نحدد العمر الجنيني كمتغير المحاسبة للاختلاف بين النسخ المتماثلة والمرحلة مطابقة الأجنة الماوس يجب أن تستخدم لتحديد بدقة miRNAs في النسخ المتماثلات البيولوجية. تشير نتائجنا إلى أن هذه الطريقة يمكن تطبيقها على نطاق واسع على التعريف بالتعبير عن miRNAs من أنساب الخلايا الأخرى. باختصار، يمكن استخدام هذا البروتوكول لدراسة كيفية تنظيم miRNAs البرامج التنموية في أنساب الخلايا المختلفة من جنين الماوس المبكر.
Introduction
وثمة مسألة مركزية في علم الأحياء التنموية هو كيف يمكن لخلية واحدة غير متمايزة أن تؤدي إلى كائن حي كامل مع العديد من أنواع الخلايا المعقدة. خلال تكوين الجنين ، تصبح الإمكانات التنموية للخلايا مقيدة تدريجيًا مع تطور الكائن الحي. أحد الأمثلة هو النسب العصبي، الذي يميز تدريجيا من عدد الخلايا متعددة القدرات في المشتقات الطرفية المختلفة، مثل الخلايا العصبية الطرفية، glia، العظام القحفية، والغضاريف. يتم تحديد الخلايا العصبية من البكترودم أثناء التهليل الغازي ومن ثم الخضوع لنوبة ظهارية للانتقال الظهارية و تهاجر من خلال الجنين إلى مواقع منفصلة في جميع أنحاء الجسم حيث أنها سوف تفرق ميؤوس منها1. وقد كشفت عقود من العمل على شبكة تنظيمية جينية النسخية، ولكن أقل بكثير هو معروف عن آليات التنظيم ما بعد النسخ التي تتحكم في توقيت تطور القمة العصبية.
العمل السابق يشير إلى أن microRNAs (miRNAs) قمع التعبير الجيني التوقيت السليم للتنمية والخلايا مصير القرارات2,3,4,5,6. وقد ركزت الدراسات التي أجريت على الـ miRNAs في تطور قمة العصب إلى حد كبير على مراحل لاحقة من تطور القحف الوجهية. على سبيل المثال، مير-17 ~92 ومير-140 حاسمة لـ الحنكوج خلال التنمية القحفية في الماوس والحمار الوحشي، على التوالي7،,8. لم يتم التحقيق بدقة في مساهمة miRNAs في أقرب قرارات مصير القمة العصبية للجنين. وقد حدت الدراسات المتعلقة بالمقدرات في وقت مبكر من القرارات المصيرية بسبب التحديات التقنية مثل انخفاض عدد الخلايا الموجودة في الأجنة المبكرة.
وقد تم لمحة MiRNAs في المختبر من خطوط الخلية باستخدام الأجسام الجنينية في مراحل مختلفة من التمايز لنموذج تطوير الفأرة في وقت مبكر9. وكان فحص الرنا الرنا الصغير في الجسم الحي خلال تطور الثدييات المبكر محدودا نسبيا. وقد أدت الأساليب السابقة لتحديد miRNAs إلى التحيز كما يتم استخدام تسلسل معروف لتحليل التعبير عن ميرنا محددة في أساليب مثل qPCR، microarrays، ولطخات الشمالية10. الجيل القادم تسلسل وتحسين الأدوات الجزيئية من أي وقت مضى تسمح الآن لتحليل غير متحيز نسبيا للتعبير ميرنا لدراسة مساهمتها في التنمية الثدييات في وقت مبكر وقرارات مصير الخلية.
هنا، نحن الإبلاغ عن تقنية لحصاد وتسلسل RNAs الصغيرة التي أعرب عنها في الخلايا العليا العصبية من الأجنة الماوس في وقت مبكر تمتد gasتخulation (E7.5) إلى بداية تولد organogenesis (E9.5). هذه التقنية مباشرة و تجمع بين تتبع النسب، وفرز الخلايا، وتحديد الحجم القائم على الهلام لإعداد مكتبات تسلسل RNA صغيرة من عدد ضئيل من الخلايا لتسلسل الجيل التالي. نسلط الضوء على أهمية مطابقة مرحلة الرثوم الصارمة للأجنة لحل فترات زمنية مدتها 6 ساعات للحصول على رؤية شاملة للmiRNAs خلال التغيرات السريعة في النمو المبكر. يمكن تطبيق هذه الطريقة على نطاق واسع على الدراسات الوراثية والتنموية وتجنب تجميع الأجنة. نحن نصف طريقة للتغلب على تحديات الأساليب الحالية مثل إثراء ميرنا باستخدام تنقية قائمة على الهلام، وتقدير كم المكتبة، وتقليل التحيز الناجم عن PCR. وقد استخدمت هذه الطريقة لتحديد أنماط التعبير ميرنا مع مرور الوقت لدراسة كيفية التحكم في توقيت النمو في النسب العصبي من أجنة الفئران.
Protocol
Representative Results
Discussion
يمكن أن تمضي العمليات التنموية بسرعة ، وتخضع الخلايا للعديد من المواصفات التسلسلية بحيث لالتقاط رؤية شاملة للمقدرات التي تساهم في قرارات مصير مبكرة ، هناك حاجة إلى تنظيم أكثر تحديدًا من الزيادة نصف اليومية المستخدمة على نطاق واسع. وقد أجريت دراسة حديثة تسلسل الحمض النووي الريبي من Theiler المرحلة 12 الأجنة التي تتراوح بين وجود 3 إلى 6 somites11. نجد أنه خلال هذه الفترة الزمنية ، يتم تحديد خلايا القمة العصبية (3 somites من العمر) ، delaminate (4 somites من العمر) ، والهجرة (5-6 somites من العمر). كما نجد أنه إلى جانب برنامج Cre-driver المستخدم في نسب مجموعات الخلايا المتتبعة، فإن العمر هو أكبر مصدر للتباين بين العينات البيولوجية، وينبغي اعتبار الأجنة المطابقة فقط من اليوميت على أنها تتكاثر. وينبغي أن يؤخذ ذلك أيضا في الاعتبار عند مقارنة الأجنة المعدلة وراثيا لضوابط النمط البري.
وقد استخدمت الأساليب السابقة لميرنا خلال التنمية المبكرة بين 10-100 نانوغرام من المدخلات RNA لإعداد مكتبة تسلسل الجيش الملكي النيبالي الصغيرة وتجميع أجنة متعددة في عينة واحدة13،14. نُظهر عزل الحمض النوويRNA وإعداد المكتبة من جنين E7.5 واحد أو من خلايا القمة العصبية المفرزة في E8.5 و E9.5 باستخدام ما يقرب من 100 نانوغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي كمدخلات. عند فصل الأجنة للفرز، ينبغي للمرء أن يأخذ الرعاية لمشاهدة تفكك تحت المجهر وإخماد رد فعل لمراقبة عندما يتم الحصول على خلايا واحدة. نجد أن تفكك منطقة الجمجمة من الأجنة E8.5-E9.5 هو لحظة تقريبا مع الأنابيب اليدوية لطيف كما هو موضح في البروتوكول. بالنسبة للأنسجة الأكبر والأجنة الأكبر سناً بشكل متزايد، قد يكون وقت الانفصام أطول اعتمادًا على جزء الجنين الذي يتم فصله. بالنسبة للجنين E7.5-E9.5، يمكن رؤية كتل من الخلايا بسهولة تحت المجهر وينبغي أن يستمر الانفصام حتى لا تظهر المزيد من الكتل. خلايا واحدة مرئية في الحل إذا قمت بضبط التركيز من خلال الحل في الخاص بك في أي مكان من 5-10x. أساليب سابقة فرز الخلايا مباشرة في عازلة تحلل لتسلسل RNA لإعدادية RNA بالجملة من عدد منخفض من الخلايا14. هنا نحن فرز مباشرة في محلول تحلل استخراج الحمض النووي الريبي بحيث يمكن عزل الجيش الملكي النيبالي قبل بدء إعداد المكتبة. استخدام أعمدة صغيرة مع 11 ميكرول حجم elution يسمح لتركيز RNA عالية بما فيه الكفاية بحيث يمكن تقسيم الإعدادية RNA واحد بين RNA الصغيرة وسلسلة RNA السائبة.
أحد القيود الحالية لمعظم أساليب تسلسل الحمض النووي الريبي الصغيرة هو تضخيم PCR من cDNA المحولة. أسلوبنا لا يتغلب على هذا القيد، ولكن كنا قادرين على تقليل عدد دورات PCR من 25-الحد الأقصى الموصى بها وصولا الى 16 دورات. وهذا الانخفاض في التضخيم يقلل من تحيز التضخيم الاصطناعي الذي أدخله PCR. مصدر آخر للتحيز هو ربط المحولات ، حيث من المعروف أن تسلسلات محددة تقع في نهايات المحولات و miRNAs يمكن أن ligate جنبا إلى جنب مع كفاءة أكبر من تسلسلات أخرى. لتجنب هذا، يكون المحولات المستخدمة في هذا البروتوكول 4 أسس عشوائية دمجها في نهاية كل محول لمنع التحيز في التفاعلات الربط. بالإضافة إلى ذلك، مشكلة شائعة أخرى هي مقدار خافمات المحول التي تتشكل عند انخفاض الإدخال RNA. تتضمن مجموعة إعداد المكتبة خطوات لتقليل تكوين محول الخافت مثل تعطيل المحول وتنظيفات الخرز لإزالة المحولات الزائدة بعد كل ربط. نحن أيضا المخفف 3 ‘و 5’ محولات 4N من قبل 1/4 لتقليل كمية من خافض محول التي يمكن أن تشكل. وجدنا أنه عندما لا تضعف، كثافة الفرقة 130 BP يزيد مما يجعل من الصعب التمييز من 150 بريتيش بتروليوم الفرقة التي تحتوي على مكتبات الحمض النووي الريبي الصغيرة المطلوب على هلام.
وثمة تحد آخر يواجه حاليا في إعداد مكتبات التسلسل هو التحديد الكمي الدقيق للمنتج قبل التسلسل. لقد وجدنا أن أساليب مختلفة تعطي نتائج متفاوتة على نفس المكتبة. نقترح أن يستخدم الباحثون طرقًا متعددة لتحديد الكمية للحصول على تقدير دقيق للتركيز.
يمكن تطبيق هذا البروتوكول على نطاق واسع على الدراسات الوراثية أو التنموية أو تطبيقات أخرى حيث يتم حصاد الحمض النووي الريبي من عدد قليل من الخلايا. ويبسط هذا النهج الدراسات الزمنية عن طريق تجنب تجميع الأجنة ويمكن تطبيقه بسهولة على الخلايا غير المفرزة والمرتبة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا المشروع من قبل مؤسسة أندرو ماكدونو B + وNICH (R01- HD099252، R01-HD098131. R.J.P. هو باحث CPRIT في أبحاث السرطان (RR150106) والباحث الخامس في أبحاث السرطان (مؤسسة V). كما يود المؤلفون أن يعترفوا بـ “Cytometry” و”خلية فرز الـ”كور” في BCM لتوفير المعدات اللازمة لهذا المشروع.
Materials
| #5 Forceps Fine Science Tools | Fisher Scientific | NC9277114 | |
| 0.4% Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | |
| 10 cm Petri dishes | Fisher Scientific | 07-202-011 | |
| 2-Propanol | Miilapore Sigma | I9516-500ML | |
| 5 % Criterion TBE Polyacrylamide Gel, 12+2 well, 45 µL | Bio-Rad | 3450047 | |
| 5200 Fragment Analyzer | Agilent | M5310AA | |
| 96 well PCR plates high profile semi skirted clear/clear | Bio-Rad | HSS9601 | |
| BD FACSAria II | bdbiosciences | ||
| Bovine Serum Albumin, fraction V | Fisher Scientific | BP1600100 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Gendepot | CA008-300 | |
| Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Ethanol Pure, 200 proof anhydrous | Sigma Aldrich | E7023-500ml | |
| FC-404-2001 | Illumina | FC-404-2001 | |
| HS NGS Fragment kit | Agilent | DNF-474-0500 | |
| HS RNA Kit | Agilent | DNF-472-0500 | |
| miRNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 217004 | |
| NEXTflex Small RNA-Seq Kit v3 (48 barcodes) | Fisher Scientific | NC1289113 | |
| NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2 (150 cycles) | Illumina | FC-404-2001 | |
| NGS Fragment kit | Agilent | DNF-473-1000 | |
| Papain | Worthington | LK003176 | resuspend in 5 mL of Ca/Mg free PBS for a final concentration of 27 U/mL |
| SYBR Gold nucleic acid gel stain | ThermoFisher | S11494 | |
| Trizol LS | ThermoFisher | 10296028 | |
| UVP Benchtop UV Transilluminators: Single UV | Fisher Scientific | UVP95044701 | |
| Vannas Scissors Straight Fine Science Tools #91500-09 | Fisher Scientific | NC9609583 |
References
- Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. A gene regulatory network orchestrates neural crest formation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9, 557-568 (2008).
- Abrahante, J. E., et al. The Caenorhabditis elegans hunchback-like gene lin-57/hbl-1 controls developmental time and is regulated by microRNAs. Developmental Cell. 4 (5), 625-637 (2003).
- Lin, S. Y., et al. The C elegans hunchback homolog, hbl-1, controls temporal patterning and is a probable microRNA target. Developmental Cell. 4 (5), 639-650 (2003).
- Reinhart, B. J., et al. The 21-nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans. Nature. 403 (6772), 901 (2000).
- Slack, F. J., et al. The lin-41 RBCC gene acts in the C. elegans heterochronic pathway between the let-7 regulatory RNA and the LIN-29 transcription factor. Molecular Cell. 5 (4), 659-669 (2000).
- Vella, M. C., Choi, E. Y., Lin, S. Y., Reinert, K., Slack, F. J. The C. elegans microRNA let-7 binds to imperfect let-7 complementary sites from the lin-41 3’UTR. Genes & Development. 18 (2), 132-137 (2004).
- Ventura, A., et al. Targeted deletion reveals essential and overlapping functions of the miR-17 92 family of miRNA clusters. Cell. 132 (5), 875-886 (2008).
- Eberhart, J. K., et al. MicroRNA Mirn140 modulates Pdgf signaling during palatogenesis. Nature Genetics. 40 (3), 290 (2008).
- Li, Y., et al. Dynamic regulation of small RNAome during the early stage of cardiac differentiation from pluripotent embryonic stem cells. Genomics Data. 12, 136-145 (2017).
- Chugh, P., Dittmer, D. P. Potential pitfalls in microRNA profiling. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 3 (5), 601-616 (2012).
- Werber, M., Wittler, L., Timmermann, B., Grote, P., Herrmann, B. G. The tissue-specific transcriptomic landscape of the mid-gestational mouse embryo. Development. 141 (11), 2325-2330 (2014).
- Yang, Q., et al. Highly sensitive sequencing reveals dynamic modifications and activities of small RNAs in mouse oocytes and early embryos. Science Advances. 2, (2016).
- Ohnishi, Y., et al. Small RNA class transition from siRNA/piRNA to miRNA during pre-implantation mouse development. Nucleic Acids Research. 38 (15), 5141-5151 (2010).
- Loontiens, S., et al. Purification of high-quality RNA from a small number of fluorescence activated cell sorted zebrafish cells for RNA sequencing purposes. BMC Genomics. 20 (1), 228 (2019).
