תסה תנוענות פלנרית כדי לאמוד את המאפיינים של מודולים ביולוגיים של מוצרים טבעיים
Summary
תנועתיות פלנרית משמשת כדי לאמוד את תכונות ממריצים ונסיגה של מוצרים טבעיים בהשוואה לתנועה של בעלי החיים במעיין בלבד.
Abstract
אמצעי פשוט, נשלט של שימוש פלנרי שאינו טפילי, Dugesia tigrina, תולעת שטוחה מימית חיים חופשיים, כדי לחקור את תכונות ממריץ ונסיגה של מוצרים טבעיים מתואר. מחקרים ניסיוניים המרוויחים מהיבטים ייחודיים של פיזיולוגיה פלנרית הוחלו על מחקרים על ריפוי פצעים, התחדשות ותוסס גידולים. בנוסף, מכיוון שהפלנריים מפגינים רגישות למגוון גירויים סביבתיים ומסוגלים ללמוד ולפתח תגובות מותנות, ניתן להשתמש בהם במחקרים התנהגותיים הבוחנים למידה וזיכרון. Planarians יש סימטריה דו-צדדית בסיסית ומערכת עצבים מרכזית המשתמשת במערכות מוליך עצבי הניתן ללימודים הבוחנים את ההשפעות של ביואפנולטורים עצביים שריריים. כתוצאה מכך, מערכות ניסיוניות ניטור תנועה פלנרית ותנועתיות פותחו כדי לבחון התמכרות וחומרים גמילה. מכיוון שתנועתיות פלנרית מציעה את הפוטנציאל של מערכת תנועתית רגישה, מתוקנה בקלות כדי לפקח על ההשפעה של גירויים, מבחן מהירות הקטר התכנון (pLmV) הותאם כדי לפקח על התנהגויות גירוי ונסיגה על ידי planarians באמצעות קביעת מספר קווי הרשת חצו בעלי החיים עם הזמן. כאן, הטכניקה והיישום שלה מדגימים ומוסברים.
Introduction
הפרוטוקול המתואר משתמש בתנוענות פלנרית כדי לספק אמצעי להערכת ההשפעות של מודולים ביולוגיים של חומרים טבעיים. זה הותאם במיוחד כדי לקבוע אם חומרים אלה מתפקדים כממריצים, ואם הם היו קשורים אז עם התנהגות גמילהמדידה 1. תסרוקת זו, המכונה מבחן מהירות הקטר התפלנית (pLmV), שימשה לראשונה לבדיקה של סוכנים פרמקולוגייםידועים 2,3. היישום של תנוענות פלנרית זו מבוססת תנועלת גדל מאז בפופולריות, אומץ על ידי מעבדות שונות המעוניינות בחומרים אחרים מאשר מוצרים טבעיים4,,5. לצורך כך, פלנרי ממוקם בצלחת פטרי המכילה מי מעיין או מי מעיין המכילים אפנן ביולוגי מומס. מכיוון שהמנה עצמה מונחת על נייר גרף, ניתן להשתמש במספר קווי הרשת שחצו בעלי החיים עם הזמן במהלך התנועה על המכל כדי לקבוע את קצב התנועה בכל מצב. מבחן האור/כהה, המכונה גם מבחן העדפת מקום מותנה (CPP), הוא וריאציה נוספת על הנושא של ניטור תנוניות פלנרית, ומעריך כמה מהר בעלי החיים מגיבים ונודדים לסביבה חשוכה6,,7. ניתן לנתח מעקב וידאו אחר תנועות תכנון באמצעות תוכניות מחשב ומרכז מסה (COM) מעקבאחר 8,9,,10,11.
שימוש בתכנון כמודל בעלי חיים עבור מחקרים כאלה מציע מספר יתרונות על בעלי חיים אחרים בכך שהנסוי יכול בקלות לשלוט בסביבת ה-assay. באופן ספציפי, להרעיב את התכנון לפני ניסויים יכול למנוע את חשיפתם לחומרים תזונתיים או תרופתיים אחרים שאחרת עלולים לבלבל את התוצאות, ואת biomodulator ספציפי תחת חקירה ניתן להציג את planarians פשוט על ידי הוספתו ישירות למים התרבות, ובכך לתקנן את החשיפה. מאז planarians יש מערכת העצבים נוירוטרנסמיטורים המזכירים בעלי חיים ‘בסדר גבוה’, הפיזיולוגיה ותגובות ניסיוניות של בעלי חיים אלה לגירויים עצביים שריריים נחשבים רלוונטיים ביולוגית אורגניזמים אחרים12,13,14,15,16. כמו כן, מכיוון שהתכננים זולים יחסית וישירים לתחזוקה במעבדה, הם מציעים מודל ביולוגי נגיש לחוקרים רבים.
כחיה ניסיונית, התכנון מתאים למגוון רחב של מחקרים. לדוגמה, הקבוצה שלנו, כמו גם חוקרים אחרים להשתמש planarians כדי ללמודגידולים 17,18,19. Planarians גם להפגין שורה של התנהגויות תגובה כימי, תרמי, כוח הכבידה, חשמל, תמונה, וגירויים מגנטיים שיצרו את הבסיס של מערכות אסיי אחרות. חלק מתופעות אלה שימשו ללימוד למידה וזיכרון בבעלי חייםאלה 20,21,22,23,,24,,25,26,27., השימוש העיקרי במודל התכנון בספרות כיום מתמקד בפעילותם של תאי גזע פלוריפוטנטיים פלוריים, הנקראים neoblasts,ותפקידם בהתחדשות 28,29,30. לפיכך, אימוץ המודל המתואר כאן מאפשר מחקר נוסף באמצעות תחודות אחרות המבוססות על תכנון כדי לספק הבנה רחבה יותר של האופן שבו מוצרים טבעיים ובואפנונים אחרים משפיעים על האורגניזם.
Protocol
Representative Results
Discussion
תנועתיות פלנרית פשוטה ונגישה מתוארת כדי לקבוע את ההשפעות ממריצות ונסיגה של מוצרים טבעיים. כמודל התנהגותי יש צורך בפרוטוקולים מחמירים לניקוד תנועה והגדרות ברורות של התנהגויות כלשהן כדי לתמלן תצפיות בין ניסויים שונים. הרעיונות שהוצגו מציעים הדגמה של איך זה יכול להיות מושגת. כל מעבדה המשתמ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להכיר במשרד של קידום מוסדי, ואת קרן מוריסוויל המכללה למענק פרסום כדי לתמוך בעבודה זו, כמו גם את SUNY מוריסוויל קולג’יט מדע וטכנולוגיה כניסה התוכנית (CSTEP) על הסיוע המתמשך שלהם ותמיכה של מחקר לתואר ראשון ב SUNY מוריסוויל. ברצוננו גם להודות לסופיה הוטצ’נס על הערות מועילות על הטכניקה המתוארת.
Materials
| Bottled Water – 1 Gal. | Poland Spring | N/A | Spring water for planarian culture and to prepare solutions |
| Brown Planaria (Dugesia tigrina) | Carolina Biological Supply Company | 132954 | Brown planaria living (other species are acceptable) |
| Flat Paintbrush | Royal Crafter's Choice | 9159 | Flat watercolor paintbrushes for cleaning planarian culture containers |
| Glass Petri Dish – 10 cm | Kimax | N/A | 10 cm diameter (glass) Petri dishes for pLmV assay |
| Glass Petri Dish – 5 cm | Kimax | N/A | 5 cm and Petri dishes for rinsing planarians during withdrawal experiments and for stimulant habituation |
| Grid Paper | Any | N/A | Standard 0.5 cm grid paper for pLmV assay |
| iPEVO Visualizer (software) | iPEVO | https://www.ipevo.com/software/visualizer | Document camera software for video capture and recording |
| Metalware Set with Support Stand and Retort Ring | Any | N/A | Standard chemistry lab ring stand to hold a cell phone camera if used |
| Organic Egg | Any | N/A | Organic egg or beef liver for feeding planarains |
| Polycarbonate Bottle w/ Screw-on Cap – 10 mL | Beckman | N/A | Plastic vials to hold 5 to 10 mL volumes for stimulant habituation |
| Round Storage Container – 10 cm | Ziploc | N/A | 10 cm Round food storage containers for approximately 90 planarians or fewer |
| Round Water Paint Brush | LOEW-Cornell | N/A | Small round watercolor paint brushes (numbers 3 to 6) – soft |
| Transfer Pipette | Any | N/A | Wide bore (5 mL) plastic transfer pipettes to move planarians |
| USB Document Camera | iPEVO | CDVU-06IP | Document camera (or other camera or cell phone camera) |
References
- Moustakas, D. Guarana provides additional stimulation over caffeine alone in the planarian model. PloS One. 10 (4), 0123310 (2015).
- Raffa, R. B., Valdez, J. M. Cocaine withdrawal in Planaria. European Journal of Pharmacology. 430 (1), 143-145 (2001).
- Raffa, R. B., Holland, L. J., Schulingkamp, R. J. Quantitative assessment of dopamine D2 antagonist activity using invertebrate (Planaria) locomotion as a functional endpoint. Journal of Pharmacology and Toxicological Methods. 45 (3), 223-226 (2001).
- Thumé, I. S., Frizzo, M. E. Sertraline induces toxicity and behavioral alternations in planarians. Biomedical Research International. 2017, 5792621 (2017).
- Aggarwal, S., et al. Identification of a novel allosteric modulator of the human dopamine transporter. ACS Chemical Neuroscience. 10 (8), 3718-3730 (2019).
- Zhang, C., Tallarida, C. S., Raffa, R. B., Rawls, S. M. Sucrose produces withdrawal and dompamine-sensitive reinforcing effects in planarians. Physiology & Behavior. , 8-13 (2013).
- Zewde, A. M., et al. PLDT (planarian light/dark test): an invertebrate assay to quantify defensive responding and study anxiety-like effects. Journal of Neuroscience Methods. 293, 284-288 (2018).
- Risse, B., Otto, N., Berh, D., Jiang, X., Klämbt, C. FIM Imaging and FIMtrack: two new tools allowing high-throughput and cost effective locomotion analysis. Journal of Visualized Experiments. (94), e52207 (2014).
- Inoue, T., Hoshino, H., Yamashita, T., Shimoyama, S., Agata, K. Planarian shows decision-making behavior in response to multiple stimuli by integrative brain function. Zoological Letters. 1, 7 (2015).
- Hastrom, D., Cochet-Escartin, O., Zhang, S., Khuu, C., Collins, E. M. S. Freshwater planarians as an alternative animal model for neurotoxicology. Toxicological Sciences. 147 (1), 270-285 (2015).
- Risse, B., Berh, D., Otto, N., Klämbt, C., Jiang, X. FIMtrack: an open source tracking and locomotion analysis software for small animals. PLoS One Computational Biology. 13 (5), 100553 (2017).
- Pagán, O. R. Planaria: an animal model that integrates development, regeneration and pharmacology. International Journal of Developmental Biology. 61, 519-529 (2017).
- Palladini, G. A pharmacological study of cocaine activity in planaria. Comparative Biochemistry and Physiology. 115 (1), 41-45 (1996).
- Buttarelli, F. R., Pellicano, C., Pontieri, F. E. Neuropharmacology and behavior in planarians: translation to mammals. Comparative Biochemistry and Physiology Part C. Toxicology & Pharmacology. 147 (4), 399-408 (2008).
- Nishimura, K., et al. Identification of glutamic acid decarboxylase gene and distribution of GABAergeric nervous system in the planarian Dugesia japonica. Neuroscience. 153 (4), 1103-1114 (2008).
- Raffa, R. B., Rawls, S. M. . A model for drug action and abuse. , (2008).
- Hall, F., Morita, M., Best, J. B. neoplastic transformation in the planarian: I cocarcinogenesis and histopathology. The Journal of Experimental Zoology. 240 (2), 211-227 (1986).
- Voura, E. B., et al. Planarians as models of cadmium-induced neoplasia provide measurable benchmarks for mechanistic studies. Ecotoxicology and Environmental Safety. 142, 544-554 (2017).
- Van Roten, A., et al. A carcinogenic trigger to study the function of tumor suppressor genes in Schmedtea mediterranea. Disease Models and Mechanisms. 11 (9), 032573 (2018).
- Mason, P. R. Chemo-klino-kinesis in planarian food location. Animal Behaviour. 23 (2), 460-469 (1975).
- Van Huizen, A. V., et al. Weak magnetic fields alter stem cell-mediated growth. Science Advances. 5 (1), 7201 (2019).
- Brown, H. M., Ogden, T. E. The electrical response of the planarian ocellus. Journal of General Physiology. 51 (2), 255-260 (1968).
- Inoue, T., Yamashita, T., Agata, K. Thermosensory signaling by TRPM is processed by brain serotonergic neurons to produce planarian thermotaxis. The Journal of Neuroscience. 34 (47), 15701-15714 (2014).
- Byrne, T. Effects of ethanol on negative phototaxis and motility in brown planarians (Dugesia tigrina). Neuroscience Letters. 685, 102-108 (2018).
- de Sousa, N., et al. Transcriptomic analysis of planarians under simulated microgravity or 8g demonstrates that alteration of gravity induces genomic and cellular alterations that could facilitate tumoral transformation. International Journal of Molecular Sciences. 20 (3), 720 (2019).
- Best, J. B., Rubinstein, I. Maze learning and associated behavior in planaria. Journal of Comparative and Physiological Psychology. 55, 560-566 (1962).
- Shomrat, T., Levin, M. An automated training paradigm reveals long-term memory in planarians and its persistence through head regeneration. The Journal Experimental Biology. 216, 3799-3810 (2013).
- Robarts-Galbraith, R. H., Newmark, P. A. On the organ trail: insights into organ regeneration in the planarian. Current Opinion in Genetics & Development. 32, 37-46 (2015).
- Ivancovic, M., et al. Model systems for regeneration: planarians. Development. 146 (17), 167684 (2019).
- Herath, S., Lobo, D. Cross-inhibition of Turing patterns explains the self-organized regulatory mechanism of planarian fission. Journal of Theoretical Biology. 485, 110042 (2019).
- Itoh, M. T., Shinozawa, T., Sumi, Y. Circadian rhythms of melatonin-synthesizing enzyme activities and melatonin levels in planarians. Brain Research. 830 (1), 165-173 (1999).
- Itoh, M. T., Igarashi, J. Circadian rhythm of serotonin levels in planarians. Neuroreports. 11 (3), 473-476 (2000).
- Hinrichsen, R. D., et al. Photosensitivity and motility in planarian Schmedtea mediterranea vary diurnally. Chronobiology International. 36 (12), 1789-1793 (2019).
- Raffa, R. B., Desai, P. Description and quantification of cocaine withdrawal signs in planaria. Brain Research. 1032 (1-2), 200-202 (2005).
- Pagán, O. R., et al. A cembranoid from tobacco prevents the expression of induced withdrawal behavior in planarian worms. European Journal of Pharmacology. 615 (1-3), 118-124 (2009).
- Rawls, S. M., Patil, T., Yuvasheva, E., Raffa, R. B. First evidence that drugs of abuse produce behavioral sensitization and cross-sensitization in planarians. Behavioural Pharmacology. 21 (4), 301-313 (2010).
- Venturini, G., et al. A pharmacological study of dopaminergic receptors in planaria. Neuropharmacology. 28 (12), 1377-1382 (1989).
- Ouyang, K., et al. Behavioral effects of Spenda, Equal and sucrose: Clues from planarians on sweeteners. Neuroscience Letters. 636, 213-217 (2017).
- Pagán, O. R., Montgomery, E., Deats, S., Bach, D., Baker, D. Evidence of nicotine-induced, curare-sensitive, behavior in planarians. Neurochemical Research. 40 (10), 2087-2090 (2015).
- Shibata, N., Agata, K. RNA interference in planarians: feeding and injection of synthetic dsRNA. Methods in Molecular Biology. 1774, 455-466 (2018).
- Pagán, O. R., et al. Reversal of cocaine-induced planarian behavior by parthenolide and related sesquiterpene lactones. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 89 (2), 160-170 (2008).
- Vouga, A., et al. Stereochemistry and neuropharmacology of a ‘bath salt’ cathinone: S-enantiomer of mephedrone reduces cocaine-induced reward and withdrawal in invertebrates. Neuropharmacology. 91, 109-116 (2015).
- Chan, J. D., Marchant, J. S. Pharmacological and functional genetic assays to manipulate regeneration of the planarian Dugesia japonica. Journal of Visualized Experiments. (54), e3058 (2011).
