Ein planarischer Motilitätstest zur Messung der biomodulierenden Eigenschaften natürlicher Produkte
Summary
Planare Beweglichkeit wird verwendet, um die Stimulans und Entzugseigenschaften von naturwissenschaftlichen Produkten im Vergleich zur Bewegung der Tiere im Quellwasser allein zu messen.
Abstract
Beschrieben wird ein einfaches, kontrollierbares Mittel zur Verwendung des nicht-parasitären Planariers Dugesia tigrina, eines freilebenden Aqua-Flachwurms, um die Stimulans- und Entzugseigenschaften natürlicher Produkte zu untersuchen. Experimentelle Assays, die von einzigartigen Aspekten der planarischen Physiologie profitieren, wurden auf Studien zur Wundheilung, Regeneration und Tumorgenese angewendet. Da Planarier eine Sensibilität für eine Vielzahl von Umweltreizen aufweisen und in der Lage sind, konditionierte Reaktionen zu lernen und zu entwickeln, können sie in Verhaltensstudien verwendet werden, die Lernen und Gedächtnis untersuchen. Planarier besitzen eine grundlegende bilaterale Symmetrie und ein zentrales Nervensystem, das Neurotransmitter-Systeme verwendet, die für Studien zur Untersuchung der Auswirkungen neuromuskulärer Biomodulatoren geeignet sind. Folglich wurden experimentelle Systeme zur Überwachung der planaren Bewegung und Beweglichkeit entwickelt, um Die Sucht und Denentzug von Substanzen zu untersuchen. Da die planare Beweglichkeit das Potenzial für ein empfindliches, leicht standardisiertes Motilitäts-Assay-System zur Überwachung der Wirkung von Reizen bietet, wurde der planarische Bewegungsgeschwindigkeitstest (pLmV) angepasst, um sowohl das Stimulations- als auch das Entzugsverhalten von Planariern durch die Bestimmung der Anzahl der von den Tieren mit der Zeit gekreuzten Gitterlinien zu überwachen. Hier werden die Technik und ihre Anwendung demonstriert und erklärt.
Introduction
Das beschriebene Protokoll verwendet die planare Beweglichkeit, um die biomodulierende Wirkung natürlicher Substanzen zu bewerten. Es wurde speziell angepasst, um festzustellen, ob diese Substanzen als Stimulanzien funktionieren, und ob sie dann mit einem messbaren Entzugsverhalten in Verbindung gebracht wurden1. Dieser Assay, bekannt als planarianer Lokomotorvelocity (pLmV) Test, wurde zuerst verwendet, um bekannte pharmakologische Wirkstoffe zu testen2,3. Die Anwendung dieses planarrischen Motilitäts-basierten Assays hat seitdem an Popularität gewonnen und wurde von verschiedenen Laboratorien angenommen, die an anderen Stoffen als natürlichenProdukten4,5interessiert sind. Für diesen Test wird ein Planarier in eine Petrischale mit Quellwasser oder Quellwasser mit gelöstem Biomodulator gelegt. Da die Schale selbst auf Graphenpapier platziert wird, kann die Anzahl der Gitterlinien, die das Tier mit der Zeit überquert, während es sich um den Behälter bewegt, verwendet werden, um die Bewegungsgeschwindigkeit in jedem Zustand zu bestimmen. Der Hell-Dunkel-Test, auch als Konditionierter Ortspräferenztest (CPP) bezeichnet, ist eine weitere Variante des Themas der Überwachung der planaren Beweglichkeit und bewertet, wie schnell die Tiere reagieren und in eine abgedunkelte Umgebung wandern6,7. Video-Tracking von planaren Bewegungen kann auch mit Computerprogrammen und Massenzentrum (COM) Tracking8,9,10,11analysiert werden.
Die Verwendung des Planariers als Tiermodell für solche Studien bietet mehrere Vorteile gegenüber anderen Tieren, da der Experimentator die Assay-Umgebung leicht kontrollieren kann. Insbesondere kann das Aushungern der Planarier vor dem Experimentieren ihre Exposition gegenüber anderen Ernährungs- oder pharmakologischen Wirkstoffen verhindern, die die Ergebnisse sonst verwirren könnten, und der spezifische Biomodulator, der untersucht wird, kann einfach durch direkte Zugabe in das Kulturwasser in die Planarier eingeführt werden, wodurch die Exposition standardisiert wird. Da Planarier ein Nervensystem und Neurotransmitter haben, die an Tiere höherer Ordnung erinnern, gelten die Physiologie und die experimentellen Reaktionen dieser Tiere auf neuromuskuläre Reize als biologisch relevant für andere Organismen12,13,14,15,16. Auch weil Planarier relativ kostengünstig und unkompliziert im Labor zu warten sind, bieten sie vielen Forschern ein zugängliches biologisches Modell.
Als Versuchstier eignen sich Planarier für eine Vielzahl von Studien. Zum Beispiel, unsere Gruppe, sowie andere Forscher verwenden Planarier Tumorigenese17,18,19zu studieren. Planarier zeigen auch eine Vielzahl von Reaktionsverhalten auf chemische, thermische, gravitarische, elektrische, Foto- und magnetische Reize, die die Grundlage anderer Assay-Systeme bildeten. Einige dieser Effekte wurden verwendet, um lernen und Gedächtnis bei diesen Tieren zu studieren20,21,22,23,24,25,26,27. Die primäre Verwendung des planarischen Modells in der Literatur konzentriert sich derzeit auf die Aktivität von planarianischen pluripotenten Stammzellen, neoblasten genannt, und ihre Rolle bei der Regeneration28,29,30. Die Annahme des hier beschriebenen Modells ermöglicht daher weitere Studien mit anderen planarianbasierten Assays, um ein breiteres Verständnis dafür zu vermitteln, wie natürliche Produkte und andere Biomodulatoren den Organismus beeinflussen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ein einfacher und zugänglicher planarer Motilitätstest wird beschrieben, um die Stimulans- und Entzugserscheinungen natürlicher Produkte zu bestimmen. Als Verhaltensmodell ist es notwendig, strenge Protokolle für scoring Bewegung und klare Definitionen von Verhaltensweisen zu haben, um Beobachtungen zwischen verschiedenen Experimentatoren zu standardisieren. Die vorgestellten Ideen zeigen, wie dies erreicht werden kann. Jedes Labor, das dieses Protokoll verwendet, sollte die vorgelegten Informationen an die Auswirkun…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten das Büro von Institutional Advancement und die Morrisville College Foundation für ein Publikationsstipendium zur Unterstützung dieser Arbeit sowie das SUNY Morrisville Collegiate Science and Technology Entry Program (CSTEP) für ihre laufende Unterstützung und Unterstützung der Bachelor-Forschung bei SUNY Morrisville würdigen. Wir möchten auch Sophia Hutchens für die hilfreichen Kommentare zu der beschriebenen Technik danken.
Materials
| Bottled Water – 1 Gal. | Poland Spring | N/A | Spring water for planarian culture and to prepare solutions |
| Brown Planaria (Dugesia tigrina) | Carolina Biological Supply Company | 132954 | Brown planaria living (other species are acceptable) |
| Flat Paintbrush | Royal Crafter's Choice | 9159 | Flat watercolor paintbrushes for cleaning planarian culture containers |
| Glass Petri Dish – 10 cm | Kimax | N/A | 10 cm diameter (glass) Petri dishes for pLmV assay |
| Glass Petri Dish – 5 cm | Kimax | N/A | 5 cm and Petri dishes for rinsing planarians during withdrawal experiments and for stimulant habituation |
| Grid Paper | Any | N/A | Standard 0.5 cm grid paper for pLmV assay |
| iPEVO Visualizer (software) | iPEVO | https://www.ipevo.com/software/visualizer | Document camera software for video capture and recording |
| Metalware Set with Support Stand and Retort Ring | Any | N/A | Standard chemistry lab ring stand to hold a cell phone camera if used |
| Organic Egg | Any | N/A | Organic egg or beef liver for feeding planarains |
| Polycarbonate Bottle w/ Screw-on Cap – 10 mL | Beckman | N/A | Plastic vials to hold 5 to 10 mL volumes for stimulant habituation |
| Round Storage Container – 10 cm | Ziploc | N/A | 10 cm Round food storage containers for approximately 90 planarians or fewer |
| Round Water Paint Brush | LOEW-Cornell | N/A | Small round watercolor paint brushes (numbers 3 to 6) – soft |
| Transfer Pipette | Any | N/A | Wide bore (5 mL) plastic transfer pipettes to move planarians |
| USB Document Camera | iPEVO | CDVU-06IP | Document camera (or other camera or cell phone camera) |
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