Een planaire beweeglijkheidstest om de biomodulating eigenschappen van natuurlijke producten te meten
Summary
Planaire beweeglijkheid wordt gebruikt om de stimulerende en ontwenningseigenschappen van natuurlijke producten te meten in vergelijking met de beweging van de dieren in bronwater alleen.
Abstract
Een eenvoudige, controleerbare manier van het gebruik van de niet-parasitaire planarian, Dugesia tigrina, een vrij levende aquatische platworm, om de stimulerende en ontwenningseigenschappen van natuurlijke producten te bestuderen wordt beschreven. Experimentele tests profiteren van unieke aspecten van de planaire fysiologie zijn toegepast op studies over wondgenezing, regeneratie, en tumorigenese. Bovendien, omdat planarianen gevoeligheid voor een verscheidenheid van milieustimuli vertonen en in staat zijn om geconditioneerde reacties te leren en te ontwikkelen, kunnen ze worden gebruikt in gedragsstudies die leren en geheugen onderzoeken. Planarianen beschikken over een fundamentele bilaterale symmetrie en een centraal zenuwstelsel dat neurotransmitter systemen vatbaar maakt voor studies onderzoeken van de effecten van neuromusculaire biomodulatoren. Bijgevolg zijn experimentele systemen ontwikkeld die de planaire beweging en beweeglijkheid monitoren om verslaving en terugtrekking van stoffen te onderzoeken. Omdat planaire beweeglijkheid biedt het potentieel voor een gevoelige, gemakkelijk gestandaardiseerde beweeglijkheidstest systeem om het effect van stimuli te controleren, de planaire motorische snelheid (pLmV) test werd aangepast om zowel stimulatie en ontwenningsgedrag te controleren door planarianen door de bepaling van het aantal rasterlijnen gekruist door de dieren met de tijd. Hier worden de techniek en de toepassing ervan gedemonstreerd en uitgelegd.
Introduction
Het beschreven protocol maakt gebruik van de planaire beweeglijkheid om een middel te bieden om de biomodulating effecten van natuurlijke stoffen te beoordelen. Het werd specifiek aangepast om te bepalen of deze stoffen functioneren als stimulerende middelen, en als ze vervolgens werden geassocieerd met een meetbare terugtrekking gedrag1. Deze test, bekend als de planaire motorische snelheid (pLmV) test, werd voor het eerst gebruikt om bekende farmacologische agentia te testen2,3. De toepassing van deze op planaire beweeglijkheid gebaseerde test is sindsdien in populariteit gegroeid en is overgenomen door verschillende laboratoria die geïnteresseerd zijn in andere stoffen dan natuurlijke producten4,5. Voor deze test wordt een planarian geplaatst in een petrischaal met bronwater of bronwater met een opgeloste biomodulator. Omdat de schotel zelf op grafiekpapier wordt geplaatst, kan het aantal rasterlijnen dat door het dier met de tijd wordt gekruist aangezien het zich over de container beweegt worden gebruikt om de snelheid van beweging in elke voorwaarde te bepalen. De licht/donkere test, ook wel de geconditioneerde plaatsvoorkeurstest (CPP) genoemd, is een andere variant op het thema van het monitoren van de planaire beweeglijkheid, en beoordeelt hoe snel de dieren reageren en migreren naar een verduisterde omgeving6,7. Video tracking van planaire bewegingen kan ook worden geanalyseerd met behulp van computerprogramma’s en het centrum van de massa (COM) tracking8,,9,,10,11.
Het gebruik van de planarian als een dier model voor dergelijke studies biedt verschillende voordelen ten opzichte van andere dieren in die tijd dat de onderzoeker gemakkelijk kan de test omgeving controle. In het bijzonder, hongeren de planarianen voor experimenten kan voorkomen dat hun blootstelling aan andere voedings-of farmacologische agentia die anders zou kunnen verwarren de resultaten, en de specifieke biomodulator in onderzoek kan worden ingevoerd om de planarianen gewoon door het direct toe te voegen aan de cultuur water, waardoor standaardiseren van de blootstelling. Aangezien planarianen een zenuwstelsel en neurotransmitters hebben die doen denken aan ‘dieren met hogere orde’, worden de fysiologie en experimentele reacties van deze dieren op neuromusculaire stimuli als biologisch relevant beschouwd voor andere organismen12,13,14,15,16. Ook, omdat planarianen zijn relatief goedkoop en eenvoudig te onderhouden in het laboratorium, ze bieden een toegankelijk biologisch model voor veel onderzoekers.
Als proefdier zijn planarianen geschikt voor een breed scala aan studies. Bijvoorbeeld, onze groep, evenals andere onderzoekers gebruiken planarianen om tumorigenese17,18,,19te bestuderen . Planarianen vertonen ook een groot aantal reactiegedrag op chemische, thermische, gravitatie-, elektrische, foto- en magnetische stimuli die de basis van andere testsystemen hebben gevormd. Sommige van deze effecten zijn gebruikt om leren en geheugen bij deze dieren te bestuderen20,21,22,23,24,25,26,27. Het primaire gebruik van het planariane model in de literatuur richt zich momenteel op de activiteit van planarian pluripotente stamcellen, neoblacden genoemd, en hun rol in regeneratie28,29,30. De goedkeuring van het hier beschreven model maakt het dus mogelijk om verder te bestuderen met behulp van andere op planaire gebaseerde tests om een breder begrip te bieden van de invloed van natuurlijke producten en andere biomodulatoren op het organisme.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een eenvoudige en toegankelijke planaire beweeglijkheidstest wordt beschreven om de stimulerende en ontwenningseffecten van natuurlijke producten te bepalen. Als gedragsmodel is het noodzakelijk om strenge protocollen te hebben voor het scoren van beweging en duidelijke definities van elk gedrag om waarnemingen tussen verschillende onderzoekers te standaardiseren. De gepresenteerde ideeën geven een demonstratie van hoe dit kan worden bereikt. Elk laboratorium dat dit protocol gebruikt, moet de gepresenteerde informatie …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen het kantoor van Institutional Advancement erkennen, en de Morrisville College Foundation voor een publicatie subsidie ter ondersteuning van dit werk, evenals de SUNY Morrisville Collegiate Science and Technology Entry Program (CSTEP) voor hun voortdurende hulp en ondersteuning van undergraduate onderzoek aan SUNY Morrisville. We willen ook Sophia Hutchens bedanken voor nuttige opmerkingen over de beschreven techniek.
Materials
| Bottled Water – 1 Gal. | Poland Spring | N/A | Spring water for planarian culture and to prepare solutions |
| Brown Planaria (Dugesia tigrina) | Carolina Biological Supply Company | 132954 | Brown planaria living (other species are acceptable) |
| Flat Paintbrush | Royal Crafter's Choice | 9159 | Flat watercolor paintbrushes for cleaning planarian culture containers |
| Glass Petri Dish – 10 cm | Kimax | N/A | 10 cm diameter (glass) Petri dishes for pLmV assay |
| Glass Petri Dish – 5 cm | Kimax | N/A | 5 cm and Petri dishes for rinsing planarians during withdrawal experiments and for stimulant habituation |
| Grid Paper | Any | N/A | Standard 0.5 cm grid paper for pLmV assay |
| iPEVO Visualizer (software) | iPEVO | https://www.ipevo.com/software/visualizer | Document camera software for video capture and recording |
| Metalware Set with Support Stand and Retort Ring | Any | N/A | Standard chemistry lab ring stand to hold a cell phone camera if used |
| Organic Egg | Any | N/A | Organic egg or beef liver for feeding planarains |
| Polycarbonate Bottle w/ Screw-on Cap – 10 mL | Beckman | N/A | Plastic vials to hold 5 to 10 mL volumes for stimulant habituation |
| Round Storage Container – 10 cm | Ziploc | N/A | 10 cm Round food storage containers for approximately 90 planarians or fewer |
| Round Water Paint Brush | LOEW-Cornell | N/A | Small round watercolor paint brushes (numbers 3 to 6) – soft |
| Transfer Pipette | Any | N/A | Wide bore (5 mL) plastic transfer pipettes to move planarians |
| USB Document Camera | iPEVO | CDVU-06IP | Document camera (or other camera or cell phone camera) |
References
- Moustakas, D. Guarana provides additional stimulation over caffeine alone in the planarian model. PloS One. 10 (4), 0123310 (2015).
- Raffa, R. B., Valdez, J. M. Cocaine withdrawal in Planaria. European Journal of Pharmacology. 430 (1), 143-145 (2001).
- Raffa, R. B., Holland, L. J., Schulingkamp, R. J. Quantitative assessment of dopamine D2 antagonist activity using invertebrate (Planaria) locomotion as a functional endpoint. Journal of Pharmacology and Toxicological Methods. 45 (3), 223-226 (2001).
- Thumé, I. S., Frizzo, M. E. Sertraline induces toxicity and behavioral alternations in planarians. Biomedical Research International. 2017, 5792621 (2017).
- Aggarwal, S., et al. Identification of a novel allosteric modulator of the human dopamine transporter. ACS Chemical Neuroscience. 10 (8), 3718-3730 (2019).
- Zhang, C., Tallarida, C. S., Raffa, R. B., Rawls, S. M. Sucrose produces withdrawal and dompamine-sensitive reinforcing effects in planarians. Physiology & Behavior. , 8-13 (2013).
- Zewde, A. M., et al. PLDT (planarian light/dark test): an invertebrate assay to quantify defensive responding and study anxiety-like effects. Journal of Neuroscience Methods. 293, 284-288 (2018).
- Risse, B., Otto, N., Berh, D., Jiang, X., Klämbt, C. FIM Imaging and FIMtrack: two new tools allowing high-throughput and cost effective locomotion analysis. Journal of Visualized Experiments. (94), e52207 (2014).
- Inoue, T., Hoshino, H., Yamashita, T., Shimoyama, S., Agata, K. Planarian shows decision-making behavior in response to multiple stimuli by integrative brain function. Zoological Letters. 1, 7 (2015).
- Hastrom, D., Cochet-Escartin, O., Zhang, S., Khuu, C., Collins, E. M. S. Freshwater planarians as an alternative animal model for neurotoxicology. Toxicological Sciences. 147 (1), 270-285 (2015).
- Risse, B., Berh, D., Otto, N., Klämbt, C., Jiang, X. FIMtrack: an open source tracking and locomotion analysis software for small animals. PLoS One Computational Biology. 13 (5), 100553 (2017).
- Pagán, O. R. Planaria: an animal model that integrates development, regeneration and pharmacology. International Journal of Developmental Biology. 61, 519-529 (2017).
- Palladini, G. A pharmacological study of cocaine activity in planaria. Comparative Biochemistry and Physiology. 115 (1), 41-45 (1996).
- Buttarelli, F. R., Pellicano, C., Pontieri, F. E. Neuropharmacology and behavior in planarians: translation to mammals. Comparative Biochemistry and Physiology Part C. Toxicology & Pharmacology. 147 (4), 399-408 (2008).
- Nishimura, K., et al. Identification of glutamic acid decarboxylase gene and distribution of GABAergeric nervous system in the planarian Dugesia japonica. Neuroscience. 153 (4), 1103-1114 (2008).
- Raffa, R. B., Rawls, S. M. . A model for drug action and abuse. , (2008).
- Hall, F., Morita, M., Best, J. B. neoplastic transformation in the planarian: I cocarcinogenesis and histopathology. The Journal of Experimental Zoology. 240 (2), 211-227 (1986).
- Voura, E. B., et al. Planarians as models of cadmium-induced neoplasia provide measurable benchmarks for mechanistic studies. Ecotoxicology and Environmental Safety. 142, 544-554 (2017).
- Van Roten, A., et al. A carcinogenic trigger to study the function of tumor suppressor genes in Schmedtea mediterranea. Disease Models and Mechanisms. 11 (9), 032573 (2018).
- Mason, P. R. Chemo-klino-kinesis in planarian food location. Animal Behaviour. 23 (2), 460-469 (1975).
- Van Huizen, A. V., et al. Weak magnetic fields alter stem cell-mediated growth. Science Advances. 5 (1), 7201 (2019).
- Brown, H. M., Ogden, T. E. The electrical response of the planarian ocellus. Journal of General Physiology. 51 (2), 255-260 (1968).
- Inoue, T., Yamashita, T., Agata, K. Thermosensory signaling by TRPM is processed by brain serotonergic neurons to produce planarian thermotaxis. The Journal of Neuroscience. 34 (47), 15701-15714 (2014).
- Byrne, T. Effects of ethanol on negative phototaxis and motility in brown planarians (Dugesia tigrina). Neuroscience Letters. 685, 102-108 (2018).
- de Sousa, N., et al. Transcriptomic analysis of planarians under simulated microgravity or 8g demonstrates that alteration of gravity induces genomic and cellular alterations that could facilitate tumoral transformation. International Journal of Molecular Sciences. 20 (3), 720 (2019).
- Best, J. B., Rubinstein, I. Maze learning and associated behavior in planaria. Journal of Comparative and Physiological Psychology. 55, 560-566 (1962).
- Shomrat, T., Levin, M. An automated training paradigm reveals long-term memory in planarians and its persistence through head regeneration. The Journal Experimental Biology. 216, 3799-3810 (2013).
- Robarts-Galbraith, R. H., Newmark, P. A. On the organ trail: insights into organ regeneration in the planarian. Current Opinion in Genetics & Development. 32, 37-46 (2015).
- Ivancovic, M., et al. Model systems for regeneration: planarians. Development. 146 (17), 167684 (2019).
- Herath, S., Lobo, D. Cross-inhibition of Turing patterns explains the self-organized regulatory mechanism of planarian fission. Journal of Theoretical Biology. 485, 110042 (2019).
- Itoh, M. T., Shinozawa, T., Sumi, Y. Circadian rhythms of melatonin-synthesizing enzyme activities and melatonin levels in planarians. Brain Research. 830 (1), 165-173 (1999).
- Itoh, M. T., Igarashi, J. Circadian rhythm of serotonin levels in planarians. Neuroreports. 11 (3), 473-476 (2000).
- Hinrichsen, R. D., et al. Photosensitivity and motility in planarian Schmedtea mediterranea vary diurnally. Chronobiology International. 36 (12), 1789-1793 (2019).
- Raffa, R. B., Desai, P. Description and quantification of cocaine withdrawal signs in planaria. Brain Research. 1032 (1-2), 200-202 (2005).
- Pagán, O. R., et al. A cembranoid from tobacco prevents the expression of induced withdrawal behavior in planarian worms. European Journal of Pharmacology. 615 (1-3), 118-124 (2009).
- Rawls, S. M., Patil, T., Yuvasheva, E., Raffa, R. B. First evidence that drugs of abuse produce behavioral sensitization and cross-sensitization in planarians. Behavioural Pharmacology. 21 (4), 301-313 (2010).
- Venturini, G., et al. A pharmacological study of dopaminergic receptors in planaria. Neuropharmacology. 28 (12), 1377-1382 (1989).
- Ouyang, K., et al. Behavioral effects of Spenda, Equal and sucrose: Clues from planarians on sweeteners. Neuroscience Letters. 636, 213-217 (2017).
- Pagán, O. R., Montgomery, E., Deats, S., Bach, D., Baker, D. Evidence of nicotine-induced, curare-sensitive, behavior in planarians. Neurochemical Research. 40 (10), 2087-2090 (2015).
- Shibata, N., Agata, K. RNA interference in planarians: feeding and injection of synthetic dsRNA. Methods in Molecular Biology. 1774, 455-466 (2018).
- Pagán, O. R., et al. Reversal of cocaine-induced planarian behavior by parthenolide and related sesquiterpene lactones. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 89 (2), 160-170 (2008).
- Vouga, A., et al. Stereochemistry and neuropharmacology of a ‘bath salt’ cathinone: S-enantiomer of mephedrone reduces cocaine-induced reward and withdrawal in invertebrates. Neuropharmacology. 91, 109-116 (2015).
- Chan, J. D., Marchant, J. S. Pharmacological and functional genetic assays to manipulate regeneration of the planarian Dugesia japonica. Journal of Visualized Experiments. (54), e3058 (2011).
