JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

In Vitro Mikroakışkan Hastalık Modeli Gerçek Zamanlı Olarak Tam Kan-Endotel Etkileşimleri ve Kan Pıhtısı Dinamikleri Çalışma

Published: May 24, 2020
doi:
10.3791/61068
, , , , , ,
1Department of Pulmonary Diseases, Amsterdam UMC,VU University Medical Center, Amsterdam Cardiovascular Sciences (ACS), 2BIOS Lab-on-a-Chip group,University of Twente, 3Applied Stem Cell Technologies Group,University of Twente, 4Department of Cardio-thoracic Surgery, Amsterdam UMC,VU University Medical Center, 5Institute of Physiology,Charité-Universitätsmedizin, 6German Heart Center

Summary

Hasta kaynaklı endotel ile tam kan etkileşimini araştırmak için in vitro vasküler hastalık modeli salıyoruz. Bu sistem çeşitli koşullar altında primer endotel hücrelerinin trombojenik özelliklerinin incelenmesini sağlar. Bu yöntem özellikle pıhtılaşmanın farklı aşamalarında situ trombojenite ve antikoagülasyon tedavisinin değerlendirilmesi için uygundur.

Abstract

Kan pıhtılarının oluşumu endotel hücreleri, altta yatan matris, çeşitli kan hücreleri ve proteinler arasında karmaşık etkileşimleri içerir. Endotel trombosit agregasyon, pıhtılaşma ve fibrinolyz kontrol büyük hemostatik moleküllerin çoğu birincil kaynağıdır. Tromboz mekanizması yıllardır araştırılmış olmasına rağmen, in vitro çalışmalar ağırlıklı olarak subendothelial matris maruz alır vasküler hasar durumları üzerinde odaklanmak, ya da tek kan bileşenleri ile hücreler arasındaki etkileşimler. Yöntemimiz tam kan ve sağlam, confluent vasküler hücre ağı arasındaki etkileşimleri incelenmesine olanak sağlar.

Birincil insan endotel hücrelerini kullanarak, bu protokol trombüs dinamikleri üzerinde endotel hücrelerinin etkisini incelemek için eşsiz bir fırsat sağlar ve trombotik hastalığın patofizyolojisi içine değerli bilgiler verir. Özel yapım mikroakışkan akış kanallarının kullanımı, hastalığa özgü vasküler geometrilerin uygulanmasına ve modele özgü morfolojik vasküler değişikliklerin uygulanmasına olanak sağlar. Trombüs gelişimi gerçek zamanlı olarak kaydedilir ve trombosit yapışması ve fibrin birikimi ile kantitatif olarak karakterize edilir. Değişmiş trombüs dinamiğinde endotel fonksiyonunun etkisi, spesifik moleküllerin immünfloresans boyaması yoluyla postanalysis ile belirlenir.

Temsilsonuçları deneysel kurulum, veri toplama ve veri analizi açıklar. Araştırma sorusuna bağlı olarak, her bölüm için parametreler hücre tipi, kesme oranları, kanal geometrisi, ilaç tedavisi ve postanalysis prosedürleri de dahil olmak üzere ayarlanabilir. Protokol, kronik tromboembolik hastalığı olan hastaların pulmoner arter endotellerinde trombüs oluşumunun ölçülmesi ile doğrulanır.

Introduction

Endotel kan damarlarının iç hücresel tabakasını oluşturur ve kanı çevreleyen dokudan ayırır. Mikro ortamı aktif olarak düzenleyen ve dış uyaranlara yanıt veren dinamik bir organ olarak tanımlanmıştır1. Akan kan ile doğrudan temas nedeniyle, endotel hemostaz ve tromboz kontrolünde önemli ve trombosit agregasyonu kontrol büyük düzenleyici moleküllerin birçok birincil kaynağıdır, pıhtılaşma, ve fibrinolyz2. Sağlıklı, aktive olmayan endotel hücreleri (EC) trombosit aktivasyonuna karşı ve prostasiklin, trombomodülin veya doku faktörü yolu inhibitörü (TFPI)2,3gibi kan akışını korumak için pıhtılaşma ve trombüs oluşumunu önlemek çeşitli moleküller üretmek . Bu trombosit yapışmasını önler, trombosit agregasyonu, ve trombüs oluşumu. Yaralanma veya damar duvarının aktivasyonu lokalize trombosit adezyon ve pıhtı oluşumu nu başlatan prokoagülan endotelfenot ile sonuçlanır2,4. Endotel aktivasyon trombositleri, EC’lerden salınan çok meric protein von Willebrand Factor ‘e (VWF) veya altta yatan subendothelial matrisin maruz kalan bağlanma bölgelerine bağlıdır. Daha sonra, trombositmoleküler değişiklikler ve doku faktörüne maruz kalma (TF) fibrin polimerizasyon5,6ile trombüs oluşumunu neden pıhtılaşma sisteminin aktivasyonunu başlatır. Birlikte, ortaya çıkan pıhtı yeniden endotelizasyon7ile yara kapanması için temel sağlar. Pıhtılaşma sisteminin pertürbasyonları, von Willebrand hastalığı, hemofili veya tromboz gibi genellikle endotel hemostatik yolun disregulated pro- ve antitrombotik dengesi nden kaynaklanan kanama bozukluklarına neden olabilir2,3.

Hemostaz süreci hem arteriyel hem de venöz dolaşımda görülür. Ancak arteriyel ve venöz trombozun altında yatan mekanizmalar temelde farklıdır. Arteriyel tromboz, iskemik kalp hastalığında görüldüğü gibi, çoğunlukla yüksek kesme streskoşulları altında bir aterosklerotik plak rüptürü tarafından tahrik edilirken, venöz tromboz çoğunlukla staz bir durumda endotel yaralanması yokluğunda gelişir8,9,10. Derin bir ven trombüsembolize ve pulmoner arterler doğru seyahat, bir pulmoner emboli neden olduğu. Bu kronik tromboembolik pulmoner hipertansiyon gelişimi de dahil olmak üzere kornik akciğer hastalıklarının gelişimini teşvik edebilir önemli bozulmuş fonksiyonel kapasitelere yol açan kronik vasküler obstrüksiyonlar neden olabilir (CTEPH)11,12,13,14. CTEPH, en az üç ay süren antikoagülasyon tedavisinin ardından tromboembolik materyal ile pulmoner arterlerin tıkanması nedeniyle pulmoner basıncın yükselmesi ile karakterizedir15. Akciğer emboline ek olarak, pulmoner endotel cteph bir protrombotik ortam sağlar ve bu situ tromboz ve pulmoner arterlerin kronik tıkanıklıkları kolaylaştırır, sonuçta kalp yetmezliğine neden olabilir kan basıncında artışa neden olduğu ileri sürülmektedir, eğer tedavi edilmezse16,17.

Geçtiğimiz yıllarda trombosit fonksiyonu ve pıhtılaşma18ölçerek trombüs oluşumunu incelemek için çeşitli çalışmalar tahlillerin geliştirilmesine yol açmıştır. Ancak, çoğu ya kollajenler veya fibrinler gibi tek hücre dışı matriks bileşenleri ile tam kan etkileşimi çalışma, ya da endotel trombosit veya endotel-lökosit etkileşimi 19 gibi tek kan bileşenleri ile etkileşim endotel fonksiyonu19,20,21,22. Bu tahliller en sık insan göbek ven endotel hücreleri ile yapılır (HUVEC), Bu hücreler kolayca elde edilir gibi. Ancak, hemostatik genler farklı vasküler ağaç, damar tipleri arasında ifade edilir, ve organ sistemleri23,24, hangi arteriyel tromboz veya pulmoner emboli sorunlu dahil endotel hücrelerini temsil etmek için HUVECs kullanımını yapar23.

EC plastisiteye ek olarak, hastalığa özgü hemodinamik değişiklikler ve vasküler morfolojideki değişiklikler normal endotel25’tetrombüs oluşumunu teşvik edebilir. Daha yüksek kesme hızları, lokal vazokonstriksiyon veya damar geometrisindeki değişiklikler nedeniyle, örneğin, akut trombüs oluşumuna neden olabilir, kan akışının kesilmesini hızlandıran bir darlık neden26. Özel yapım mikromühendislik akış kanallarının kullanımı, özellikle (pato) biyolojiyi temsil eden vasküler geometrilerin tasarlanmasına olanak sağlar. Bu şekilde yerel biyomekanik kuvvetlerin sağlıklı veya hastalıklı EC27üzerindeki etkisini incelemek mümkündür.

Pıhtılaşma basamaklarında farklı evreleri ve molekülleri hedeflemek için antikoagülasyon tedavileri mevcuttur ve bunların hepsi belirli bozukluklara özgü olabilecek belirli riskler ve faydalar oluşturmaktadır. Bu yazıda açıklanan hastalık modelleme yaklaşımı özellikle trombüs dinamiği üzerinde çeşitli antikoagülasyon ve antiplatelet tedavilerin etkilerini test etmek için uygundur.

Amaç, kullanılan primer EC’lerin türüne bağlı olarak çeşitli tromboz formlarının analizine uygun çok yönlü bir model içeren bir tromboz modeli sunmaktır. Örnek olarak, Trombüs oluşumunda rol oynayan tüm bileşenleri (trombositler, lökositler, eritrositler, pıhtılaşma proteinleri ve kofaktörler) içeren tüm insan kanı ile etkileşimde CTEPH hastalarından pulmoner arter endotel hücreleri kullandık. Bu yaklaşım ticari paralel akış kanallarında veya özel vasküler tasarıma sahip özel yapım mikroakışkan akış kanallarında uygulanabilir. Bu nedenle, model sonunda trombüs oluşumu ve çözümü çalışmalarında kullanılabilir, hastalık modelleme inflamatuar yanıtların değerlendirilmesi için, antiplatelet veya antikoagülasyon tedavisi için, ve sonuçta kişiselleştirilmiş tıp için.

Bu çalışmada primer insan pulmoner arter endotel hücrelerinin izolasyonu açıklanmaktadır. Diğer birincil insan endotel hücre tiplerinin izolasyonu için, daha önce yayınlanmış yöntemlere atıfta bulunmak, pulmoner mikrovasküler endotel hücreleri de dahil olmak üzere25, insan göbek ven endotel hücreleri28, ve kan dolaşan endotel kolonisi oluşturan hücreler Şekil 1A29.

Protocol

Bu çalışma, Hollanda’nın AMSTERDAM’daki VU Tıp Merkezi’nin kurumsal Tıbbi Etik İnceleme Kurulu tarafından onaylanmıştır (METC VUmc, NL69167.029.19). Helsinki Bildirgesi uyarınca yazılı bilgilendirilmiş onay alındıktan sonra birincil hücre izolasyonu ve insan deneklerin kan toplanması gerçekleştirilmiştir. 1. Birincil insan pulmoner arteriyel endotel hücrelerinin izolasyonu ve kültürü (PAEC) Sıcak komple endotel hücreli orta (cECM) ile takviye 5% fetal sığır serum (FBS), 1% penisilin / streptomisin (P / S), 1% endotel hücre büyüme takviyeleri (EKGS), ve 1% esansiyel olmayan amino asitler (NEAA), bir su banyosunda 37 °C. 120 °C ısı sterilizatörü veya etanol içeren cerrahi makas, forceps ve neşter ile sterilize edin. PAEC’in steril koşullarda laminar akış kabininde izolasyonuna devam edin. 60 mm hücre kültür çanağı (Bkz. Malzeme Tablosu)ile 2 mL 5 μg/mL fibronectin ve en az 15 dakika boyunca 37 °C’de kuluçkaya yatırın. Ameliyattan pulmoner arter (PA) dokusu elde edin(örneğin,lobektomi veya pulmoner endarterektomi), 4 °C soğuk kord tamponu (4 mM potasyum klorür, 140 mM sodyum klorür, 10 mM HEPES, 11 mM D-glukoz ve %1 P/S, pH = 7,3) saklayın ve izolasyona kadar buzda tutun. Doku alındıktan sonra 2 saat içinde PA endotel hücrelerini izole edin. Forceps ile PA alın ve PBS ile yıkamak için 10 cm Petri kabına koyun. PA hala bir halka ise, makas ile açık pulmoner arter kesti. Endotel kolayca hasar gördüğünden ve/veya çıkarıldığından, kabın en iç teki tabakasına aletlerle dokunmamaya dikkat edin. Hücre kültür çanağı fibronektin çıkarın ve cECM orta 4 mL ekleyin. P’li dokuyu forcep ile alın ve ortama yerleştirin. Bu arada, dikkatle bir neşter ile orta içine geminin iç tabakası kazıyın. Genellikle, lipid birikimleri damar duvarında görülebilir. Hücre büyümesini etkileyeceği için bunları atlamaya çalışın. Endotel hücrelerinin küçük kolonileri görünmeye başlayana kadar hücreleri kültür içinde tutun. Orta yı her gün değiştirin. Fibroblastlar kültürü kirletecekse, üreticinin talimatlarına uygun olarak CD144 için manyetik yakınlık hücre ayrımı ile arındırın ( bkz. İlk saflaştırma için iki sütunlu yöntemi ve ardışık her saflaştırma için tek sütunlu yöntemi kullanın. Genellikle akış sitometrisi ≤ kirletici hücreleri algıladığında bir kültür saf olarak tanımlanır. Deneysel kullanım için yeterli PAEC’ler yetiştirilene kadar hücreleri 1:3 ile 1:4 arasında bölün. PAC’ler kullanıma hazır olduğunda, bir sonraki adımla devam edin. Arınma sonrası primer endotel hücrelerinin AT spesifik belirteçlerinin(örneğin,VE-kadherin, CD31, TIE2) varlığı ve düz kas hücrelerinin (α-SMA), fibroblast (vimentin) ve epitel (sitatin) belirteçlerinin yokluğu için karakterize edilmesi gerekir(Şekil 1B). 2. Akış odaları nın ve PAEC monolayers’ın hazırlanması NOT: Hipoteze bağlı olarak, ticari olarak kullanılabilen akış odalarını (bkz. Malzeme Tablosu ve Şekil 1CSeçeneği A,protokolün adım 2.1′ i) veya özel yapım mikroakışkan akış odası(Şekil 1C OptionB, protokolün 2.2. adım). Ticari olarak mevcut mikroslaytlarda endotel monokatlarının hücre tohumlanmasıNOT: Ticari olarak kullanılabilen akış odalarının kullanımı kolaydır ve kanal boyunca yüksek kesme hızlarında kullanılabilecek laminar akış deseni sağlar. Bu mikro slaytlar çok kanallı paralel çalışır izin vermek ve doğru ve tekrarlanabilir akış profili sağlamak için tasarlanmıştır. Ters mikroskopi için optimize edildiklerinden, yüksek kaliteli floresan görüntüleri yakalamak mümkündür. Ayrıca, akış odalarının çeşitli boyutları farklı kanal boyutlarında veya geometrilerde mevcuttur. Bu mikro slaytlar küçük boyutlara sahip olduğundan ve çok paralel çalıştırmalara izin verdiğinden, 6 kuyulu akış kanalları bu teşpiçin tercih edilir. 6 kuyulu akış lı bir kaydırak (3,5 mm genişlik x 0,4 mm yükseklik x 17 mm uzunluk) bir kanalı kaplamak için kanal başına %0,1 jelatin 30 μL kullanın ve en az 15 dakika boyunca 37 °C’de kuluçkaya yatırın. Bir kanalı tohumlamak için 10 cm2’lik confluent PAEC’leri deneyin ve oda sıcaklığında (RT) 7 dk için 300 x g’da aşağı doğru döndürün. 600 μL cECM ve pipet 100 μL (1,5 cm2) hücre süspansiyonundaki PAEC’leri bir kanalda askıya alın. Bu kılcal eylem yoluyla mikroslayt kapsar. Çok yavaş gidiyorsa, hava kabarcıkları oluşacak. Borulama yaparken biraz daha kuvvet kullanarak hava kabarcıklarının oluşumunu önleyebilirsiniz.NOT: Hücre yoğunluğu endotel fenotipini etkiler. Kanal 0,6 cm2yüzey alanına sahip olduğundan, kanal başına toplam 1,5 cm2 konfluent hücre aşırı konkordatodur. Deneye başlamadan önce, bu hücreleri kanallar içinde maksimum bir araya gelene kadar 6 gün daha kültürlendirin. 37 °C, %5 CO2’degece kuluçka için yeterli ortam sağlamak için kanala 50°L ek cECM ekleyin. Bağlı olmayan hücreleri temizlemek için ertesi gün ortamı değiştirin. PAEC’nin sağlam ve uyumlu bir monolayer oluşturmasıiçin hücreleri 37 °C, %5 CO2’de 6 gün boyunca kültürde tutun. 150 μL cECM ile her gün ortamı değiştirin. 7. günde, PAEC’e ECM’de 1 μM histamin 100 μL ve tramadan önce 30 dakika boyunca başka katkı maddesi içermeyen %1 FBS ile tedavi edin. Uyarıcı reklam libitumseçilebilir. Örneğin, TNF-α yaygın bir inflamatuar aktivatör olarak kullanılmıştır. Özel yapım mikroakışkan akış odalarının hazırlanmasıNOT: Boyutlar ve geometriler kolayca tercihe değiştirilebildiği için özel yapım akış odaları kullanıcının ihtiyaçlarına uyarlanır. Örneğin, fizyolojik olarak daha alakalı bir damarı taklit etmek için darlık ortaya çıkabilir (Şekil 1D). Bu yaklaşım mikrovasküler hastalıklarda görüldüğü gibi çok küçük kan hacimlerinin kullanılmasını sağlar. Desenli gofretler kullanılarak polidimetilsiloksane (PDMS) yumuşak litografisi PDMS kür ajan ve prepolimer bir mikrodenge üzerinde 1:10 oranında birleştirin ve iyice genel amaçlı laboratuvar karıştırıcı ile karıştırın. Ortaya çıkan hava kabarcıklarını gidermek için PDMS’yi yaklaşık 1 saat boyunca bir kurutucuda gazdan arındırın. Alüminyum folyo ile bir cam Petri çanak Hattı ve astarlı Petri çanak gofret yerleştirmeden önce su birkaç damlacıkekleyin. Gofret özel yapım kanal için kalıp olarak hizmet vermektedir.NOT: Gofret ler veya kalıplar temiz oda tesisleri tarafından sağlanmaktadır. Negatif fotodirenç, 300 μm genişlik x 270 μm yükseklik x 14 mm uzunluğunda, çıkıntılı kanal benzeri özellikler oluşturmak için gofretüzerine desenlenir. Gazdan arındırılmış PDMS’yi cam bir Petri kabına yerleştirilen gofreğin üzerine dökün. PDMS PDMS döküm sırasında oluşmuş olabilir herhangi bir kabarcıklar kaldırmak için ek bir 15 dakika için bir kurutucu üzerine döktü PdMS. Kalıp ve PDMS içeren Petri kabını kurutucudan çıkarın ve PDMS’yi çapraz bağlamak için en az 4 saat süreyle 60 °C’lik bir fırına yerleştirin. Cam slaytlara bağlanma için çapraz bağlı PDMS hazırlanması Kalıp ve çapraz bağlı PDMS’yi fırından çıkarın ve PDMS’nin tozsuz kullanımı için çapraz akış kaputuna geçin. Neşter kullanarak kalıbın altındaki TÜM PDM’leri çıkarın ve çapraz bağlı PDMS’nin üst levhasını kalıptan çıkarın. Herhangi bir toz partiküllerinin PDMS kanallarıyla temas etmesini önlemek için açıkta kalan desenli PDMS levhasını yapışkan bantla hizalayın. PdMS yongalarını biyopsi yumruğu kullanarak 1 mm çapında giriş ve çıkışlara küçültün ve delin. PDMS mikroakışkan kanalların ve cam kaydırakların sterilizasyonu ve yapıştırılması Temiz cam mikroskopi slaytlar iyice etanol ile durulayarak ardından bir izopropil alkol durulayın. Her durulama sonra, iyice bir azot tabancası ile slaytlar kuru.NOT: Alternatif olarak, analiz konfokal mikroskop kullanılarak yapılırsa kapak fişleri kullanılabilir. Plazma odasını açın ve temizlenmiş mikroskopi slaytlarını ve mikroakışkan yongaları koruyucu bant olmadan yükleyin. Odayı kapatın, 1 dakika azot ile temizleyin ve 500 mTorr basınç ulaşıncaya kadar odayı filtrelenmiş havaile doldurun. 50 W güç ve 5 kHz frekans kullanarak cam slaytları ve PDMS yongalarını 40 s için plazmaya maruz bırakın. Plazmaya maruz kaldıktan sonra, cam slaytları ve mikroakışkan yongaları hemen bağlayın. Cihazları steril Petri kaplarında saklayın. Mikroakışkan kanallarda endotel monokatlarının hücre tohumlanması 10 μL 0,1 mg/mL kollajen Tip I veya kanal başına %0,1 jelatin ve 30 dakika boyunca 37 °C’de kuluçkaya yatırArak özel yapım mikrokanalı katedin. Dört mikrokanal tohumlamak için, 25 cm2 confluent PAECs’yi deneyin ve RT’de 7 dk için 300 x g’da aşağı doğru döndürün.NOT: Hücrelerin sadece küçük bir yüzdesi yüzeye yapışır. Bu nedenle, bir confluent monolayer elde etmek için hücrelerin aşırı kullanmak gereklidir. 20 μL cECM’de PAEC’leri askıya alın ve her kanal için 5 μL hücre süspansiyonu kullanın. Küçük kanal boyutları nedeniyle, kılcal kuvvetler mikrokaydırayı dolduracak ve hava kabarcığı oluşumunu önleyecektir. Bağlanmamış hücreleri yıkamak için 3-4 saat sonra orta değiştirin. PAEC sağlam, enfluent monolayer oluşturmak için izin vermek için 6 gün boyunca kültür hücreleri tutun. Küçük hacimnedeniyle, her gün 150 μL cECM ile ortayı değiştirin. Pipet ucunu girişte orta ile doldurun ve priziçine boş bir uç koyun. Bu hücrelere yeterli besin ve büyüme faktörleri sağlayan bir rezervuar olarak hizmet edecek ve kurumasını slayt önlemek. 7. günde, Hoechst (cECM’de 1:5.000) ile canlı hücrelerdeki çekirdekleri lekele ve 37 °C’de maksimum 10 dakika kuluçkaya yatırın ve %5 CO2. 3x’i cECM ile dikkatlice yıkayın ve tondan önce 30 dakika boyunca ECM + %1 FBS’de 1 μM histamin ile tedavi edin. Uyarıcı reklam libitumseçilebilir. Örneğin, TNF-α yaygın bir inflamatuar aktivatör olarak kullanılmıştır. PDMS yongalarının çıkışını boruya bağlamak için 1,27 mm çapında 90° açılı paslanmaz çelik konektörler kullanın. 3. İnsan tam kan hazırlanması Deneklerden 0.109 M sodyum sitrat antikoagülan venöz kan çekin. Bu antikoagülasyon tedavisi almayan sağlıklı veya hastalıklı konulardaolabilir. Tüpleri yavaşça karıştırArak ters çevirin. Bir deney için gereken toplam kan miktarı esas olarak seçilen akış hızına bağlıdır. 25 mL/h akış hızı ile ibidi 6-iyi kaydıraklarda, küvetleri doldurmak için biraz fazla olan toplam 2 mL hacim ve akış kanalı yeterlidir. Kanı 50 mL’lik bir tüpe aktarın ve otolog fibrinojeni biraraya getirmek için calcein AM’i (1:10,000) floresan olarak kan hücrelerine ve Alexa488-fibrinojene (15 μg/mL) ekleyin. Tam emilimi sağlamak için kanın 37 °C’de 15 dk kuluçkaya yatmasını bekleyin. Deney başlamadan hemen önce rekalsifikasyon tamponu (154 mM sodyum klorür, 10,8 mM trisodyum sitrat, 2,5 mM kalsiyum klorür ve 2 mM magnezyum klorür) ile kanı 1:1 seyreltin.NOT: Maksimum olan hemodilasyon pıhtılaşma reaksiyon süresini etkilememiştir30. Ayrıca, insan kanı virüsler ve diğer ajanlar içerebilir. Kan örnekleri ile çalışma, bu nedenle, enfeksiyon riski taşır. Uygun güvenlik önlemlerinin kullanılması ve malzemenin özenle kullanılması önemle tavsiye edilir. 4. Akış sisteminin montajı Tüpü bağlamadan önce, tüpteki kanın pıhtılaşmasını önlemek için akış tüplerini yıkama tamponu (36 mM sitrik asit, 103 mM sodyum klorür, 5 mM potasyum klorür, 5 mM EDTA ve %0,35 wt/vol sığır serum albumini[BSA], pH = 6,5) ile durulayın. Akış tüplerini HEPES tamponu (132 mM sodyum klorür, 20 mM HEPES, 6 mM potasyum klorür, 1 mM magnezyum klorür, %1 BSA ve 5,5 mM D-glikoz, pH = 7,4) ile doldurmak için yeni bir şırınga kullanın ve orta ortamda EC ile doldurulmuş mikroslayta dirsek şeklindelu Luer konektörüyle dikkatlice bağlayın. Konektörleri mikrokanallara takarken, slaytta herhangi bir hava kabarcığı oluşmasını önlemeye çalışın. Kabarcıklar endotel zarar ve deney sonuçlarını etkileyecek. Yıkama tamponu tamamen kaldırın ve bu pıhtılaşmayı engelleyecek gibi tampon hücreleri ile temas izin vermeyin. Şekil 1E’degösterildiği gibi akış sistemini ayarlayın. 20 mL’lik bir şırıngada 2 mL yıkama tamponu alın ve kan şırınga girdiğinde pıhtılaşmayı önlemek için durula. Boş şırıngayı şırınga pompasına yerleştirin ve çıkış tüpünü dişi luer konektörüyle bu şırıngaya bağlayın. Giriş tüpünü hazırlanan insan kanını içeren bir kapta koyun. Şırınga pompasını açın ve akış hızını hesaplayın. Akış profilleri yükseklikte parabolik bir desen izler. Kanın Newton sıvısı gibi davrandığını varsayarsak, akış hızını hesaplamak için aşağıdaki formülü kullanın. (Denklem 1)Neredeτ = kesme gerilimi η = dinamik viskozite Q = hacimsel akış hızı h = kanal yüksekliği w = kanal genişliği NOT: 0.4 mm yüksekliğinde ve 3.5 mm genişliğe sahip dikdörtgen boyutlarda ticari 6 kanallı mikroslidelarda kanile pulmoner arteriyel akış için 5 dk için 25 mL/h hacimsel akış hızı kullanılmıştır. Özel yapım akış kanallarının boyutlarındaki farklılıklar nedeniyle, bu dinamikler de değişecektir. Kesme geriliminin eşit olduğundan emin olmak için değişkenleri ayarlayın. 20 mL şırınganın çapını 19,05 mm’ye tanımlayın ve programı Geri Çekmeolarak ayarlayın. Negatif basınç uygulaması ile hücre kaplı kanal üzerinden kan çekilmesi sabit kesme oranları ve hücre tabakası en az hasar garanti edecektir. 5. Görüntü edinimi için mikroskobun kurulması 20x’lik bir hedef kullanın ve mikro kaydırayı ters faz kontrastlı floresan mikroskobun aşamasına yerleştirin. Hücre monokatmanıodaklanmak için Z yönünde sahne taşımak için mikroskop yazılımı başlatın. Her akış kanalının başında, ortasında ve sonunda ilgi çeken bir bölge (YG) seçin. Başlangıç ve bitiş, kanalın giriş ve çıkışından en az 3 mm uzakta olmalıdır. Mavi, yeşil ve kırmızı floresan filtreleri lazer gücü ve ışık yoğunluğu ile ayarlayın. 6. PAECs üzerinde tam kan perfüzyonu Şekil 1E’deki gibi her şey bağlandıktan ve mikroskop kayda hazır olduktan sonra, bir video kaydetmek için Başlat’a bastırın. Endotel üzerinde kan perfüzyon şırınga pompası başlatın. En kısa sürede kan endotel üzerinden akan başlar, önceden seçilmiş aktif kanallar ve 5 dakika için her 15 s roI pozisyonları ile görüntüleri elde. Perfüzyon 5 dakika sonra, kayıt bitirmek ve şırınga pompası durdurmak. Akış odasını sökün ve boruyu çok dikkatli bir şekilde çıkarın. Genellikle, bu çok fazla güç ile yapılırsa bir hava kabarcığı oluşacaktır. Bunu önlemeye çalışın, çünkü bu endoteli temizler. 7. Fiksasyon ve post-analiz NOT: Perfüzyon deneyi nedeniyle endotel hasarı ile yanlış pozitif trombosit adezyonu dışlamak için, onların boşluk oluşumu ve monolayer için endotel hücreleri karakterize etmek gereklidir. Bu VE-kadherin için düzenli immünofloresan boyama ile yapılabilir. Perfüzyon ve tüpün söküldükten sonra mikroakışkan kanalı HEPES ile yıkayın. Pipet HEPES kanala böylece çıkış için kan itecek. Fazlalığı başka bir pipetle çıkarın. İsteğe bağlı olarak, protein süpernatant yağış önlemek için PBS++ (0,5 mM magnezyum klorür ve 0,9 mM kalsiyum klorür ile) ile kanal yıkayın. Bu arka planı azaltır. Ancak, ekstra bir yıkama adımı hücresel davranış ve post-analiz görüntüleme etkileyebilir morfolojisi değiştirebilirsiniz. HEPES’i çıkarın ve endotel’i bağlı trombositlerle düzeltin ve 37 °C’lik borular ile biriken fibrini kanala %4 paraformaldehit (PFA) ısıtın ve RT’de 15 dakika kuluçkaya yatırın.NOT: Bu kanallar daha da küçük olduğundan, özel yapım mikroakışkanları tamir ederken ekstra dikkatli olun, bu da her işleme adımında kanalda daha yüksek kesme kuvvetlerine neden olur. PfA’yı kanaldan çıkarın ve PBS ile 3kat yıkayın. Mikro slaytlar artık VE-kadherin, CD31, P-selectin veya integrins, yapışkan trombositler için CD42b veya lökositler için CD42b gibi endotel hücre belirteçlerini karakterize etmek için standart bir boyama protokolü için hazırdır. Boyama sonra, kolokalizasyon karakterize etmek için düzenli bir konfokal mikroskop ile en az beş görüntü almak. 8. Görüntü analizi ImageJ’de floresan etiketli trombositler veya floresan fibrin içeren bir akış teşpgörüntüsü açın. Tercih imajını ImageJ’e sürükleyin. Görüntü RGB renkte alınır. Analiz için, 8-bit görüntü tercih edilir, bu nedenle görüntüyü 8-bit’e dönüştürün: Resim | Türü | 8-bit. Arka planı en aza indirmek için, yuvarlanan bir topun orijinal görüntüden arka plan piksellerini yerel olarak hesapladığı ve çıkardığı sürgülü bir paraboloidle çıkar: İşlem | Arka Planı Çıkarma | Rolling Ball Yarıçapı = 50 piksel | Sürgülü Yamaç Paraşütü.NOT: Görüntü boyutu piksel olarak tanımlanır. Ancak, alanı ölçmek için, ölçeği ayarlamak gerekir. Görüntüler 0,45 sayısal diyafram açıklığı ile 20x hedefi ile alındığında, mikroskop μm başına 2 piksel bir ölçek vardır. Çoğu zaman ölçeği ayarlamak için gerekli bilgiler görüntünün meta verilerinde depolanır ve ImageJ: Analyze | Ölçek Ayarla. Bağlı trombositleri veya yatırılan fibrini tanımlamak için bir eşik ayarlayın. Üçgen yöntemini kullanın ve eşik otomatik olarak ayarlanır: Resim | Ayarla | Eşik. Trombosit veya fibrin in kapsadığı alanı Analiz Parçacıkları komutu ile analiz edin. Trombositin minimum boyutu 2 μm olduğu için boyutu 2-Infinity olarak ayarlayın: Analiz | Parçacıkları analiz edin. Sonuçlar, μm2’deki 2agregaların ortalama büyüklüğü ve kapsanan alanın yüzdesi ile 2’deki toplam alanı sağlayacaktır.

Representative Results

Temsili sonuçlar, her biri deneysel kurulum, veri toplama ve veri analizinin ilgili adımlarını temsil eden üç bölüme ayrılabilir. Araştırma sorusuna bağlı olarak, her adım için parametreler değiştirilebilir. Sunulan veriler endotel’in trombüs oluşumu üzerindeki etkisini incelemek için uygulanır. Deneysel KurulumBu endotel hücrelerinin yapısı ve işlevi son derece heterojen olduğu tespit edilmiştir, yere ve zamana bağlı olarak, sağlık ve hastalık sırasında23. Endotel hücrelerinin çeşitli kaynakları endotel-kan etkileşimini incelemek için kullanılabilir, bu durumda ticari olarak mevcut HUVECs ve PAECs(Şekil 1A). HUVECs en sık laboratuvar modellerinde kullanılan olmuştur, PAECs pulmoner arterlerden hasta kaynaklı izole hücreler iken. Ayrıca, mikrovasküler endotel hücreleri izole etmek için iyi kurulmuş protokoller vardır (MVEC) pulmoner dolaşım veya kan dolaşan endotel kolonisi oluşturan hücreler (ECFC)25,28,29. İzolasyondan sonra endotel hücreleri ENDotelfenotini doğrulamak için VE-kadherin, CD31 ve TIE2 boyama ile karakterize edildi. αSMA ve sitokatin varlığı için karakterizasyon fibroblast veya epitel benzeri fenotip inancını göstermiştir (Şekil 1B). ECs son derece saf bir popülasyon elde ettikten sonra, geçiş 3-5 hücreleri ya ticari bir mikroslayt veya özel yapılmış mikroakışkan akış kanalları tohum için kullanılmıştır(Şekil 1C). Ticari olarak mevcut mikroslaytlar öncelikle paralel akış odaları veya yükseklik veya çatallanma açısı nda özel olarak tanımlanmış parametrelere sahip Y şeklindekanallar olmakla birlikte, mikroakışkan slaytların kullanımı deneysel parametrelerin in vivo damar geometrisi ve kan akışı dinamiği31’euyarlanmasını mümkün kılar. Ancak, özel yapılmış mikroakışkan boyutları daha küçük ve hücre yayılmasını sınırlamak ve daha fazla hücre ölümü neden eğilimindedir32,33. Hücrelerin fazlalığı kullanarak hücrelerin sadece küçük bir yüzdesi yapışacak gerçeği telafi eder. Bu durum, endotel hücrelerinin paralel mikroakışkan kanala göre daha uzun bir fenotip gösterdiği bir darlık ortaya çıktığında gözlenmiştir(Şekil 1D). Ticari akış odaları hücrelerin bağlanabileceği daha büyük bir yüzey alanına sahiptir. Bu tohumlama için daha az hücre numaraları gerektirir. Endotel hücre-kan etkileşimini incelemek için, tam kan bir endotel monokat üzerinde perfüzyon oldu. Sitrated kan deney günü toplandı ve perfüzyon hemen önce rekalcified. Hücreler perfüzyon dan önce VWF salınımı ve trombosit yapışma30 dk indüklemek için histamin ile uyarılmış (Şekil 1E)34,35. Küçük boyutlar nedeniyle, özel yapım mikroakışkan kanallar daha küçük kan hacimlerinin kullanımına izin verdi. Veri toplamaPAECs trombüs oluşumunu araştırmak için, Calcein AM-Kırmızı floresan etiketli kan hücreleri ve Alexa488-konjuge fibrin 5 dakika için 2.5 dyne / cm2 (Şekil 2A–C) perfüzyon edildi. Yapışık kan hücreleri ve biriken fibrin sayısallaştırılmıştır. Görüntüler her 30’da bir elde edildi ve ImageJ ile ölçüldü. Yapışmaz trombositlerin otofloresansını ortadan kaldırmak için arka planı çıkarmak önemliydi. Eşik için üçgen algoritması en az arka planı tanımlamak için kullanılmıştır. Küçük trombosit agregalarının ölçümü için izin verilir (Şekil 2D). Beklenen, uyarılmayan koşullar altında, endotel trombosit ve fibrin hiçbir bağlama yoktu. VWF salınımı ve trombosit bağlanmasını teşvik etmek için, PAEC’ler histamin ile uyarıldı, bu da trombosit yapışmasının 2,5 dk sonra bir platoya ulaşmasında ani bir artışa yol açtı. Bu dönemde trombositler trombosit agregasyonu ve fibrinojen dekoltesini fibrin içine soğutan otokrin faktörleri salgılamaya başlamıştır. Fibrin 3 dk sonra yatırıldı ve 4 dk sonra trombositlerle istikrarlı bir agrega oluşturdu (Şekil 2E). Bu etkinin doğrudan oral antikoagülan (DOAC) tarafından inhibe edilip edilmeyeceğini araştırmak için kan 10 nM dabigatran ile tedavi edildi. Dabigatran pıhtılaşma yolunda Faktör IIa inhibe kan seyreltme eklendi, ve fibrinojen bölünmesi engelledi fibrin lifleri oluşturmak için. Dabigatran’da tedavi edilen kan uyarılmış PAEC’ler üzerinden perfüzyon yapıldığında, pıhtı oluşumu esas olarak fibrin birikimini geciktirerek doğrudan inhibe edilebilir(Şekil 2F). Veri analiziÇeşitli endotel kaynaklarının trombüs oluşumu üzerindeki etkisini incelemek için 5 dk kan perfüzyonu üzerindeki hücresel değişiklikler analiz edildi. Endotel sabitlendi ve konfokal mikroskop altında görüntülemeden önce yapışık trombositler CD42b ile etiketlendi. Bu, trombosit ve fibrinin kandaki işlevsiz pıhtılaşma faktörlerini gösterebilecek kolokalizasyonu için ayrıntılı bir analiz sağlamıştır. Pıhtı oluşumunda AT’nin etkisi standart immünofloresan boyama ile belirlendi. Endotel hücre hücresi kontakları, VE-kadherin boyama ile doğrulanarak, endotelsel boşluklar arasındaki altta yatan matris yerine endotel monotabakasının üstünde oluşan kan pıhtılarının olduğunu gösteren korunmuştur (Şekil 3). Ayrıca, farklı hücre kaynaklarının kullanımı endotel üzerinde oluşan trombosit farklı desenleri sonuçlandı. HUVECs venöz endotel hücreleri ve sınırlı trombosit adezyon ve fibrin birikimi gösterdi, CTEPH hastalarından hastalıklı primer PAEC sağlıklı PAEC göre histamin stimülasyonu üzerine bol trombosit adezyonu ve daha fibrin birikimi gösterdi. Bu, CTEPH hastalarının endotellerinin vazoaktivasyona daha yüksek yanıt verdiğini ve trombüs oluşumunun arttığını göstermektedir. Şekil 1: Protokolün şematik genel bakışı. (A) Çeşitli kaynaklar ve endotel hücrelerinin farklı türleri izole edildi ve perfüzyon deneyleri için mikroakışkan akış kanalında kullanılmak üzere kültürlendi. Endotel hücrelerinin farklı türde temsili brightfield görüntüleri. Ölçek çubuğu = 50 μm. (B) İzole hücreler endotelfenotini doğrulamak için immünoresan boyama ile karakterize edildi. Ölçek çubuğu = 50 μm. (C) Hücreler ticari akış slaytlarında veya özel olarak üretilen mikroakışkan kanalda tohumlanabilir. (D) Farklı kanal geometrilerinde yetiştirilen HUVEC’in temsili brightfield görüntüleri. Ölçek çubuğu = 50 μm. (E) Kan perfüzyon deneylerinin deneysel kurulumu. Sitrated kan toplandı, tuzlu tampon ile seyreltilmiş, ve bir şırınga pompası ile endotel hücreleri üzerinde perfüzyon. Bu rakamdaki akciğer ve göbek damarı Servier Medical Art’tan değiştirilmiştir, Creative Common Attribution 3.0 Generic License lisansı altında lisanslandı. http://smart.servier.com/ Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2: Trombüs oluşumunun görüntü edinimi ve niceliği. (A) Bağlı Calcein AM-Red etiketli trombositlerin temsili zaman atlamalı görüntülemeve 1, 3, ve 5 dk uyarılmamış PAECs üzerinde tam kan perfüzyonu sonra Alexa488-konjuge fibrin yatırılır (B) ve histamin uyarılmış PAECs üzerinde. (C) Trombosit adezyonu ve fibrin birikiminin 1, 3 ve 5 dk’da histamin uyarılmış PAEC’ler üzerinde dabigatran ile inkübe edilmiş tam kan la perfüzyonun zaman atlamalı görüntüleri. Ölçek çubuğu = 50 μm. (D) ImageJ’de görüntü nicelemi şematik genel bakışı. (E) Trombosit adezyonu ve fibrin birikiminin her 30 s’lik bir uyarılmamış ve histamin uyarılmış endotel üzerinde ölçülmesi. (F) Trombosit adezyonu ve fibrin birikimi ile ölçülen trombüs oluşumu üzerine dabigatran etkisinin ölçülmesi. Veriler ortalama ± SD, n = 3 olarak temsil edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: Trombosit adezyonunda trombüs oluşumunu ve endotel hücrelerinde fibrin birikimini karakterize eden akış deneylerinin temsili konfokal görüntüleri. Endotel hücre-hücre kontakları VE-kadherin ile karakterize edildi ve kontrol PAECs ölçüldü, hasta kaynaklı CTEPH PAECs, ve HUVEC. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Pıhtılaşma endotel ve kan bileşenleri arasındaki karmaşık ve zamansal kontrollü etkileşimin bir sonucudur. Bu in vitro tsay gerçek zamanlı olarak endotel hücrelerinin trombojenik özelliklerini araştırmak için bir yöntem sunar. Birincil insan endotel hücrelerinin çeşitli kullanılabilir, bir organ ve hastaya özgü bir şekilde situ tromboz kolaylaştırıcı. Bu çalışmada, sağlıklı donörlerden izole edilen PAEC’lerin trombojenik özelliklerini cteph hastalarına karşı karşılaştıran bu protokolün kullanımını gösterdik. Canlı trombüs oluşumu histamin aktive endotel üzerinde sağlıklı deneklerin tam kan perfüzyonu ile incelenmiştir, bir DOAC etkisi antitrombotik ajan olarak test edildi.

Temsili sonuçlarda gösterildiği gibi, ticari olarak kullanılabilen mikrokanalların kullanımının yanı sıra, özel yapım mikroakışkan kanalların piyasaya sürülmesi, vasküler geometri değişikliklerinin trombüs oluşumu üzerindeki etkisinin araştırılmasına olanak sağlamaktadır. Örneğin, bir dal noktasında akış azalır veya darlık kesme stresinde artışa ve daha fazla trombosit aktivasyonuna neden olur36. Ancak, bu özel yapılmış mikroakışkan kanalların önemli bir sınırlama adım 2.3.2 açıklandığı gibi EC’lerin istikrarlı bir monolayer oluşturmak için yüksek hücre numaraları gereksinimidir. Hasta kaynaklı hücreler az olduğunda bu sınırlayıcı bir faktör sunabilir. Ticari olarak kullanılabilen mikroslaytların güçlü yanları, yüzey alanlarının hücre kültürü için modifiye edilmiş olması ve büyüme alanlarının daha büyük olması ve böylece EC’lerin bir eşzamanlı ve kararlı monolayer oluşturmasına olanak sağlamasıdır. Öte yandan, daha büyük bir yüzey alanı daha büyük bir lümen neden olacaktır. Denklem 1’egöre, bu özel yapılmış mikroakışkanlar gibi benzer akış hızlarına ulaşmak için daha yüksek kan hacimleri gerektirir.

Bu protokolde yapılacak bir iyileştirme, canlı AT kaybını veya bariyer bütünlüğündeki değişiklikleri araştırmak olabilir. Bu protokoldeki EC hasarı sadece deneyin sonunda ölçülür. Canlı izleme için, ECs mCherry VE-cadherin ile etiketlenebilir, örneğin37. Ancak, bu verimli virüs transfeksiyonu ile son derece optimize edilmiş bir protokol gerekir gibi, Elektrik Hücre-substrat Empedans Algılama (ECIS) endotel bütünlüğü ve bariyer fonksiyonu çalışma alternatif olarak kullanılabilir38. Özel ECIS akış kanalları üzerinde perfüzyon akış altında endotel bariyer bütünlüğünün uzunlamasına izlenmesine olanak sağlar. Bu spesifik ECIS özellikleri endotel bariyer özelliklerinin paralel ölçümlerine ve trombüs oluşumuna olanak sağlar. Paralel EC bariyer ölçümleri için alternatif yollar, özellikle özel yapım dizilerde, AK bariyer özelliklerine bağlı olarak lümenden dışarı yayılan perfusatta floresan dekstrans kullanımı yer alır.

Açıklanan protokolün bir sınırlama, EC’ler insan vücudundan kaldırılır ve doku kültürü plastik kültürlü, sert, yapay substrat olmasıdır. Hücreler biyofiziksel ortamlarına uyum sağlarlar. Trombosit aktivasyonu ile duvar sertliği arasında bir ilişki olduğu için bu muhtemelen trombosit aktivasyonuna endotel yanıtını etkileyebilir39. Kültür plastiklerine yapılan bu adaptasyonlara rağmen hücreler, 5 dk kan perfüzyonundan sonra trombosit yapışması ve fibrin birikiminin farklı desenlerini uygulayan kontrol, CTEPH-PAEC ve HUVEC ile sağlıklı donörlerden elde edilen EC’lerle doğrudan karşılaştırıldığında tespit edilebilen hastalığa özgü özellikleri saklarlar.

Diğer protokollerin aksine, diğerleri trombosit ler ve lökositler19,,20,,21gibi tek bir kan bileşeni ile EC etkileşimi çalışma ise bu sistem tam kan kullanır. Yuvarlak damar geometrisi ve yumuşak hücre dışı matriks ile vasküler bir modelde endotel fonksiyonunun incelenmesine olanak sağlayan daha gelişmiş mikroakışkan modeller geliştirilmiştir. Ancak, bu HUVECs40,41,42ile optimize edilebiyir. Açıklanan protokolün yeniliği, in vivo durumlara bir adım daha yakın in situ tromboz modelleme getiren tam kan ile birlikte birincil ECs kullanımıdır. Hasta kaynaklı EC’lerin ve hasta kaynaklı kanın kullanımına yönelik protokolü optimize etmiş olması, kişiselleştirilmiş trombüs oluşumu ve ilaç tedavisinin değerlendirilmesini sağlayarak, hastalık modellemesini dahada optimize eder.

Açıklanan protokol, antikoagülasyon tedavilerinin hasta kaynaklı hücreler üzerindeki etkisini incelemek için uygulanabilir. Trombüs oluşumunu inhibe etmek için dabigatran kullanılırken, pıhtılaşma kaskadlarında faktör Xa’yı doğrudan inhibe eden rivaroxaban gibi diğer antikoagülanları kullanmak mümkündür. Klopidogrel veya aspirin gibi doğrudan trombosit inhibitörleri de incelenebilir, trombositlerin EC’lere bağlandığı hemostazın birincil fazında bu hareket ler gibi. Sonuç olarak, hastanın kendi kanı ile etkileşim de hastaya özgü EC’lerin trombojenik kapasiteleri bireysel hasta üzerinde antikoagülasyon tedavisinin kişisel etkisini tahmin etmek için kullanılabilir. Ayrıca, belirli proteinlerin bir nakavt ek fonksiyonel bilgi sağlayabilir.

Açıklanan protokolde başarılı bir perfüzyon denemesi için kritik olan bazı adımlar vardır. İlk olarak, birincil hücrelerin izolasyonu sırasında, son derece saf bir EC kültürü elde etmek gereklidir. İkinci olarak, EC’lerin kararlı bir eşzamanlı monolayer oluşturması önemlidir. Bu durumda, kesme stresinde hafif bir değişiklik endotel hasarına ve pıhtılaşma kaskad aktivasyonuna neden olabilir, ya da trombositler yanlış pozitif sonuçlar sağlayacak bodrum membran, bağlama başlayabilirsiniz. Üçüncü olarak, bu endotel zarar verebilir ve bu nedenle sonuçları etkileyebilir gibi, hava kabarcıkları önlemek için esastır.

Kalsiyum klorür ve magnezyum klorür ile sitrated kan rekalsifikasyon sonra, hemen perfüzyon deneyi başlamak önemlidir. Rekalsifikasyon trombosit aktivasyonu ve trombüs oluşumunda hızlı bir tepkiye neden olur ve numunede hızlı pıhtılaşmaya neden olur.

Sonuç olarak, tromboz sırasında tam kan endotel hücre etkileşimlerini incelemek için çok yönlü bir protokol açıklıyoruz.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Plazma Proteinleri Bölümü, Sanquin Araştırma ve Landsteiner Laboratuvarı, Amsterdam UMC, Akademik Tıp Merkezi, Amsterdam, Hollanda’dan Jan Voorberg’e bu el yazmasına yaptığı katkılardan dolayı teşekkür ederiz. Bu çalışma Hollanda KardiyoVasküler İttifakı (DCVA) [2012-08, 2014-11] tarafından Phaedra ve Reconnect konsorsiyumuna verilen desteğin yanı sıra Phaedra IMPACT konsorsiyumuna verilen Impulse hibe 2018 tarafından da desteklenmiştir. Bu hibeler arasında Hollanda Kalp Vakfı, Hollanda Üniversite Tıp Merkezleri Federasyonu, Hollanda Sağlık Araştırma ve Geliştirme Örgütü ve Hollanda Kraliyet Bilimler Akademisi tarafından toplu finansman bulunmaktadır. Ayrıca, bu çalışma Avrupa Araştırma Konseyi tarafından Advanced Grant ‘VESCEL’ programı kapsamında finanse edilmiştir (Hibe numarası: 669768). XDM, Hollanda’nın Amsterdam’daki VU Üniversitesi Tıp Merkezi’nde KardiyoVasküler Araştırma Enstitüsü’nün (ICaR-VU) araştırma bursu ile finanse edilmektedir.

Materials

20 mL syringe BD Plastipak 300613
20X objective Olympus
2-Propanol (IPA) Boom 76051455 . 5000
Aladdin Syringe Pump Word Precision Instruments AL-4000
Alexa488-Fibrinogen Invitrogen F13191 15 ug/mL
Alexa647 Goat anti Rabbit Invitrogen A21245 0.180555556
Biopsy punch 1 mm diameter, Integra Miltex Ted Pella 15110-10
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Aldrich A9647
CaCl2 Sigma Aldrich 21115
Calcein AM-Red Invitrogen C3099 1:1000
CD42b-APC Miltenyi Biotec 130-100-208 1:100
Citric Acid Merck 244
Collagen Typ I Corning 354249 0,1 mg/mL
Corning CellBIND Surface 60 mm Culture Dish Corning 3295
Cross-flow hood Basan
Desiccator Duran 24 782 69
D-Glucose Merck 14431-43-7
EDTA Invitrogen 15575-038
Endothelial Cell Medium (ECM) ScienCell 1001
Fibronectin Sigma Aldrich F0895
Flow tubings ibidi 10831, 10841
Gelatin Merck 104070 0.1%
HEPES Sigma Aldrich H4034
Hoechst 33342 Invitrogen H1399 1:1000
ibidi µ-Slide VI 0.4 flow chambers ibidi 80606
ImageJ ImageJ v1.49
KCl Merck 7447-40-7
Lab oven Quincy 10GC
LS720 Fluorescent microscope etaluma LS720
Luer connector ibidi 10802, 10825 Male elbow connectors, and Female tube connectors
MACS magnetic beads (anti-CD144) Miltenyi Biotec 130-097-857 1:5
MgCl2 Sigma Aldrich M1028
Microscopy slides, 76 x 26 mm Thermo Scientific AAAA000001##12E
Negative photoresist, SU-8 Microchem
Non-Essential Amino Acids (NEAA) Lonza 13-114E
Paraformaldehyde (PFA) Merck 818715 4% PFA in PBS
Penicillin/streptomycin (P/S) Gibco 15140-122 1%
Phosphate Buffered Saline (PBS) Gibco 14190-094
Plasma chamber, CUTE Femto Science
Polydimethylsiloxane (PDMS), Sylgard 184 Dow 101697
sodium citrate blood collection tubes BD Vacutainer 363048
trisodium citrate Merck 6448
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Gibco 25300-045
VE-Cadherin (D87F2)-XP Cell Signaling 2500 1:300
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yau, J. W., Teoh, H., Verma, S. Endothelial cell control of thrombosis. BMC Cardiovascular Disorders. 15, 130 (2015).
  2. Pearson, J. D. Endothelial cell function and thrombosis. Best Practice & Research: Clinical Haematology. 12 (3), 329-341 (1999).
  3. Bochenek, M. L., Schafer, K. Role of Endothelial Cells in Acute and Chronic Thrombosis. Hamostaseologie. 39 (2), 128-139 (2019).
  4. Swieringa, F., et al. Platelet Control of Fibrin Distribution and Microelasticity in Thrombus Formation Under Flow. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 36 (4), 692-699 (2016).
  5. Macfarlane, R. G. An Enzyme Cascade in the Blood Clotting Mechanism, and Its Function as a Biochemical Amplifier. Nature. 202, 498-499 (1964).
  6. Versteeg, H. H., Heemskerk, J. W., Levi, M., Reitsma, P. H. New fundamentals in hemostasis. Physiological Reviews. 93 (1), 327-358 (2013).
  7. Opneja, A., Kapoor, S., Stavrou, E. X. Contribution of platelets, the coagulation and fibrinolytic systems to cutaneous wound healing. Thrombosis Research. 179, 56-63 (2019).
  8. Tabas, I., Garcia-Cardena, G., Owens, G. K. Recent insights into the cellular biology of atherosclerosis. Journal of Cell Biology. 209 (1), 13-22 (2015).
  9. Karino, T., Motomiya, M. Flow through a venous valve and its implication for thrombus formation. Thrombosis Research. 36 (3), 245-257 (1984).
  10. ISTH Steering Committee for World Thrombosis Day. Thrombosis: a major contributor to global disease burden. Thrombosis Research. 134 (5), 931-938 (2014).
  11. Witkin, A. S. Acute and chronic pulmonary embolism: the role of the pulmonary embolism response team. Current Opinion in Cardiology. 32 (6), 672-678 (2017).
  12. Kim, N. H., et al. Chronic thromboembolic pulmonary hypertension. European Respiratory Journal. 53 (1), 1801915 (2019).
  13. Zhang, M., Zhang, Y., Pang, W., Zhai, Z., Wang, C. Circulating biomarkers in chronic thromboembolic pulmonary hypertension. Pulmonary Circulation. 9 (2), 2045894019844480 (2019).
  14. Giri, J., et al. Interventional Therapies for Acute Pulmonary Embolism: Current Status and Principles for the Development of Novel Evidence: A Scientific Statement From the American Heart Association. Circulation. 140 (20), 774-801 (2019).
  15. Sharma, S., Lang, I. M. Current understanding of the pathophysiology of chronic thromboembolic pulmonary hypertension. Thrombosis Research. 164, 136-144 (2018).
  16. Eisenberg, P. R., et al. Fibrinopeptide A levels indicative of pulmonary vascular thrombosis in patients with primary pulmonary hypertension. Circulation. 82 (3), 841-847 (1990).
  17. Bochenek, M. L., et al. From thrombosis to fibrosis in chronic thromboembolic pulmonary hypertension. Thrombosis and Haemostasis. 117 (4), 769-783 (2017).
  18. Nagy, M., Heemskerk, J. W. M., Swieringa, F. Use of microfluidics to assess the platelet-based control of coagulation. Platelets. 28 (5), 441-448 (2017).
  19. Barendrecht, A. D., et al. Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow. Journal of Visualized Experiments. (125), e55658 (2017).
  20. Vajen, T., et al. Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets. Journal of Visualized Experiments. (134), e57009 (2018).
  21. Michels, A., Swystun, L. L., Mewburn, J., Albanez, S., Lillicrap, D. Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation. Journal of Visualized Experiments. (126), e55917 (2017).
  22. Smeets, M. W. J., Mourik, M. J., Niessen, H. W. M., Hordijk, P. L. Stasis Promotes Erythrocyte Adhesion to von Willebrand Factor. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (9), 1618-1627 (2017).
  23. Aird, W. C. Endothelial cell heterogeneity. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (1), 006429 (2012).
  24. Aitsebaomo, J., Portbury, A. L., Schisler, J. C., Patterson, C. Brothers and sisters: molecular insights into arterial-venous heterogeneity. Circulation Research. 103 (9), 929-939 (2008).
  25. Szulcek, R., et al. Delayed Microvascular Shear Adaptation in Pulmonary Arterial Hypertension. Role of Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule-1 Cleavage. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 193 (12), 1410-1420 (2016).
  26. Casa, L. D., Deaton, D. H., Ku, D. N. Role of high shear rate in thrombosis. Journal of Vascular Surgery. 61 (4), 1068-1080 (2015).
  27. Jain, A., et al. Assessment of whole blood thrombosis in a microfluidic device lined by fixed human endothelium. Biomedical Microdevices. 18 (4), 73 (2016).
  28. van Nieuw Amerongen, G. P., Draijer, R., Vermeer, M. A., van Hinsbergh, V. W. Transient and prolonged increase in endothelial permeability induced by histamine and thrombin: role of protein kinases, calcium, and RhoA. Circulation Research. 83 (11), 1115-1123 (1998).
  29. Smits, J., et al. Blood Outgrowth and Proliferation of Endothelial Colony Forming Cells are Related to Markers of Disease Severity in Patients with Pulmonary Arterial Hypertension. International Journal of Molecular Sciences. 19 (12), 3763 (2018).
  30. Tobias, M. D., Wambold, D., Pilla, M. A., Greer, F. Differential effects of serial hemodilution with hydroxyethyl starch, albumin, and 0.9% saline on whole blood coagulation. Journal of Clinical Anesthesia. 10 (5), 366-371 (1998).
  31. Jain, A., et al. Primary Human Lung Alveolus-on-a-chip Model of Intravascular Thrombosis for Assessment of Therapeutics. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 103 (2), 332-340 (2018).
  32. Veiseh, M., Veiseh, O., Martin, M. C., Asphahani, F., Zhang, M. Short peptides enhance single cell adhesion and viability on microarrays. Langmuir-ACS. 23 (8), 4472-4479 (2007).
  33. Kuo, C. W., Chueh, D. Y., Chen, P. Investigation of size-dependent cell adhesion on nanostructured interfaces. Journal of Nanobiotechnology. 12, 54 (2014).
  34. McCormack, J. J., Lopes da Silva, M., Ferraro, F., Patella, F., Cutler, D. F. Weibel-Palade bodies at a glance. Journal of Cell Science. 130 (21), 3611-3617 (2017).
  35. Guilarte, M., Sala-Cunill, A., Luengo, O., Labrador-Horrillo, M., Cardona, V. The Mast Cell, Contact, and Coagulation System Connection in Anaphylaxis. Frontiers in Immunology. 8, 846 (2017).
  36. Westein, E., et al. Atherosclerotic geometries exacerbate pathological thrombus formation poststenosis in a von Willebrand factor-dependent manner. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (4), 1357-1362 (2013).
  37. Huveneers, S., et al. Vinculin associates with endothelial VE-cadherin junctions to control force-dependent remodeling. Journal of Cell Biology. 196 (5), 641-652 (2012).
  38. Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. Journal of Visualized Experiments. (85), e51300 (2014).
  39. Yamasaki, F., et al. Association between arterial stiffness and platelet activation. Journal of Human Hypertension. 19 (7), 527-533 (2005).
  40. Tsai, M., et al. In vitro modeling of the microvascular occlusion and thrombosis that occur in hematologic diseases using microfluidic technology. Journal of Clinical Investigation. 122 (1), 408-418 (2012).
  41. Zheng, Y., et al. In vitro microvessels for the study of angiogenesis and thrombosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (24), 9342-9347 (2012).
  42. Myers, D. R., et al. Endothelialized microfluidics for studying microvascular interactions in hematologic diseases. Journal of Visualized Experiments. (64), e3958 (2012).

Tags

In VitroMicrofluidicDisease ModelWhole BloodEndothelialBlood ClotThrombogenicityAnticoagulantInflammatoryPersonalized MedicinePulmonary ArteryFibroronectinEndothelial CellCD144Flow CytometryFlow ChamberGelatin

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Manz, X. D., Albers, H. J., Symersky, P., Aman, J., van der Meer, A. D., Bogaard, H. J., Szulcek, R. In Vitro Microfluidic Disease Model to Study Whole Blood-Endothelial Interactions and Blood Clot Dynamics in Real-Time. J. Vis. Exp. (159), e61068, doi:10.3791/61068 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image