In Vitro Microfluidic Disease Model to Study Whole Blood-Endothelial Interactions and Blood Clot Dynamics in Real-Time

Este estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Ética Médica institucional del VU Medical Center Amsterdam, Países Bajos (METC VUmc, NL69167.029.19). El aislamiento de células primarias y la recolección de sangre de los seres humanos se realizaron después de obtener el consentimiento informado por escrito de conformidad con la Declaración de Helsinki. 1. Aislamiento y cultivo de células endoteliales arteriales pulmonares humanas primarias (PAEC) Medio de células endoteliales completas calientes (CECM) complementado con 5% de suero bovino fetal (FBS), 1% de penicilina/estreptomicina (P/S), 1% suplementos de crecimiento de células endoteliales (ECGS), y 1% aminoácidos no esenciales (NEAA), en un baño de agua a 37 oC. Esterilice las tijeras quirúrgicas, los fórceps y un bisturí con un esterilizador térmico de 120 oC o un 70% de etanol. Realice el aislamiento de PAEC en un armario de flujo laminar en condiciones estériles. Recubrir un plato de cultivo celular de 60 mm de unión de células de alta afinidad (ver Tabla de Materiales)con 2 ml de fibronectina de 5 g/ml e incubar a 37oC durante al menos 15 min. Obtener tejido de la arteria pulmonar (PA) de la cirugía(p. ej.,lobectomía o endarterectomía pulmonar), almacenar en un tampón de cordón frío de 4 oC (cloruro de potasio de 4 mM, cloruro de sodio de 140 mM, HEPES de 11 mM, 11 mM de D-glucosa y 1% P/S, pH a 7,3), y mantener el hielo hasta el aislamiento. Aísle las células endoteliales del PA dentro de las 2 h después de la extracción del tejido. Tome el PA con fórceps y colócalo en un plato de Petri de 10 cm para lavar con PBS. Si el PA sigue siendo un anillo, corte la arteria pulmonar con tijeras. Tenga mucho cuidado de no tocar la capa más interna del recipiente con las herramientas, ya que el endotelio se daña y/o retira fácilmente. Retire la fibronectina de la placa de cultivo celular y agregue 4 ml de cECM medio. Tome el tejido PA con fórceps y colóquelo en el medio. Mientras tanto, raspa cuidadosamente la capa interna del recipiente en el medio con un bisturí. A menudo, las acumulaciones de lípidos se pueden ver en la pared del vaso. Trate de omitir estos, ya que afectarán el crecimiento de la célula. Mantenga las células en cultivo hasta que comiencen a aparecer pequeñas colonias de células endoteliales. Reemplace el medio cada dos días. Si los fibroblastos contaminan el cultivo, purifique con separación de células de afinidad magnética para CD144 con un kit, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (ver Tabla de Materiales). Utilice el método de dos columnas para la purificación inicial y el método de una columna para cada purificación consecutiva. Generalmente, un cultivo se define puro cuando la citometría de flujo detecta ≤10% de las células contaminantes. Dividir las células en proporciones de 1:3 a 1:4 hasta que se cultivan suficientes PAEC para uso experimental. Cuando los PAEC estén listos para usar, continúe con el siguiente paso. Después de la purificación, las células endoteliales primarias deben caracterizarse por la presencia de marcadores específicos de la CE(por ejemplo,VE-cadherina, CD31, TIE2) y por la ausencia de células musculares lisas (α-SMA), marcadores de fibroblastos (vimentina) y epiteliales (citoqueratina)(Figura 1B). 2. Preparación de cámaras de flujo y monocapas PAEC NOTA: Dependiendo de la hipótesis, utilice las cámaras de flujo disponibles comercialmente (véase Tabla de materiales y Figura 1C Opción A, paso 2.1 del protocolo) o una cámara de flujo microfluídica a medida(Figura 1C Opción B, paso 2.2 del protocolo). Siembra celular de monocapas endoteliales en microdeslizos disponibles comercialmenteNOTA: Las cámaras de flujo disponibles comercialmente son fáciles de usar y proporcionan un patrón de flujo laminar en todo el canal que se puede utilizar a altas velocidades de cizallamiento. Estos microdeslizos están diseñados para permitir corridas paralelas multicanal y proporcionar un perfil de flujo preciso y reproducible. Debido a que están optimizados para la microscopía invertida, es posible capturar imágenes fluorescentes de alta calidad. Además, varias dimensiones de las cámaras de flujo están disponibles en diferentes tamaños de canal o geometrías. Los canales de flujo de 6 pozos son preferidos para este ensayo porque estos microdeslizos tienen pequeñas dimensiones y permiten corridas multiparéla. Para recubrir un canal de un portaobjetos de flujo de 6 pocilnos (3,5 mm de ancho x 0,4 mm de altura x 17 mm de longitud) utilice 30 ml de gelatina de 0,1% por canal e incubar a 37 oC durante al menos 15 min. Para sembrar un canal, tripsize 10 cm2 de PAC confluentes y gire hacia abajo a 300 x g durante 7 min a temperatura ambiente (RT). Suspenda los PAEC en 600 l de cECM y la pipeta 100 l (1,5 cm2 ) de la suspensión celular en un canal. Esto cubre el microdeslizador a través de la acción capilar. Si va demasiado lento, se formarán burbujas de aire. Evite la formación de burbujas de aire mediante el uso de un poco más de fuerza al pipetear.NOTA: La densidad celular influye en el fenotipo endotelial. Un total de 1,5 cm2 de células confluentes por canal es sobreconfluente, porque el canal tiene una superficie de 0,6 cm2. Antes de iniciar el experimento, haga cultivo de estas células durante otros 6 días dentro de los canales hasta que alcancen la confluencia máxima. Añadir 50 l adicionales de cECM al canal para proporcionar un medio suficiente para la incubación durante la noche a 37 oC, 5% de CO2. Cambie el medio al día siguiente para lavar las células no enlazadas. Mantener las células en cultivo durante 6 días a 37 oC, 5% de CO2 para permitir que el PAEC forme una monocapa firme y confluente. Cambie el medio cada dos días con 150 ml de cECM. En el día 7, tratar el PAEC con 100 ml de histamina de 1 m en ECM y 1% FBS sin ningún otro aditivo durante 30 minutos antes del ensayo. El estímulo se puede elegir ad libitum. Por ejemplo, TNF-α se ha utilizado comúnmente como un activador inflamatorio. Preparación de cámaras de flujo microfluídicas hechas a medidaNOTA: Las cámaras de flujo personalizadas se adaptan a las necesidades del usuario porque las dimensiones y geometrías se pueden cambiar fácilmente a la preferencia. Por ejemplo, para imitar un recipiente más relevante fisiológicamente, se puede introducir una estenosis(Figura 1D). Este enfoque permite el uso de volúmenes sanguíneos muy pequeños como se ve en la enfermedad microvascular. Litografía suave de polidimetilsiloxano (PDMS) utilizando obleas con patrón Combine el agente de curado y el prepolímero de PDMS en un microbalance con una proporción de 1:10 y mezcle a fondo con un mezclador de laboratorio de uso general. Para eliminar las burbujas de aire resultantes, desgaste el PDMS en un desecador durante aproximadamente 1 h. Forrar un plato de petri de vidrio con papel de aluminio y añadir unas gotas de agua antes de colocar la oblea en el plato de Petri forrado. La oblea sirve como molde para el canal hecho a medida.NOTA: Las obleas o moldes son proporcionados por las instalaciones de la sala limpia. El fotorresistir negativo se modela sobre obleas para crear operaciones similares a canales salientes con las siguientes dimensiones típicas: 300 m de ancho x 270 m de altura x 14 mm de longitud. Vierta los PDMS desgasificación en la oblea colocada en un plato de Petri de vidrio. Degas el PDMS vertió sobre la oblea en un desecador durante 15 minutos adicionales para eliminar cualquier burbuja que pudiera haberse formado durante la fundición. Retire el plato de Petri que contiene el molde y PDMS del desecador y colóquelo en un horno de 60 oC durante un mínimo de 4 horas para cruzar el PDMS. Preparación de PDMS reticulados para la unión a diapositivas de vidrio Retire el molde y los PDMS reticulados del horno y muévase a una campana de flujo cruzado para un manejo sin polvo del PDMS. Elimine cualquier PDMS de la parte inferior del molde utilizando un bisturí y elimine la losa superior de los PDMS reticulados del molde. Alinee la losa PDMS con patrón expuesto con cinta adhesiva para evitar que las partículas de polvo entren en contacto con los canales PDMS. Corte los chips PDMS a tamaño y golpee entradas y salidas de 1 mm de diámetro mediante un punzón de biopsia. Esterilización y unión de canales microfluídicos PDMS y diapositivas de vidrio Limpie los portaobjetos de microscopía de vidrio enjuagando completamente con etanol seguido de un enjuague con alcohol isopropílico. Después de cada enjuague, seque bien los portaobjetos con una pistola de nitrógeno.NOTA: Alternativamente, se pueden utilizar resbalones de cubierta si el análisis se realiza con un microscopio confocal. Abra la cámara de plasma y cargue los portaobjetos de microscopía limpiados y los chips microfluídicos sin la cinta protectora. Cierre la cámara, purgue con nitrógeno durante 1 min y llene la cámara con aire filtrado hasta que se alcance una presión de 500 mTorr. Exponga los portaobjetos de vidrio y los chips PDMS al plasma durante 40 s utilizando una potencia de 50 W y una frecuencia de 5 kHz. Después de la exposición al plasma, unir inmediatamente los portaobjetos de vidrio y las virutas microfluídicas. Guarde los dispositivos en platos estériles de Petri. Siembra celular de monocapas endoteliales en canales microfluídicos Recubrir el microcanal a medida pipeteando 10 ml de colágeno de 0,1 mg/ml Tipo I o 0,1% de gelatina por canal e incubar a 37oC durante 30 min. Para sembrar cuatro microcanales, tripsinlice 25 cm2 de PAEC confluentes y gire hacia abajo a 300 x g durante 7 min en RT.NOTA: Solo un pequeño porcentaje de células se adhiere a la superficie. Por lo tanto, es necesario utilizar un exceso de células para lograr una monocapa confluente. Suspenda los PAEC en 20 ml de cECM y utilice 5 ml de suspensión celular para cada canal. Debido a las pequeñas dimensiones del canal, las fuerzas capilares llenarán el microdeslizo y evitarán la formación de burbujas de aire. Cambie el medio después de 3-4 h para lavar las células no enlazadas. Mantener las células en cultivo durante 6 días para permitir que el PAEC forme una monocapa firme y confluente. Debido al pequeño volumen, cambie el medio todos los días con 150 l de cECM. Deje la punta de la pipeta llena de medio en la entrada y coloque una punta vacía en la salida. Esto servirá como un reservorio que proporciona suficientes nutrientes y factores de crecimiento a las células y evitar que el deslizamiento se seque. El día 7, manchar los núcleos en las células vivas con Hoechst (1:5.000 en cECM) e incubar durante un máximo de 10 min a 37oC y 5% de CO2. Lavar cuidadosamente 3x con cECM y tratar con 1 m de histamina en ECM + 1% FBS durante 30 minutos antes del ensayo. El estímulo se puede elegir ad libitum. Por ejemplo, TNF-α se ha utilizado comúnmente como un activador inflamatorio. Utilice conectores de acero inoxidable en ángulo de 1,27 mm de diámetro y 90o para conectar la salida de los chips PDMS al tubo. 3. Preparación de sangre entera humana Extraiga sangre venosa de sujetos en un anticoagulante de citrato sódico de 0,109 M. Esto puede ser de sujetos sanos o enfermos que no reciben tratamiento de anticoagulación. Invierta suavemente los tubos para mezclar. La cantidad total de sangre necesaria para un experimento depende principalmente del caudal seleccionado. Con un caudal de 25 ml/h, en diapositivas ibidi de 6 pozos, un volumen total de 2 ml con un poco de exceso para llenar las tinas y el canal de flujo es suficiente. Transfiera la sangre a un tubo de 50 ml y añada Calcein AM (1:10.000) para etiquetar fluorescentemente las células sanguíneas y Alexa488-fibrinógeno (15 g/ml) para conjugar fibrinógeno autólogo. Dejar incubar la sangre a 37oC durante 15 min para permitir una absorción completa. Diluir la sangre 1:1 con tampón de recalcificación (154 mM de cloruro sódico, citrato de trisódico de 10,8 mM, cloruro de calcio de 2,5 mM y cloruro de magnesio de 2 mM) inmediatamente antes del inicio del experimento.NOTA: La hemodilución con un máximo del 50% no influyó en el tiempo de reacción de la coagulación30. Además, la sangre humana puede contener virus y otros agentes. Por lo tanto, trabajar con muestras de sangre conlleva un riesgo de infección. Se recomienda utilizar las medidas de seguridad adecuadas y manipular el material con cuidado. 4. Montaje del sistema de flujo Antes de conectar el tubo, enjuague los tubos de flujo con una jeringa de 20 ml llena de tampón de lavado (ácido cítrico de 36 mM, cloruro de sodio de 103 mM, cloruro de potasio de 5 mM, EDTA de 5 mM y albúmina sérica bovina de 0,35% wt/vol [BSA], pH a 6,5) para evitar la coagulación de la sangre en los tubos. Utilice una jeringa nueva para llenar los tubos de flujo con tampón HEPES (132 mM de cloruro sódico, 20 mM HEPES, cloruro de potasio de 6 mM, cloruro de magnesio de 1 mM, 1% de BSA y 5,5 mM D-glucosa, pH a 7,4) y conéctelo cuidadosamente con un conector Luer en forma de codo al microdeslizador lleno de EC en medio. Al conectar los conectores a los microcanales, intente evitar la formación de burbujas de aire en la diapositiva. Las burbujas dañarán el endotelio e influirán en los resultados del experimento. Retire el tampón de lavado por completo y no deje que el tampón entre en contacto con las células, ya que esto inhibirá la coagulación. Configure el sistema de flujo como se muestra en la figura 1E. Tome 2 ml de tampón de lavado en una jeringa de 20 ml y enjuague para evitar la coagulación cuando la sangre entre en la jeringa. Inserte la jeringa vacía en la bomba de la jeringa y conecte el tubo de salida con un conector Luer hembra a esta jeringa. Coloque el tubo de entrada en un recipiente que contenga la sangre humana preparada. Encienda la bomba de la jeringa y calcule el caudal. Los perfiles de flujo siguen un patrón parabólico en altura. Suponiendo que la sangre actúa como un fluido newtoniano, utilice la siguiente fórmula para calcular el caudal. (Ecuación 1)Dónde• Estrés de cizallamiento η – viscosidad dinámica Q – caudal volumétrico h – Altura del canal w – Anchura del canal NOTA: Para el flujo arterial pulmonar con sangre en los microdeslizos comerciales de 6 canales con dimensiones rectangulares con 0,4 mm de altura y 3,5 mm de ancho, se utilizó un caudal volumétrico de 25 ml/h durante 5 min. Debido a las diferencias en las dimensiones de los canales de flujo personalizados, estas dinámicas también cambiarán. Ajuste las variables para asegurarse de que la tensión de cizallamiento es igual. Defina el diámetro de la jeringa de 20 ml en 19,05 mm y ajuste el programa a Retirar. Tirar de la sangre a través del canal recubierto de células mediante la aplicación de una presión negativa garantizará tasas de cizallamiento constantes y un daño mínimo a la capa celular. 5. Configuración del microscopio para la adquisición de imágenes Utilice un objetivo de 20x y coloque el microdeslizador en el escenario del microscopio fluorescente de contraste de fase invertido. Inicie el software del microscopio para mover el escenario en la dirección Z para centrarse en la monocapa celular. Seleccione una región de interés (ROI) al principio, al medio y al final de cada canal de flujo. El principio y el final deben estar al menos a 3 mm de distancia de la entrada y salida del canal. Ajuste los filtros fluorescentes azul, verde y rojo con una potencia láser e intensidad de luz que muestre un fondo mínimo. 6. Perfusión de sangre entera sobre los PAEC Después de que todo esté conectado como en la Figura 1E y el microscopio esté listo para la grabación, presione Iniciar para grabar un video. Empuje Iniciar en la bomba de la jeringa para perfunde la sangre sobre el endotelio. Tan pronto como la sangre comience a fluir sobre el endotelio, adquiera imágenes con los canales activos preseleccionados y posiciones de ROI cada 15 s durante 5 minutos. Después de 5 minutos de perfusión, termine de grabar y detenga la bomba de la jeringa. Desmontar la cámara de flujo y retirar con mucho cuidado el tubo. A menudo, se formará una burbuja de aire si esto se hace con demasiada fuerza. Trate de prevenir esto, porque esto eliminará el endotelio. 7. Fijación y postanálisis NOTA: Para excluir la falsa adhesión plaquetaria positiva por daño endotelial debido al experimento de perfusión, es necesario caracterizar las células endoteliales para su formación de huecos y monocapa. Esto se puede hacer mediante la tinción regular de inmunofluorescencia para la cadherina VE. Después de la perfusión y el desmontaje del tubo, lave el canal microfluídico con HEPES. Pipeta HEPES en el canal para que empuje la sangre a la salida. Retire el exceso con otra pipeta. Opcionalmente, lave el canal con PBS++ (con cloruro de magnesio de 0,5 mM y cloruro de calcio de 0,9 mM) para evitar la precipitación de sobrenadante de proteínas. Esto reduce el fondo. Sin embargo, un paso de lavado adicional puede cambiar el comportamiento celular y la morfología que podrían influir en la toma de imágenes posteriores al análisis. Retire el HEPES y fije el endotelio con plaquetas adheridas y la fibrina depositada pipeteando 37 oC calentado 4% de paraformaldehído (PFA) en el canal e incubar durante 15 minutos en RT.NOTA: Tenga mucho cuidado al fijar los microfluidos hechos a medida, ya que estos canales son aún más pequeños, lo que provoca mayores fuerzas de cizallamiento en el canal durante cada paso de manipulación. Retire el PFA del canal y lávelo 3x con PBS. Los microdeslizos ya están listos para un protocolo de tinción estándar para caracterizar los marcadores de células endoteliales como VE-cadherin, CD31, P-selectin o integrinas, CD42b para plaquetas adherentes o CD45 para leucocitos. Después de la tinción, tome al menos cinco imágenes con un microscopio confocal regular para caracterizar la colocación. 8. Análisis de imagen Abra una imagen de ensayo de flujo que contenga plaquetas etiquetadas fluorescentemente o fibrina fluorescente en ImageJ. Arrastre la imagen de su elección a ImageJ. La imagen se toma en color RGB. Para el análisis, se prefiere una imagen de 8 bits, así que transforme la imagen en 8 bits: Imagen Tipo de tipo ? 8 bits. Para minimizar el fondo, resta con un paraboloides deslizante, donde una bola rodante calcula y resta localmente píxeles de fondo de la imagen original: Procesar ? Restar fondo ? Radio de bola rodante á 50 píxeles ? Paraboloides deslizantes.NOTA: El tamaño de la imagen se define en píxeles. Sin embargo, para medir el área, es necesario establecer la escala. Cuando las imágenes se toman con un objetivo de 20x con una apertura numérica de 0,45, el microscopio tiene una escala de 2 píxeles por m. La mayoría de las veces la información necesaria para establecer la escala se almacena en los metadatos de la imagen y puede ser utilizada automáticamente por ImageJ: Analizar . Establecer escala. Establezca un umbral para definir las plaquetas adheridas o la fibrina depositada. Utilice el método Triángulo y el umbral se ajustará automáticamente: Imagen ? Ajustar ? Umbral. Analice el área cubierta por las plaquetas o la fibrina con el comando Analizar partículas. Establezca el tamaño en 2-Infinity, ya que el tamaño mínimo de una plaqueta es de 2 m: Analizar Analizar partículas. Los resultados proporcionarán el área total en el área total en el área2, con el tamaño medio de los agregados en m2 y el porcentaje de área cubierta.