全血-内皮相互作用と血栓動態をリアルタイムで研究するインビトロ微小流体疾患モデル

この研究は、オランダのアムステルダムにある機関医学倫理審査委員会(METC VUmc、NL69167.029.19)によって承認されました。ヒト被験者の初回細胞隔離および採血は、ヘルシンキ宣言に従って書面によるインフォームド・コンセントが得られた後に行われた。 1. 初発ヒト肺動脈内皮細胞(PAEC)の分離と培養 暖かい完全な内皮細胞培地(cECM)は、5%胎児ウシ血清(FBS)、1%ペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)、1%内皮細胞増殖サプリメント(ECGS)、および1%非必須アミノ酸(NEAA)を37°Cの水浴中に添加した。手術用ハサミ、鉗子、メスを120°Cの熱滅菌器または70%エタノールで殺菌します。滅菌条件下で層流キャビネット内でPAECの分離を行います。 高親和性の細胞結合60mm細胞培養皿( 材料表を参照)に2mLのフィブロネクチンを2 mL塗布し、37°Cで少なくとも15分間インキュベートします。 手術(例えば、ロボ摘出術または肺内膜切除術)から肺動脈(PA)組織を得て、4°Cのコールドコードバッファー(4 mM塩化カリウム、140mM塩化ナトリウム、10mM HEPES、11 mM Dグルコース、および1%P/S、pH=7.3)に保存し、分離するまで氷上に保ちます。 組織除去後2時間以内にPAから内皮細胞を単離する。鉗子でPAを取り、PBSで洗うために10センチペトリ皿に入れてください。PAがまだリングである場合は、はさみで開いた肺動脈を切り開きます。内皮は容易に損傷を受けたり、取除かれるので、器の最も内側の層に工具で触れないように注意してください。 細胞培養皿からフィブロネクチンを取り出し、4 mLのcECM培地を加える。 鉗子とPAティッシュを取り、媒体に置く。一方、慎重にメスで媒体に容器の内層を掻き取ります。しばしば、脂質蓄積は血管壁に見ることができる。細胞の成長に影響を与えるため、これらを省略してみてください。 内皮細胞の小さなコロニーが出現し始めるまで、培養中の細胞を保持します。 1日おきに培地を交換してください。繊維芽細胞が培養物を汚染する場合は、メーカーの指示に従ってCD144用磁気親和性細胞分離をキットで精製する( 材料表を参照)。最初の精製には2カラム法、連続した精製ごとに1カラム法を使用します。一般に、培養物は、フローサイトメトリーが≤10%汚染細胞を検出すると純粋に定義される。 実験用に十分なPAICが成長するまで、1:3~1:4の比率で細胞を分割します。PAECs を使用する準備ができたら、次の手順に進みます。 精製後、一次内皮細胞はEC特異的マーカー(例えば、VE-カドヘリン、CD31、TIE2)の存在、平滑筋細胞(α-SMA)、線維芽細胞(ビメンチン)、上皮マーカー(サイトケラチン)の存在を特徴付ける必要がある(図1B)。 2. フローチャンバとPAEC単層の調製 注: 仮説に応じて、市販の流れチャンバー( 材料表 および 図1CオプションA、プロトコルのステップ2.1を参照)またはカスタムメイドのマイクロ流体フローチャンバー(図1CオプションB、 プロトコルのステップ2.2)のいずれかを使用します。 市販マイクロスライドにおける内皮単層の細胞播種注:市販の流れチャンバは使いやすく、高いせん断率で使用できるチャネル全体に層流パターンを提供する。これらのマイクロスライドは、マルチチャンネルの並列実行を可能にし、正確で再現可能なフロープロファイルを提供するように設計されています。反転顕微鏡に最適化されているため、高品質の蛍光画像を取り込めます。さらに、流れチャンバの様々な次元は異なったチャネルサイズまたは幾何学で利用できる。これらのマイクロスライドは小さい次元を有し、多対的な実行を可能にするので、このアッセイのために6-ウェルの流れチャネルが好ましい。 6ウェルフロースライド(3.5 mm幅x 0.4 mm高さx 17 mmの長さ)の1チャンネルをコーティングするには、1チャンネルあたり0.1%のゼラチンを30 μL使用し、37°Cで少なくとも15分間インキュベートします。 1つのチャネルをシードするには、コンフルエントPAIcの10 cm2 をトリプシン化し、室温(RT)で7分間300 x g でスピンダウンします。 PAECsを600 μLのcECMおよびピペット100 μL(1.5 cm2) のセル懸濁液1チャンネルで中断します。これは毛管の行為によってマイクロスライドをカバーする。遅すぎると気泡が形成されます。ピペットの際にもう少し力を使って気泡の形成を避けてください。注: 細胞密度は内皮表現型に影響を与えます。チャネルの表面積は 0.6 cm2 であるため、チャネルあたりのコンフルエント セルの合計 1.5 cm2は過剰に対応します。実験を開始する前に、これらの細胞を最大合流に達するまでチャネル内でさらに6日間培養する。 さらに50 μLのcECMをチャネルに加えて、37°C、5%CO2で一晩インキュベーション2に十分な培地を提供します。次の日に培地を変更して、非結合細胞を洗い流します。 細胞を37°C、5%CO2で6日間培養し、PAECがしっかりとコンフルエントな単層を形成できるようにします。 1日おきに150 μLのcECMで交換してください。 7日目に、PaECをECMで1μMヒスタミンの100μL、1Sで、アッセイ前に30分間他の添加剤を使用せずに治療してください。刺激は 、アドリビタムを選択することができます。例えば、TNF-αは、炎症活性化剤として一般的に使用されてきた。 カスタムメイドのマイクロ流体流室の調製注:カスタムメイドのフローチャンバーは、寸法と形状を簡単に好みに変更できるため、ユーザーのニーズに合わせて調整されます。例えば、より生理学的に関連する血管を模倣するために、狭窄を導入することができる(図1D)。このアプローチは、微小血管疾患に見られるように非常に小さな血液量の使用を可能にする。 パターン化されたウエハーを用いたポリジメチルシロキサン(PDMS)のソフトリソグラフィ PDMS硬化剤とプリポリマーをマイクロバランス上で1:10比で組み合わせ、汎用ラボミキサーと十分に混合します。 得られた気泡を除去するために、約1時間デシケータでPDMSを脱気する。 ガラスペトリ皿にアルミホイルを並べ、並んだペトリ皿にウエハーを入れる前に水滴を数滴加えます。ウエハはカスタムメイドのチャネルのモールドとして機能します。注意:ウエハースまたはモールドはクリーンルーム施設によって提供されます。負のフォトレジストはウェーハにパターン化され、300 μm 幅 x 270 μm の高さ x 14 mm の長さの突出したチャネルのような特徴を作成します。 ガラスペトリ皿に入れたウエハーに脱気PDMSを注ぎます。 PDMSがデシケータのウエハーに注ぎ込んだデシケーターは、鋳造中に形成された可能性のある気泡を除去するためにさらに15分間注いだ。 デシケータからカビとPDMSを含むペトリ皿を取り出し、60°Cのオーブンに最低4時間置いてPDMSをクロスリンクします。 ガラススライドへの接合のための架橋PDMSの調製 金型と架橋PDMSをオーブンから取り外し、PDMSのダストフリーハンドリングのためにクロスフローフードに移動します。 メスを使用して金型の底面から PDMS を取り外し、クロスリンク PDMS の上部スラブを金型から取り外します。 露出したパターンの PDMS スラブに粘着テープを貼り付けて、PDMS チャネルに接触するほこりの粒子を防ぎます。 PDMSチップをサイズにカットし、生検パンチを使用して直径1mmの入口と出口をパンチします。 PDMSマイクロ流体チャネルおよびガラススライドの殺菌と接着 きれいなガラス顕微鏡は、エタノールで十分に洗いすり、続いてイソプロピルアルコールリンスを行うことによってスライドします。それぞれの洗い物の後、十分に窒素銃でスライドを乾燥させます。注:また、コンフォーカル顕微鏡を使用して分析を行う場合は、カバースリップを使用することもできます。 プラズマチャンバを開き、保護テープなしで、洗浄された顕微鏡スライドとマイクロ流体チップをロードします。 チャンバーを閉じ、窒素で1分間パージし、500 mTorrの圧力に達するまで濾過空気でチャンバーを満たします。 50 W のパワーと 5 kHz の周波数を使用して、40 s のプラズマにガラス スライドと PDMS チップを公開します。 プラズマに曝露した後、すぐにガラススライドとマイクロ流体チップを結合します。滅菌ペトリ皿にデバイスを保存します。 マイクロ流体チャネルにおける内皮単層の細胞播種 10 μLの0.1 mg/mLコラーゲンタイプIまたは0.1%ゼラチンを1チャンネルあたり10μLにピペットしてカスタムメイドのマイクロチャネルをコーティングし、37°Cで30分間インキュベートします。 4つのマイクロチャネルをシードするには、25 cm2 のコンフルエントPAECsをトリプシン化し、RTで7分間300 x g でスピンダウンします。注: サーフェスに接着するセルは、ごく一部です。したがって、コンフルエント単層を達成するために過剰な細胞を使用する必要がある。 PAECsを20 μLのcECMで中断し、各チャンネルに5μLのセルサスペンションを使用します。チャネル寸法が小さいため、毛細管の力がマイクロスライドを満たし、気泡の形成を防ぎます。 3~4時間後に培地を交換して、非結合細胞を洗浄します。 細胞を培養に6日間保持し、PAECがしっかりとしたコンフルエント単層を形成できるようにします。少量のため、150 μL の cECM で毎日メディアを交換します。入口にミディアムで充填されたピペットチップを残し、出口に空の先端を入れます。これは、細胞に十分な栄養素と成長因子を提供する貯水池として機能し、スライドが乾燥するのを防ぎます. 7日目に、Hoechst(cECMで1:5,000)を用いて生細胞中の核を染色し、37°Cおよび5%CO2で最大10分間インキュベートする2。 cECMで3倍丁寧に洗浄し、ECMで1μMヒスタミン+1Sで30分間、アッセイ前に処理します。刺激は 、アドリビタムを選択することができます。例えば、TNF-αは、炎症活性化剤として一般的に使用されてきた。 PDMSチップの出口をチューブに接続するには、直径1.27mm 90°の角度付きステンレス鋼コネクタを使用します。 3. 全血の準備 0.109 M クエン酸抗凝固剤の被験者から静脈血を引き出す。これは、抗凝固治療を受けていない健康または病気の被験者からすることができます.チューブをそっと反転して混ぜます。実験に必要な血液の総量は、主に選択した流量に依存します。25 mL/hの流量で、ibidi 6ウェルスライドでは、浴槽と流路を満たすために少し過剰で2mLの総体積で十分です。 血液を50 mLチューブに移し、カルセインAM(1:10,000)を加えて血液細胞とAlexa488-fibrinogen(15μg/mL)を蛍光的に標識し、自家フィブリノーゲンをコンジュゲートします。血液を37°Cで15分間インキュベートし、完全な吸収を可能にします。 血液1:1を再石灰化バッファー(154 mM塩化ナトリウム、10.8 mM クエン酸三ナトリウム、2.5 mM 塩化カルシウム、2 mM塩化マグネシウム)で希釈して実験開始する直前に行います。注:最大50%の血液希釈は凝固反応時間30に影響を与えませんでした。さらに、ヒトの血液は、ウイルスおよび他の薬剤を含むことができる。したがって、血液サンプルを使用すると、感染のリスクが伴います。適切な安全対策を講じ、材料の取り扱いを慎重に行うことを強くお勧めします。 4. フローシステムの組み立て チューブを接続する前に、洗浄バッファー(36 mMクエン酸、103 mM塩化ナトリウム、5 mM塩化カリウム、5 mM EDTA、および0.35%wt/volウシ血清アルブミン[BSA]、pH = 6.5)で満たされた20 mLシリンジでフローチューブを洗い流します。 新しいシリンジを使用して、フローチューブにHEPESバッファー(132 mM塩化ナトリウム、20 mM HEPES、6 mM塩化カリウム、1mM塩化マグネシウム、1%BSA、および5.5 mM Dグルコース、pH = 7.4)を充填し、肘型のルアーコネクタを慎重にEC培地で満たされたマイクロスライドに接続します。マイクロチャネルにコネクタを取り付けながら、スライド内の気泡の形成を防ぐようにしてください。気泡は、内皮を損傷し、あなたの実験の結果に影響を与えます.洗浄バッファーを完全に取り除き、細胞と接触させないでください。 図 1Eに示すように、フロー システムを設定します。血液が注射器に入った時に凝固を防ぐために20 mLのシリンジおよび洗い流しの洗浄緩衝液の2 mLを取る。空のシリンジをシリンジポンプに挿入し、このシリンジにメスのLuerコネクタで出口チューブを接続します。準備したヒトの血液を含む容器に入口管を入れる。 シリンジポンプのスイッチを入れ、流量を計算します。フロー プロファイルは、高さの放物線パターンに従います。血液がニュートン流体として作用すると仮定して、流量を計算するために次の式を使用します。 (方程式1)どこτ = せん断応力 η = 動的粘度 Q = 体積流量 h = チャネルの高さ w = チャネル幅 注:0.4 mmの高さおよび3.5 mmの幅の長方形の次元の商業6チャネルマイクロスライドの血を伴う肺動脈流動のために、25 mL/hの容積流量は5分のために使用された。カスタムメイドのフロー チャネルの寸法の違いにより、これらのダイナミクスも変更されます。変数を調整して、せん断応力が等しいことを確認します。 20 mL シリンジの直径を 19.05 mm に定義し、プログラムを 「退出」に設定します。負圧の適用によって細胞コーティングされたチャネルを通して血液を引っ張ることは一定のせん断率および細胞層への最低の損傷を保証する。 5. 画像取得用の顕微鏡の設定 20倍の目的を使用し、マイクロスライドを反転相コントラスト蛍光顕微鏡のステージに配置します。顕微鏡ソフトを起動し、Z方向にステージを移動し、細胞単層に焦点を合わせます。 各フロー チャネルの先頭、中間、および終了で、対象地域 (ROI) を選択します。開始と終了は、チャネルの入口と出口から少なくとも3 mm離れている必要があります。青色、緑色、赤色の蛍光フィルターに、最小限の背景を示すレーザーパワーと光強度を設定します。 6. PAIC上の全血の灌流 図1Eのようにすべてが接続され、顕微鏡が録画の準備ができたら、スタートを押してビデオを録画します。注射器ポンプで開始を押して、内皮の上に血液を浸透させます。 血液が内皮の上を流れ始めるとすぐに、あらかじめ選択された活性チャネルとROI位置を5分間15sごとに画像を取得する。 5分の灌流の後、録音を終了し、注射器ポンプを停止します。流れチャンバを分解し、非常に慎重にチューブを取り外します。多くの場合、これがあまりにも多くの力で行われると、気泡が形成されます。これは、内皮を洗い流すので、これを防ぐためにしてみてください。 7. 固定および分析後 注:灌流実験による内皮損傷による偽陽性血小板付着を排除するには、その隙間形成および単層のために内皮細胞を特徴付ける必要があります。これはVE-カドヘリンの規則的な免疫蛍光染色によって行うことができる。 チューブの灌流と分解の後、HEPESでマイクロ流体チャネルを洗浄します。ピペットHEPESは、血液を出口に押し込むためにチャネルに入ります。別のピペットで余分なものを取り除きます。 必要に応じて、PBS++ でチャネルを洗浄し(0.5 mM塩化マグネシウムと0.9 mM塩化カルシウム)タンパク質上清の沈殿を防ぎます。これにより、背景が減少します。しかし、余分な洗浄ステップは、分析後のイメージングに影響を与える可能性のある細胞の挙動と形態を変える可能性があります。 HEPESを取り出し、37°Cのパラホルムアルデヒド(PFA)をチャネルにピペットしてフィブリンを付着させた血小板と堆積させた後、エンドセリウムを取り出し、RTで15分間インキュベートします。注: これらのチャネルはさらに小さいため、カスタムメイドのマイクロ流体を固定する際には、各処理手順においてチャネルのせん断力が高くなるので、特に注意してください。 PFAをチャネルから取り出し、PBSで3倍洗います。マイクロスライドは、VE-カドヘリン、CD31、Pセレクチンまたはインテグリン、付着血小板用CD42b、白血球用CD45などの内皮細胞マーカーを特徴付ける標準的な染色プロトコルの準備が整いました。 染色後、通常の共焦点顕微鏡で少なくとも5つの画像を撮影し、共局在化を特徴付けます。 8. 画像解析 ImageJで蛍光標識された血小板または蛍光フィブリンのいずれかを含むフローアッセイ画像を開きます。選択した画像を ImageJ にドラッグします。 画像は RGB カラーで撮影されます。解析には、8ビット画像が推奨されるため、画像を8ビットに変換する: Image | タイプ | 8ビット。 背景を最小限に抑えるには、スライド式放物線で減算し、ローリングボールがローカルで元の画像からバックグラウンドピクセルを計算して減算します。背景を減算する |ローリングボール半径= 50ピクセル|スライディングパラボロイド.注: 画像サイズはピクセル単位で定義されます。ただし、面積を測定するには、スケールを設定する必要があります。0.45の数値開口で20倍の目的で画像を撮影すると、顕微鏡はμm当たり2ピクセルのスケールを持ちます。ほとんどの場合、縮尺を設定するために必要な情報はイメージのメタデータに保存され、ImageJ: 分析 | スケールを設定します。 付着した血小板または付着したフィブリンを定義するしきい値を設定します。三角形の方法を使用すると、しきい値が自動的に調整されます: イメージ | 調整 | しきい値: [パーティクルを解析]コマンドを使用して、血小板またはフィブリンで覆われた領域を解析します。血小板の最小サイズは2μmであるため、2-無限大にサイズを設定する:分析|パーティクルの解析: 結果は、μm2の総計値の平均サイズと被覆面積の割合をμm2 で合計面積を提供します。