אנו מציגים מודל מחלת כלי דם במבחנה לחקור אינטראקציות דם שלם עם אנדותל נגזר המטופל. מערכת זו מאפשרת לחקור תכונות טרומבוגניות של תאי אנדותל ראשוניים בנסיבות שונות. השיטה מתאימה במיוחד להעריך את הטיפול situ thrombogenicity ונוגדי קרישה בשלבים שונים של קרישה.
היווצרות קרישי דם כרוכה באינטראקציות מורכבות בין תאי אנדותל, המטריצה הבסיסית שלהם, תאי דם שונים, וחלבונים. ה אנדותל הוא המקור העיקרי של רבים של מולקולות המוסטטיות העיקריות לשלוט צבירת טסיות דם, קרישה, פיברינוליזה. למרות מנגנון הפקקת נחקר במשך עשרות שנים, במבחנה מחקרים מתמקדים בעיקר במצבים של נזק לכלי דם שבו מטריקס subendothelial נחשף, או על אינטראקציות בין תאים עם רכיבי דם יחיד. השיטה שלנו מאפשרת לימוד אינטראקציות בין דם שלם לרשת תאי כלי דם שלמים וקופלריים.
על ידי ניצול תאי אנדותל אנושיים ראשוניים, פרוטוקול זה מספק את ההזדמנות הייחודית ללמוד את ההשפעה של תאים אנדותל על דינמיקת תרומבוס ונותן תובנות יקרות ערך על הפתופיזיולוגיה של מחלה טרומבוטית. השימוש בערוצים מותאמים אישית של זרימה מיקרו-נוזלים מאפשר יישום של גיאומטריות וסקולרי ספציפיות למחלה ושינויים מורפולוגיים ספציפיים בכלי הדם. התפתחות הטרומבוס נרשמת בזמן אמת וכמותית המאופיינת בהדבקת טסיות דם ותצהיר פיברין. ההשפעה של תפקוד אנדותל בדינמיקה טרומבוס שונה נקבעת על ידי postanalysis באמצעות כתמי חיסון של מולקולות ספציפיות.
התוצאות המייצגות מתארות את ההתקנה הניסיונית, איסוף הנתונים וניתוח הנתונים. בהתאם לשאלת המחקר, ניתן להתאים פרמטרים לכל מקטע, כולל סוג תא, שיעורי גיזה, גאומטריית ערוצים, טיפול תרופתי והליכי ניתוח שלאחר ניתוח. הפרוטוקול מאומת על ידי כימות היווצרות טרומבוס על אנדותל עורק ריאתי של חולים עם מחלה טרומבואמבולית כרונית.
ה אנדותל יוצר את השכבה התאית הפנימית של כלי הדם ומפריד דם מן הרקמה שמסביב. הוא תואר כאיבר דינמי המסדיר באופן פעיל את המיקרו-סביבה שלו ומגיב לגירויים חיצוניים1. בשל הקשר הישיר שלה עם דם זורם, אנדותל הוא מרכזי בשליטה של המוסטאזיס ופקקת והוא המקור העיקרי של רבים של מולקולות רגולטוריות העיקריות כי שליטה צבירה טסיות דם, קרישה, פיברינוליזיס2. בריא, תאים אנדותל לא פעיל (EC) לייצר מספר מולקולות המנטרלות את הפעלת טסיות דם ולמנוע קרישה היווצרות תרומבוס כדי לשמור על זרימת הדם, כגון פרוסטציקלין, טרוממודולין, או מעכב מסלול גורם רקמות (TFPI)2,,3. פעולה זו מונעת הדבקה של טסיות דם, צבירת טסיות דם, היווצרות טרומבוס. פציעה או הפעלה של קיר כלי השיט גורמת לפנוטיפ אנדותל פרו-קריאגולי הנויז הידבקות טסיות דם מקומיות ומבנהקריש 2,,4. על טסיות דם של הפעלת אנדותל לדבוק פון Willebrand פקטור (VWF), חלבון רב מרי שוחרר ECs, או לאתרים מחייבים חשופים של מטריצת subendothel הבסיסית. לאחר מכן, שינויים מולקולריים טסיות דם ואת החשיפה לגורם רקמות (TF) ליזום את ההפעלה של מערכת קרישה, אשר גורם היווצרות טרומבוס על ידי פולימריזציהפיברין 5,,6. יחד, קריש הדם שנוצר מספק את הבסיס לסגירת הפצע על ידי אנדותל מחדש7. סטיות של מערכת קרישה עלול לגרום להפרעות דימום, כגון מחלת פון Willebrand, המופיליה, או פקקת, הנובעים לעתים קרובות מאיזון פרו-ואנטי-טרומבוטי dysregulated של מסלול ההמוסטטי אנדותל2,3.
תהליך ההמוסטאזיס מתרחש הן במחזור העורקי והן במחזור הדם הארסי. עם זאת, המנגנונים הבסיסיים פקקת עורקים ורידים שונים במהותם. בעוד פקקת עורקים, כפי שניתן לראות במחלת לב איסכמית, מונע בעיקר על ידי קרע של פלאק טרשת עורקים בתנאים של מתח גיצה גבוהה, פקקת ורידים מתפתחת בעיקר בהיעדר פציעה אנדותל במצבשל קיפאון 8,9,10. תרומבוס ורתי עמוק עלול לתסחיף ולנוע לכיוון עורקי הריאה, שם הוא גורם לתסחיף ריאתי. זה יכול לגרום לחסימה כרונית של כלי דם המובילים ליכולות תפקודיות לקויות משמעותיות שעשויות לטפח את התפתחותן של מחלות ריאות chonic כולל התפתחות של יתרלחץ דםריאתי טרומבומבולי כרוני (CTEPH)11,12,13,14 . CTEPH מאופיין בלחץ ריאתי גבוה בשל חסימות של עורקי הריאה על ידי חומר טרומבואמבולי לאחר לפחות שלושה חודשים של טיפול קרישה15. בנוסף תסחיף ריאות, הוא הניח כי אנדותל ריאתי מספק סביבה פרותרומבוטית ב CTEPH המאפשר פקקת סיטו וחסימות כרוניות של עורקי הריאה, גורם לעלייה בלחץ הדם כי בסופו של דבר יכול לגרום לאי ספיקת לב, אםלא מטופל 16,17.
בשנים האחרונות, מחקרים שונים הובילו לפיתוח של אסמים לבחון היווצרות טרומבוס על ידי מדידת תפקוד טסיות דם קרישה18. עם זאת, רובם גם ללמוד את האינטראקציה של דם שלם עם רכיבי מטריצה חוץ תאית אחת כמו collagens או פיברינס, או תפקוד אנדותל באינטראקציה עם רכיבי דם יחיד, כגון טסיות אנדותל או אינטראקציה אנדותל-leukocyte19,,20,,21,,22. בדיקות אלה מבוצעות בדרך כלל עם תאי אנדותל טבור אנושיים (HUVEC), כמו תאים אלה מתקבלים בקלות. עם זאת, גנים המוסאטיים באים לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי על פני עץ כליהדם, סוגי כלי דם, ומערכות איברים 23,24, מה שהופך את השימוש HUVECs לייצג תאים אנדותל מעורב פקקת עורקי או תסחיףריאתי בעייתי 23.
בנוסף פלסטיות EC, שינויים המודינמיים ספציפיים למחלה ושינויים מורפולוגיה כלי דם יכול לקדם היווצרות טרומבוס באאנדותל נורמלי25. שיעורי גימה גבוהים יותר, בשל תכונת כלי דם מקומית או שינויים בגיאומטריית כלי הדם, למשל, עלול לגרום להיווצרות טרומבוס חריפה, ולגרום להיצרות המאיצה את הפסקת זרימת הדם26. השימוש בערוצים מותאמים אישית של זרימה מיקרו-מהנונדסת מאפשר לעצב באופן ספציפי גיאומטריות כלי דם המייצגות את הביולוגיה (פתו). בדרך זו, ניתן ללמוד את ההשפעה של כוחות ביומכניים מקומיים על EC בריא אוחולים 27.
ישנם טיפולים נגד קרישה זמינים עבור מיקוד שלבים ומולקולות שונים במפל קרישה, אשר כל מהווים סיכונים ויתרונות מסוימים שיכולים להיות ספציפיים להפרעות מסוימות. הגישה של מידול מחלה המתוארת במאמר זה מתאימה במיוחד כדי לבדוק את ההשפעות של טיפולים אנטי קרישה ואנטי פלטה שונים על דינמיקת תרומבוס.
המטרה היא להציג מודל של פקקת הכולל ECs ראשי, מניב מודל רב-תכליתי מתאים לניתוח של צורות שונות של פקקת בהתאם לסוג של ECs הראשי בשימוש. כהמחשה, השתמשנו בתאי אנדותל עורקים ריאתיים מחולי CTEPH באינטראקציה עם דם אנושי שלם המכיל את כל הרכיבים המעורבים במבנה טרומבוס (טסיות דם, לוקוציטים, אריתרושיטים, חלבוני קרישת דם, וקופאקטורים). גישה זו יכולה להיות מיושמת בערוצים מסחריים מקבילים זרימה או בערוצים זרימה microfluidic בהזמנה אישית עם עיצוב כלי דם ספציפי. ככזה, המודל יכול לשמש בסופו של דבר במחקר של היווצרות טרומבוס ורזולוציה, להערכת תגובות דלקתיות במודלים מחלה, לטיפול נגד פלסטראט או נוגד קרישה, ובסופו של דבר לרפואה מותאמת אישית.
מחקר זה מתאר את הבידוד של תאי אנדותל עורק ריאתי אנושי ראשי. לבידוד של סוגי תאים אנדותל אנושיים עיקריים אחרים, אנו מתייחסים לשיטות שפורסמו בעבר, כולל תאי אנדותלמיקרו-וסקולריים ריתיים 25, תאי אנדותל טבוראנושיים 28, ודם במחזור מושבת אנדותל ויוצרים תאים איור 1A29.
קרישה היא תוצאה של יחסי הגומלין המורכבים והמבוקרים באופן זמני בין אנדותל לרכיבי הדם. זה במבחנה שיטה מציגה שיטה לחקור תכונות טרומבוגניות של תאים אנדותל בזמן אמת. סוגים שונים של תאי אנדותל אנושיים עיקריים ניתן להשתמש, להקל על פקקת סיטו באופן ספציפי למטופל. במחקר זה, אנו המחישנו את השימוש בפרוטוקול זה השוואת תכונות ת’ומבוגניות של PAECs מבודד מתורמים בריאים לעומת חולי CTEPH. היווצרות תרומבוס חי נחקר על ידי שאיפה של דם שלם מנבדקים בריאים על אנדותל היסטמין מופעל, בעוד ההשפעה של DOAC נבדק כסוכן אנטי טרומבוטיק.
מלבד השימוש במיקרו-ערוצים הזמינים מסחרית, כפי שמופף בתוצאות המייצגות, המבוא של הערוצים המיקרו-נוזלים בהתאמה אישית מאפשר לחקור את ההשפעה של שינויים בגיאומטריה של כלי הדם על היווצרות טרומבוס. לדוגמה, הזרימה פוחתת בנקודת ענף או היצרות גורמת לעלייה בלחץ גיזר והפעלת טסיות דם נוספות36. עם זאת, מגבלה משמעותית של ערוצים אלה microfluidic בהתאמה אישית היא הדרישה של מספרי תאים גבוהים כדי ליצור שכבת מונו-שכבה יציבה של ECs כמתואר בשלב 2.3.2. זה עשוי להציג גורם מגביל כאשר תאים נגזרים המטופל הם נדירים. החוזקות של המפולות המיקרו-מפולות הזמינות מבחינה מסחרית הן ששטחי הפנים משתנים עבור תרבות תאים ושטחי צמיחה גדולים יותר, ובכך מאפשרים ל-ECs ליצור מונו-שכבת-שכבה מסוגמת ויציבה. מצד שני, שטח פנים גדול יותר יגרום ללומן גדול יותר. על פי Equation 1, זה דורש נפחי דם גבוהים יותר כדי להגיע שיעורי זרימה דומים כמו במיקרו-נוזלים בהזמנה אישית.
שיפור בפרוטוקול זה יכול להיות לחקור אובדן EC חי או שינויים בתקינות מחסום. נזק EC בפרוטוקול זה נמדד רק בסוף הניסוי. למעקב חי, ניתן לתייג את ה- ECs באמצעות mCherry VE-cadherin,לדוגמה 37. עם זאת, כמו זה היה צריך פרוטוקול אופטימיזציה מאוד עם תחליף וירוס יעיל, תא חשמלי-substrate חישת מכשול (ECIS) יכול לשמש כחלופה ללמוד שלמות אנדותלופונקציית מחסום 38. התזת ערוצים מיוחדים של ECIS מאפשרת ניטור אורכי של תקינות מחסום אנדותל תחת זרימה. תכונות ECIS ספציפיות אלה מאפשרות מדידות מקבילות של מאפייני מחסום אנדותל והיווצרות טרומבוס. דרכים חלופיות למדידות מקבילות של מחסום EC, במיוחד במערכים המותאמים אישית, כוללות שימוש ב-dextrans פלורסנט ב-perfusate, המפזר את הלומן, בהתאם למאפייני מחסום ה-EC.
מגבלה של הפרוטוקול המתואר היא כי ECs מוסרים מגוף האדם ותרבות על פלסטיק תרבות רקמות, שהוא נוקשה, שקוע מלאכותי. תאים להסתגל לסביבה הביופיזית שלהם. זה יכול להשפיע על תגובת אנדותל להפעלת טסיות דם, כפי שיש קשר בין הפעלת טסיות דם ונוקשות קיר39. למרות התאמות אלה לפלסטיק תרבות, תאים לשמור על מאפיינים ספציפיים למחלה שניתן לזהות בהשוואה ישירה עם ECs נגזר תורמים בריאים כפי שמוצג עם שליטה, CTEPH-PAEC, ו HUVEC שהפעיל דפוסים שונים של הדבקת טסיות דם ותצהיר פיברין לאחר 5 דקות של דם עירוי.
בניגוד לפרוטוקולים אחרים, מערכת זו משתמשת בדם שלם בעוד שאחרים חוקרים אינטראקציה EC עם רכיב דם יחיד כגון טסיות דם ולוקוציטים19,20,21. פותחו מודלים מיקרו-נוזלים מתקדמים יותר המאפשרים את חקר תפקוד אנדותל במודל כלי דם עם גאומטריית כלי עגולה ומטריצה חוץ-תאית רכה. עם זאת, אלה ממוטבים עם HUVECs40,41,42. החידוש של הפרוטוקול המתואר הוא השימוש ECs הראשי בשילוב עם דם שלם להביא את הדוגמנות של פקקת סיטו צעד אחד קרוב יותר בתנאי vivo. לאחר אופטימיזציה של הפרוטוקול לשימוש ב-ECs הנגזר ממטופל ודם הנגזר ממטופל ממטב עוד יותר את מידול המחלהבמבחנה , ומאפשר הערכה של היווצרות טרומבוס מותאמת אישית וטיפול תרופתי.
הפרוטוקול המתואר יכול להיות מיושם כדי ללמוד את ההשפעה של טיפולים נגד קרישה על תאים נגזרים ממטופל. בעוד שהשתמשנו dabigatran לעכב היווצרות טרומבוס, ניתן להשתמש נוגדי קרישה אחרים, כגון rivaroxaban, אשר מעכב ישירות פקטור Xa במפל קרישה. מעכבי טסיות דם ישיר כמו clopidogrel או אספירין ניתן ללמוד גם כן, כמו אלה לפעול על השלב העיקרי של hemostasis שבו טסיות דם לאגד ECs. בסופו של דבר, היכולות הטרמבוגניות של ECs ספציפי למטופל באינטראקציה עם הדם של המטופל עצמו יכול לשמש כדי לחזות את ההשפעה האישית של טיפול קרישה על המטופל הבודד. יתר על כן, נוק-דאון של חלבונים ספציפיים יכול לספק מידע פונקציונלי נוסף.
ישנם כמה שלבים בפרוטוקול המתואר שהם קריטיים לניסוי סבר מוצלח. ראשית, במהלך הבידוד של תאים ראשוניים, יש צורך להשיג תרבות EC טהורה מאוד. שנית, חשוב שה-ECs ירכיבו שכבת מונו-שכבתית יציבה. אם זה לא המקרה, שינוי קל בלחץ גיה יכול לגרום נזק אנדותל והפעלה של מפל קרישה, או טסיות דם יכול להתחיל לקשור לקרום המרתף, אשר יספק תוצאות חיוביות כוזבות. שלישית, חיוני למנוע בועות אוויר, כמו אלה יכולים לפגוע אנדותל ובכך להשפיע על התוצאות.
לאחר חישוב מחדש של הדם הקלוע עם סידן כלוריד ומגנזיום כלוריד, חשוב להתחיל מיד את ניסוי התזת. חישוב מחדש גורם לתגובה מהירה בהפעלת טסיות דם והיווצרות טרומבוס, וכתוצאה מכך קרישה מהירה בדגימה.
לסיכום, אנו מתארים פרוטוקול רב-תכליתי מאוד כדי ללמוד אינטראקציות שלמים של תאי אנדותל בדם במהלך פקקת.
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים יאן Voorberg מהמחלקה של חלבוני פלזמה, מחקר Sanquin ומעבדה Landsteiner, אמסטרדם UMC, המרכז הרפואי האקדמי, אמסטרדם, הולנד, על הקלט שלו בכתב יד זה. עבודה זו נתמכה על ידי הברית ההולנדית CardioVascular Alliance (DCVA) [2012-08, 2014-11] הוענק Phaedra וקונסורציום חיבור מחדש, כמו גם מענק דחף 2018 הוענק קונסורציום Phaedra IMPACT. מענקים אלה כוללים מימון קולקטיבי של קרן הלב ההולנדית, הפדרציה ההולנדית של המרכזים הרפואיים האוניברסיטאיים, הארגון ההולנדי למחקר ופיתוח בריאות, והאקדמיה המלכותית למדעים של הולנד. יתר על כן, עבודה זו מומנה על ידי מועצת המחקר האירופית במסגרת תוכנית המענק המתקדם ‘VESCEL’ (מספר מענק: 669768). XDM ממומן על ידי מענק מחקר של המכון למחקר לב וכלי רכב (ICaR-VU) במרכז הרפואי של אוניברסיטת VU, אמסטרדם, הולנד.
20 mL syringe | BD Plastipak | 300613 | |
20X objective | Olympus | ||
2-Propanol (IPA) | Boom | 76051455 . 5000 | |
Aladdin Syringe Pump | Word Precision Instruments | AL-4000 | |
Alexa488-Fibrinogen | Invitrogen | F13191 | 15 ug/mL |
Alexa647 Goat anti Rabbit | Invitrogen | A21245 | 0.180555556 |
Biopsy punch 1 mm diameter, Integra Miltex | Ted Pella | 15110-10 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A9647 | |
CaCl2 | Sigma Aldrich | 21115 | |
Calcein AM-Red | Invitrogen | C3099 | 1:1000 |
CD42b-APC | Miltenyi Biotec | 130-100-208 | 1:100 |
Citric Acid | Merck | 244 | |
Collagen Typ I | Corning | 354249 | 0,1 mg/mL |
Corning CellBIND Surface 60 mm Culture Dish | Corning | 3295 | |
Cross-flow hood | Basan | ||
Desiccator | Duran | 24 782 69 | |
D-Glucose | Merck | 14431-43-7 | |
EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
Endothelial Cell Medium (ECM) | ScienCell | 1001 | |
Fibronectin | Sigma Aldrich | F0895 | |
Flow tubings | ibidi | 10831, 10841 | |
Gelatin | Merck | 104070 | 0.1% |
HEPES | Sigma Aldrich | H4034 | |
Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | 1:1000 |
ibidi µ-Slide VI 0.4 flow chambers | ibidi | 80606 | |
ImageJ | ImageJ | v1.49 | |
KCl | Merck | 7447-40-7 | |
Lab oven | Quincy | 10GC | |
LS720 Fluorescent microscope | etaluma | LS720 | |
Luer connector | ibidi | 10802, 10825 | Male elbow connectors, and Female tube connectors |
MACS magnetic beads (anti-CD144) | Miltenyi Biotec | 130-097-857 | 1:5 |
MgCl2 | Sigma Aldrich | M1028 | |
Microscopy slides, 76 x 26 mm | Thermo Scientific | AAAA000001##12E | |
Negative photoresist, SU-8 | Microchem | ||
Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Lonza | 13-114E | |
Paraformaldehyde (PFA) | Merck | 818715 | 4% PFA in PBS |
Penicillin/streptomycin (P/S) | Gibco | 15140-122 | 1% |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-094 | |
Plasma chamber, CUTE | Femto Science | ||
Polydimethylsiloxane (PDMS), Sylgard 184 | Dow | 101697 | |
sodium citrate blood collection tubes | BD Vacutainer | 363048 | |
trisodium citrate | Merck | 6448 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300-045 | |
VE-Cadherin (D87F2)-XP | Cell Signaling | 2500 | 1:300 |