Modèle de maladie microfluidique in vitro pour étudier les interactions endoteléliales du sang entier et la dynamique des caillots sanguins en temps réel

Cette étude a été approuvée par le Medical Ethical Review Board du VU Medical Center Amsterdam, Pays-Bas (METC VUmc, NL69167.029.19). L’isolement cellulaire primaire et la collecte de sang des sujets humains ont été effectués après que le consentement écrit en connaissance de cause a été obtenu conformément à la Déclaration d’Helsinki. 1. Isolement et culture des cellules endothéliales artérielles pulmonaires primaires (PAEC) Milieu complet chaud de cellules endothéliales (cECM) complété par le sérum bovin foetal (FBS), 1% de pénicilline/streptomycine (P/S), 1% de suppléments de croissance cellulaire endothéliale (ECGS) et 1% d’acides aminés non essentiels (NEA), dans un bain d’eau à 37 °C. Stériliser les ciseaux chirurgicaux, les forceps et un scalpel avec soit un stérilisateur thermique de 120 °C ou 70% d’éthanol. Effectuer l’isolement du PAEC dans un coffret de débit laminaire dans des conditions stériles. Enrober un plat de culture cellulaire à haute affinité de 60 mm (voir tableau des matériaux)avec 2 mL de fibronectine de 5 μg/mL et incuber à 37 °C pendant au moins 15 min. Obtenir le tissu de l’artère pulmonaire (PA) à partir de la chirurgie(p. ex.lobectomy ou endartérectomie pulmonaire), conserver dans un tampon de cordon froid de 4 °C (4 mM de chlorure de potassium, 140 mM de chlorure de sodium, 10 mM HEMPES, 11 mM D-glucose, et 1% P/S, pH = 7,3), et garder sur la glace jusqu’à l’isolement. Isoler les cellules endothéliales de l’AP dans les 2 h suivant l’ablation des tissus. Prenez l’AP avec des forceps et le mettre dans une boîte de Pétri de 10 cm pour laver avec PBS. Si l’AP est toujours un anneau, couper l’artère pulmonaire ouverte avec des ciseaux. Soyez très prudent de ne pas toucher la couche la plus intérieure du navire avec les outils, car l’endothélium est facilement endommagé et / ou enlevé. Retirer la fibronectine du plat de culture cellulaire et ajouter 4 mL de milieu cECM. Prenez le tissu PA avec des forceps et placez-le dans le milieu. Pendant ce temps, gratter soigneusement la couche interne du récipient dans le milieu avec un scalpel. Souvent, des accumulations de lipides peuvent être observées dans la paroi du vaisseau. Essayez d’omettre ceux-ci, car ils auront un impact sur l’excroissance cellulaire. Gardez les cellules en culture jusqu’à ce que de petites colonies de cellules endothéliales commencent à apparaître. Remplacez le milieu tous les deux jours. Si les fibroblastes contaminent la culture, purifiez-la avec la séparation des cellules d’affinité magnétique pour CD144 avec un kit, conformément aux instructions du fabricant (voir tableau des matériaux). Utilisez la méthode à deux colonnes pour la purification initiale et la méthode d’une colonne pour chaque purification consécutive. En général, une culture est définie pure lorsque la cytométrie du flux détecte ≤10% des cellules contaminantes. Diviser les cellules en ratios de 1:3 à 1:4 jusqu’à ce que des PAEC suffisants soient cultivés pour une utilisation expérimentale. Lorsque les PAEC sont prêts à être utilisés, continuez à l’étape suivante. Après la purification, les cellules endothéliales primaires doivent être caractérisées pour la présence de marqueurs spécifiques à l’EC(p. ex.,VE-cadhérine, CD31, TIE2) et en l’absence de cellules musculaires lisses (α-SMA), de fibroblastes (vimentine) et épithéliales (cytokératine)(figure 1B). 2. Préparation des chambres à débit et des monocouches paec REMARQUE : Selon l’hypothèse, utiliser soit les chambres de débit disponibles dans le commerce (voir tableau des matériaux et figure 1C Option A, étape 2.1 du protocole) ou une chambre d’écoulement microfluidique sur mesure(figure 1C Option B, étape 2.2 du protocole). Ensemencement cellulaire des monocouches endothéliales dans des microslides disponibles dans le commerceREMARQUE : Les chambres à débit disponibles dans le commerce sont faciles à utiliser et fournissent un modèle de débit laminaire dans tout le canal qui peut être utilisé à des taux de cisaillement élevés. Ces microslides sont conçus pour permettre des pistes parallèles multicanal et fournir un profil de débit précis et reproductible. Parce qu’ils sont optimisés pour la microscopie inversée, il est possible de capturer des images fluorescentes de haute qualité. En outre, différentes dimensions des chambres d’écoulement sont disponibles dans différentes tailles de canaux ou géométries. Les canaux de flux à 6 puits sont préférés pour ce test car ces microslides ont de petites dimensions et permettent des courses multiparallel. Pour recouvrir un canal d’une lame de flux de 6 puits (largeur de 3,5 mm x 0,4 mm de hauteur x 17 mm de longueur), utilisez 30 μL de gélatine de 0,1 % par canal et incuber à 37 °C pendant au moins 15 min. Pour semer un canal, essayez 10 cm2 de PAEC confluent et tournez vers le bas à 300 x g pendant 7 min à température ambiante (RT). Suspendre les PAEC dans 600 μL de cECM et de pipette 100 μL (1,5 cm2 ) de suspension cellulaire dans un canal. Cela couvre le microslide par l’action capillaire. S’il va trop lentement, des bulles d’air se formeront. Évitez la formation de bulles d’air en utilisant un peu plus de force lors du pipetage.REMARQUE : La densité cellulaire influence le phénotype endothélial. Un total de 1,5 cm2 de cellules confluentes par canal est surconfluent, parce que le canal a une surface de 0,6 cm2. Avant de commencer l’expérience, la culture de ces cellules pendant encore 6 jours dans les canaux jusqu’à ce qu’ils atteignent la confluence maximale. Ajouter 50 μL supplémentaires de cECM au canal pour fournir un milieu suffisant pour l’incubation pendant la nuit à 37 °C, 5 % de CO2. Changez le milieu le lendemain pour laver les cellules non liées. Gardez les cellules en culture pendant 6 jours à 37 °C, 5 % de CO2 pour permettre au PAEC de former une monocouche ferme et confluente. Changez le milieu tous les deux jours avec 150 μL de cECM. Au jour 7, traiter le PAEC avec 100 μL d’histamine de 1 μM dans ecm et 1 % de FBS sans aucun autre additif pendant 30 min avant l’essai. Le stimulus peut être choisi ad libitum. Par exemple, le TNF-α a été couramment utilisé comme activateur inflammatoire. Préparation de chambres à débit microfluidiques sur mesureREMARQUE : Les chambres d’écoulement sur mesure sont adaptées aux besoins de l’utilisateur, car les dimensions et les géométries peuvent être facilement modifiées en préférences. Par exemple, pour imiter un vaisseau plus pertinent sur le plan physiologique, une sténose peut être introduite (figure 1D). Cette approche permet l’utilisation de très petits volumes sanguins comme on le voit dans les maladies microvasculaires. Lithographie douce du polydiméthylsiloxane (PDMS) à l’aide de plaquettes à motifs Combiner l’agent de traitement PDMS et le prépolymère sur un microéquilibre à un rapport de 1:10 et bien mélanger avec un mélangeur de laboratoire à usage général. Pour enlever les bulles d’air qui en résultent, dégazer le PDMS dans un dessiccateur pendant environ 1 h. Tapisser une boîte de Pétri en verre de papier d’aluminium et ajouter quelques gouttelettes d’eau avant de placer la gaufrette dans la boîte de Pétri doublée. La plaquette sert de moule pour le canal sur mesure.REMARQUE : Les gaufrettes ou les moules sont fournis par les installations de la salle propre. Le photorésiste négatif est modelé sur des plaquettes pour créer des caractéristiques saillantes semblables à des canaux avec les dimensions typiques suivantes : 300 μm de largeur x 270 μm de hauteur x 14 mm de longueur. Verser le PDMS dégazé sur la gaufrette placée dans une boîte de Pétri en verre. Degas le PDMS versé sur la plaquette dans un desiccateur pendant 15 minutes supplémentaires pour enlever toutes les bulles qui pourraient s’être formées pendant le moulage. Retirez la boîte de Pétri contenant le moule et le PDMS du desiccateur et placez-la dans un four à 60 °C pendant un minimum de 4 h pour relier le PDMS. Préparation du PDMS croisé pour la liaison aux lames de verre Retirez le moule et le PDMS croisés du four et passez à un hotte à flux croisé pour la manipulation sans poussière du PDMS. Retirez tout PDMS du fond du moule à l’aide d’un scalpel et retirez la dalle supérieure du PDMS croisé du moule. Tapissez la dalle PDMS à motifs exposés de ruban adhésif pour empêcher les particules de poussière d’entrer en contact avec les canaux PDMS. Couper les copeaux PDMS à la taille et poinçonner les entrées et les sorties de 1 mm de diamètre à l’aide d’un poinçon de biopsie. Stérilisation et collage des canaux microfluidiques PDMS et des lames de verre Nettoyer les lames de microscopie en verre en rinçant soigneusement avec de l’éthanol, suivi d’un rinçage à l’alcool isopropyle. Après chaque rinçage, séchez soigneusement les lames à l’aide d’un pistolet à azote.REMARQUE : Alternativement, les feuillets de couverture peuvent être utilisés si l’analyse est effectuée à l’aide d’un microscope confocal. Ouvrez la chambre plasma et chargez les lames de microscopie nettoyées et les puces microfluidiques sans le ruban de protection. Fermez la chambre, purgez avec de l’azote pendant 1 min et remplissez la chambre d’air filtré jusqu’à ce qu’une pression de 500 mtorr soit atteinte. Exposez les lames de verre et les puces PDMS au plasma pendant 40 s en utilisant une puissance de 50 W et une fréquence de 5 kHz. Après l’exposition au plasma, attachez immédiatement les lames de verre et les copeaux microfluidiques. Conservez les appareils dans des boîtes de Pétri stériles. Ensemencement cellulaire des monocouches endothéliales dans les canaux microfluidiques Enrober le microcanal sur mesure en pipeting 10 μL de 0,1 mg/mL collagène type I ou 0,1% de gélatine par canal et incuber à 37 °C pendant 30 min. Pour semer quatre microcanaux, trypsinize 25 cm2 de PAEC confluent et tourner vers le bas à 300 x g pendant 7 min à RT.REMARQUE : Seul un faible pourcentage de cellules adhèreront à la surface. Par conséquent, il est nécessaire d’utiliser un excès de cellules pour atteindre un monocouche confluent. Suspendre les PAEC dans 20 μL de cECM et utiliser 5 μL de suspension cellulaire pour chaque canal. En raison des petites dimensions du canal, les forces capillaires rempliront le microslide et empêcheront la formation de bulles d’air. Changez de milieu après 3 à 4 h pour laver les cellules non liées. Gardez les cellules en culture pendant 6 jours pour permettre au PAEC de former une monocouche ferme et confluente. En raison du petit volume, changez le milieu chaque jour avec 150 μL de cECM. Laisser la pointe de la pipette remplie de milieu dans l’entrée et mettre une pointe vide dans la sortie. Cela servira de réservoir fournissant suffisamment de nutriments et de facteurs de croissance aux cellules et empêchera la lame de se dessécher. Le jour 7, tacher les noyaux dans les cellules vivantes avec Hoechst (1:5,000 en cECM) et incuber pendant un maximum de 10 min à 37 °C et 5% DE CO2. Laver soigneusement 3x avec cECM et traiter avec 1 histamine μM dans ECM + 1% FBS pendant 30 min avant l’essai. Le stimulus peut être choisi ad libitum. Par exemple, le TNF-α a été couramment utilisé comme activateur inflammatoire. Utilisez des connecteurs en acier inoxydable incliné de 1,27 mm de diamètre 90° pour raccorder la sortie des puces PDMS aux tubes. 3. Préparation du sang entier humain Prélever du sang veineux sur des sujets dans un anticoagulant de citrate de sodium de 0,109 M. Cela peut être de sujets sains ou malades qui ne reçoivent pas de traitement anticoagulation. Inversez délicatement les tubes pour mélanger. La quantité totale de sang requise pour une expérience dépend principalement du débit choisi. Avec un débit de 25 mL/h, dans des diapositives de 6 puits ibidi, un volume total de 2 mL avec un peu d’excès pour remplir les cuves et le canal d’écoulement est suffisant. Transférer le sang dans un tube de 50 ml et ajouter calcéin AM (1:10,000) pour étiqueter fluorescent les cellules sanguines et Alexa488-fibrinogène (15 μg/mL) à conjugaison de fibrinogène autologue. Laissez le sang incuber à 37 °C pendant 15 min pour permettre une absorption complète. Diluer le sang 1:1 avec un tampon de recalcification (154 mM de chlorure de sodium, 10,8 mM de trisodium citrate, 2,5 mM de chlorure de calcium et 2 mM de chlorure de magnésium) immédiatement avant le début de l’expérience.NOTE: Hemodilution avec un maximum de 50% n’a pas influencé le temps de réaction decoagulation 30. En outre, le sang humain peut contenir des virus et d’autres agents. Travailler avec des échantillons de sang, par conséquent, comporte un risque d’infection. Il est fortement recommandé d’utiliser des mesures de sécurité appropriées et de traiter le matériel avec soin. 4. Assemblage du système d’écoulement Avant de connecter le tube, rincer les tubes d’écoulement à l’aide d’une seringue de 20 mL remplie d’un tampon de lavage (acide citrique de 36 mM, 103 mM de chlorure de sodium, 5 mM de chlorure de potassium, 5 mM EDTA et 0,35 % wt/vol de sérum bovin [BSA], pH = 6,5) pour prévenir la coagulation du sang dans les tubes. Utilisez une nouvelle seringue pour remplir les tubes d’écoulement avec un tampon HEPES (132 mM de chlorure de sodium, 20 mM HEPES, 6 mM de chlorure de potassium, 1 mM de chlorure de magnésium, 1% BSA, et 5,5 mM D-glucose, pH = 7,4) et le connecter soigneusement avec un connecteur Luer en forme de coude à la microslide remplie d’EC en milieu. Tout en attachant les connecteurs aux microcanaux, essayez d’empêcher la formation de bulles d’air dans la diapositive. Les bulles endommageront l’endothélium et influenceront les résultats de votre expérience. Retirez complètement la mémoire tampon de lavage et ne laissez pas la mémoire tampon entrer en contact avec les cellules, car cela inhibera la coagulation. Configurer le système de flux comme indiqué dans la figure 1E. Prenez 2 mL de tampon de lavage dans une seringue de 20 mL et rincez-la pour éviter la coagulation lorsque le sang pénètre dans la seringue. Insérez la seringue vide dans la pompe à seringues et connectez le tube de sortie avec un connecteur Luer femelle à cette seringue. Mettre le tube d’entrée dans un récipient contenant le sang humain préparé. Allumez la pompe à seringues et calculez le débit. Les profils d’écoulement suivent un motif parabolique en hauteur. En supposant que le sang agit comme un liquide newtonien, utilisez la formule suivante pour calculer le débit. (Équation 1)Oùτ = stress de cisaillement η = viscosité dynamique Q = débit volumétrique h = hauteur du canal w = largeur du canal REMARQUE : Pour le flux artériel pulmonaire avec du sang dans les microslides commerciaux à 6 canaux de dimensions rectangulaires de 0,4 mm de hauteur et de 3,5 mm de largeur, un débit volumétrique de 25 mL/h a été utilisé pendant 5 min. En raison des différences dans les dimensions des canaux de flux sur mesure, ces dynamiques changeront également. Ajuster les variables pour vous assurer que le stress de cisaillement est égal. Définissez le diamètre de la seringue de 20 mL à 19,05 mm et définissez le programme de retrait. Tirer le sang à travers le canal recouvert de cellules par l’application d’une pression négative garantira des taux de cisaillement constants et des dommages minimes à la couche cellulaire. 5. Mise en place du microscope pour l’acquisition d’images Utilisez un objectif 20x et placez le microslide sur la scène du microscope fluorescent de contraste de phase inversée. Démarrez le logiciel de microscope pour déplacer la scène dans la direction Z pour se concentrer sur la monocouche cellulaire. Sélectionnez une région d’intérêt (ROI) au début, au milieu et à la fin de chaque canal de flux. Le début et l’extrémité doivent être à au moins 3 mm de l’entrée et de la sortie du chenal. Réglez les filtres fluorescents bleus, verts et rouges avec une puissance laser et une intensité lumineuse qui montre un fond minimal. 6. Perfusion de sang entier sur les PAEC Une fois que tout est connecté comme dans la figure 1E et que le microscope est prêt à être enregistré, poussez Start pour enregistrer une vidéo. Appuyez Sur Démarrer sur la pompe à seringues pour perfuser le sang sur l’endothélium. Dès que le sang commence à couler sur l’endothélium, acquérir des images avec les canaux actifs présélectionnés et les positions de retour sur investissement tous les 15 s pendant 5 min. Après 5 min de perfusion, terminer l’enregistrement et arrêter la pompe à seringues. Démonter la chambre d’écoulement et enlever très soigneusement le tube. Souvent, une bulle d’air se forme si cela se fait avec trop de force. Essayez d’éviter cela, car cela va rincer l’endothélium. 7. Fixation et post-analyse REMARQUE : Pour exclure l’adhérence faussement positive de plaquette par dommages endothéliales dus à l’expérience de perfusion, il est nécessaire de caractériser les cellules endothéliales pour leur formation d’écart et monocouche. Cela peut être fait par la coloration régulière d’immunofluorescence pour ve-cadhérine. Après perfusion et démontage du tube, laver le canal microfluidique avec HEPES. Pipette HEPES dans le canal afin qu’il pousse le sang à la sortie. Retirer l’excédent avec une autre pipette. En option, lavez le canal avec pbs++ (avec 0,5 mM de chlorure de magnésium et 0,9 mM de chlorure de calcium) pour prévenir les précipitations de supernatant de protéines. Cela réduit l’arrière-plan. Cependant, une étape de lavage supplémentaire peut changer le comportement cellulaire et la morphologie qui pourraient influencer l’imagerie post-analyse. Retirer le HEPES et fixer l’endothélium avec des plaquettes adhérentes et la fibrine déposée en pipeting 37 °C réchauffé 4% paraformaldéhyde (PFA) dans le canal et incuber pendant 15 min à RT.REMARQUE : Soyez très prudent lors de la fixation de la microfluidique sur mesure car ces canaux sont encore plus petits, ce qui provoque des forces de cisaillement plus élevées dans le canal à chaque étape de manipulation. Retirez la PFA du canal et lavez 3x avec PBS. Les microslides sont maintenant prêts pour un protocole de coloration standard pour caractériser les marqueurs de cellules endothéliales tels que VE-cadhérine, CD31, P-selectin ou intégrines, CD42b pour les plaquettes adhérentes, ou CD45 pour les leucocytes. Après la coloration, prenez au moins cinq images avec un microscope confocal régulier pour caractériser la colocalisation. 8. Analyse d’image Ouvrez une image d’analyse de flux contenant soit des plaquettes fluorescentes ou de la fibrine fluorescente dans ImageJ. Faites glisser l’image de choix sur ImageJ. L’image est prise en couleur RGB. Pour l’analyse, une image 8 bits est préférée, alors transformez l’image en 8 bits : Image | Type | 8 bits. Pour minimiser l’arrière-plan, soustrayez avec un paraboloïde coulissant, où une boule de roulement calcule et soustrait localement les pixels d’arrière-plan de l’image d’origine : Processus | Soustrayez l’arrière-plan | Rayon de balle roulante = 50 pixels | Paraboloide coulissante.REMARQUE : La taille de l’image est définie en pixels. Toutefois, pour mesurer la zone, il est nécessaire de fixer l’échelle. Lorsque les images sont prises avec un objectif 20x avec une ouverture numérique de 0,45, le microscope a une échelle de 2 pixels par μm. La plupart du temps, les informations nécessaires pour définir l’échelle sont stockées dans les métadonnées de l’image et peuvent être automatiquement utilisées par ImageJ : Analyser | Définir l’échelle. Fixez un seuil pour définir les plaquettes adhérentes ou la fibrine déposée. Utilisez la méthode Triangle et le seuil s’ajustera automatiquement : Image | Ajuster | Seuil. Analyser la zone couverte par les plaquettes ou la fibrine avec la commande Analyser les particules. Définir la taille à 2-Infinity, car la taille minimale d’une plaquette est de 2 μm : Analyser | Analyser les particules. Les résultats fourniront la superficie totale en μm2,avec la taille moyenne des agrégats en μm2 et le pourcentage de surface couverte.