JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

In Vitro Microfluidic Disease Model to Study Whole Blood-Endothelial Interactions and Blood Clot Dynamics in Real-Time

Published: May 24, 2020
doi:
10.3791/61068
, , , , , ,
1Department of Pulmonary Diseases, Amsterdam UMC,VU University Medical Center, Amsterdam Cardiovascular Sciences (ACS), 2BIOS Lab-on-a-Chip group,University of Twente, 3Applied Stem Cell Technologies Group,University of Twente, 4Department of Cardio-thoracic Surgery, Amsterdam UMC,VU University Medical Center, 5Institute of Physiology,Charité-Universitätsmedizin, 6German Heart Center

Summary

We presenteren een in vitro vasculaire ziekte model om hele bloed interacties met patiënt-afgeleide endotheel te onderzoeken. Dit systeem maakt het mogelijk om tromboogene eigenschappen van primaire endotheelcellen onder verschillende omstandigheden te bestuderen. De methode is vooral geschikt om in situ tromboïgeniteit en antistollingstherapie te evalueren tijdens verschillende fasen van stolling.

Abstract

De vorming van bloedstolsels omvat complexe interacties tussen endotheelcellen, hun onderliggende matrix, verschillende bloedcellen en eiwitten. Het endotheel is de primaire bron van veel van de belangrijkste hemostatische moleculen die bloedplaatjes aggregatie, stolling en fibrinolyse controleren. Hoewel het mechanisme van trombose al tientallen jaren wordt onderzocht, richten in vitrostudies zich voornamelijk op situaties van vasculaire schade waarbij de subendothelial matrix wordt blootgesteld, of op interacties tussen cellen met enkele bloedbestanddelen. Onze methode maakt het mogelijk om interacties tussen volbloed en een intact, samenvloeiend vasculair celnetwerk te bestuderen.

Door gebruik te maken van primaire menselijke endotheelcellen biedt dit protocol de unieke kans om de invloed van endotheelcellen op trombosedynamiek te bestuderen en geeft het waardevolle inzicht in de pathofysiologie van trombotische ziekte. Het gebruik van op maat gemaakte microfluïde stroomkanalen maakt toepassing van ziektespecifieke vasculaire geometrieën en modelspecifieke morfologische vasculaire veranderingen mogelijk. De ontwikkeling van een trombus wordt in real-time en kwantitatief geregistreerd door bloedplaatjesver hechting en fibrinafzetting. Het effect van endotheelfunctie in veranderde trombusdynamica wordt bepaald door postanalyse door immunofluorescentie kleuring van specifieke moleculen.

De representatieve resultaten beschrijven de experimentele installatie, gegevensverzameling en gegevensanalyse. Afhankelijk van de onderzoeksvraag kunnen parameters voor elke sectie worden aangepast, waaronder celtype, schuifsnelheden, kanaalgeometrie, medicamenteuze therapie en postanalyseprocedures. Het protocol wordt gevalideerd door de vorming van trombus op het longslagader-entheel van patiënten met chronische trombo-embolische ziekte te kwantificeren.

Introduction

Het endotheel vormt de binnenste cellaag van bloedvaten en scheidt bloed van het omliggende weefsel. Het is beschreven als een dynamisch orgaan dat actief reguleert zijn micro-omgeving en reageert op externe stimuli1. Vanwege het directe contact met stromend bloed is het endotheel cruciaal in de controle van hemostase en trombose en is het de primaire bron van veel van de belangrijkste regulerende moleculen die bloedplaatjesaggregatie, stolling en fibrinolyse2controleren. Gezonde, niet-geactiveerde endotheelcellen (EC) produceren verschillende moleculen die de activering van bloedplaatjes tegengaan en stolling en trombusvorming voorkomen om de bloedstroom te handhaven, zoals prostacyclin, trombomodulin of weefselfactorrouteremmer (TFPI)2,3. Dit voorkomt de hechting van bloedplaatjes, bloedplaatjes aggregatie, en trombus vorming. Letsel of activering van de vaatwand resulteert in een procoagulant endotheel fenotype dat gelokaliseerde bloedplaatjesver hechting en stolselvorminginitieert 2,4. Bij endotheelactivering houden bloedplaatjes zich aan von Willebrand Factor (VWF), een multimerisch eiwit dat vrijkomt uit EC’s, of op blootgestelde bindingsplaatsen van de onderliggende subendothelial matrix. Vervolgens initiëren moleculaire veranderingen in bloedplaatjes en de blootstelling aan weefselfactor (TF) de activering van het stollingssysteem, wat trombbusvorming induceert door fibrinpolymerisatie5,6. Samen vormt het resulterende stolsel de basis voor wondsluiting door re-endotheelisatie7. Verstoringen van het stollingssysteem kunnen leiden tot bloedingsstoornissen, zoals de ziekte van Von Willebrand, hemofilie of trombose, die vaak het gevolg zijn van een geïmreguleerde pro- en antitrombotische balans van het endotheel hemostatische pad2,3.

Het proces van hemostase vindt plaats in zowel de arteriële als de veneuze circulatie. Echter, de mechanismen die ten grondslag liggen aan arteriële en veneuze trombose zijn fundamenteel verschillend. Terwijl arteriële trombose, zoals te zien is in ischemische hart-en vaatziekten, wordt meestal gedreven door de breuk van een atherosclerotische plaque onder omstandigheden van hoge shear stress, veneuze trombose ontwikkelt zich meestal bij afwezigheid van endotheelletsel in een toestand van stasis8,9,10. Een diepe ader trombus kan emboliseren en reizen naar de longslagaders, waar het veroorzaakt een longembolie. Dit kan leiden tot chronische vasculaire obstructies die leiden tot aanzienlijke verminderde functionele capaciteiten die de ontwikkeling van chonic longziekten kunnen bevorderen, waaronder de ontwikkeling van chronische trombo-embolische pulmonale hypertensie (CTEPH)11,12,13,14. CTEPH wordt gekenmerkt door verhoogde longdruk als gevolg van obstructies van de longslagaders door trombo-embolisch materiaal na ten minste drie maanden antistollingstherapie15. Naast longsembololie wordt gepostuleerd dat het longendotheel een protrombotische omgeving in CTEPH biedt die in situ trombose en chronische obstakels van de pulmonale slagaders vergemakkelijkt, waardoor de toename van de bloeddruk ontstaat die uiteindelijk kan leiden tot hartfalen, indien onbehandeld16,17.

In de afgelopen jaren hebben verschillende studies geleid tot de ontwikkeling van tests om de vorming van trombus te onderzoeken door bloedplaatjesfunctie en stolling te meten18. De meesten van hen bestuderen echter de interactie van volbloed met enkele extracellulaire matrixcomponenten zoals collageen of fibrins, of endotheelfunctie in interactie met enkele bloedbestanddelen, zoals endotheelplaatjes of endotheel-leukocyte interactie19,20,21,22. Deze tests worden meestal uitgevoerd met menselijke navelstrengader endotheelcellen (HUVEC), omdat deze cellen gemakkelijk kunnen worden verkregen. Hemostatische genen worden echter differentieel uitgedrukt over de vasculaire boom, vaattypen en orgaansystemen23,24, waardoor het gebruik van HUVECs om endotheelcellen te vertegenwoordigen die betrokken zijn bij arteriële trombose of longembolie problematisch23.

Naast ec-plasticiteit kunnen ziektespecifieke hemodynamische veranderingen en veranderingen in vasculaire morfologie de vorming van trombus bij het normale endotheel25bevorderen. Hogere afschuifsnelheden, als gevolg van lokale vasoconstrictie of veranderingen in de vaatgeometrie, bijvoorbeeld, kunnen leiden tot acute trorombusvorming, waardoor een stenose ontstaat die de stopzetting van de bloedstroom versnelt26. Het gebruik van op maat gemaakte micro-engineered flow kanalen maakt het mogelijk om specifiek vasculaire geometrieën te ontwerpen die representatief zijn voor de (patho)biologie. Op deze manier is het mogelijk om het effect van lokale biomechanische krachten op gezonde of zieke EC27te bestuderen.

Er zijn antistollingstherapieën beschikbaar voor het richten van verschillende fasen en moleculen in de stollingscascade, die allemaal bijzondere risico’s en voordelen opleveren die specifiek kunnen zijn voor bepaalde aandoeningen. De in dit artikel beschreven benadering van ziektemodellering is bijzonder geschikt om de effecten van verschillende antistollings- en antiplaattherapieën op trombusdynamica te testen.

Het doel is om een model van trombose te presenteren dat primaire ELE’s bevat, wat een veelzijdig model oplevert dat geschikt is voor de analyse van verschillende vormen van trombose, afhankelijk van het type primaire ED’s dat wordt gebruikt. Ter illustratie gebruikten we longslagader endotheelcellen van CTEPH-patiënten in interactie met vol menselijk bloed dat alle componenten bevat die betrokken zijn bij trombbusvorming (bloedplaatjes, leukocyten, erytrocyten, stollingseiwitten en cofactoren). Deze aanpak kan worden toegepast in commerciële parallelle stroomkanalen of in op maat gemaakte microfluïde stroomkanalen met een specifiek vasculair ontwerp. Als zodanig kan het model uiteindelijk worden gebruikt in de studie van trombusvorming en -resolutie, voor de beoordeling van ontstekingsreacties bij ziektemodellering, voor antiplatelet- of antistollingstherapie en uiteindelijk voor gepersonaliseerde geneeskunde.

Deze studie beschrijft de isolatie van primaire menselijke longslagader endotheelcellen. Voor de isolatie van andere primaire menselijke endotheelceltypes verwijzen we naar eerder gepubliceerde methoden, waaronder longmicrovasculaire endotheelcellen25, menselijke navelader endotheelcellen28en bloedcirculatievormende endotheliale koloniecellen Figuur 1A29.

Protocol

Deze studie is goedgekeurd door de institutional Medical Ethical Review Board van het VU Medisch Centrum Amsterdam, Nederland (METC VUmc, NL69167.029.19). Primaire celisolatie en bloedverzameling van menselijke proefpersonen werd uitgevoerd nadat schriftelijke geïnformeerde toestemming was verkregen in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki. 1. Isolatie en cultuur van primaire menselijke longslagaderlijke endotheelcellen (PAEC) Warm volledig endotheelcelmedium (cECM) aangevuld met 5% foetale runderserum (FBS), 1% penicilline/streptomycine (P/S), 1% endotheelcelgroeisupplementen (ECGS) en 1% niet-essentiële aminozuren (NEAA), in een waterbad bij 37 °C. Steriliseren chirurgische schaar, tangen, en een scalpel met ofwel een 120 °C warmte sterilisator of 70% ethanol. Voer de isolatie van PAEC uit in een laminaire stroomkast onder steriele omstandigheden. Coat een hoge affiniteitscelbinding 60 mm celkweekschotel (zie Tabel van Materialen)met 2 mL van 5 μg/mL fibronectine en incubate bij 37 °C gedurende ten minste 15 min. Verkrijg longslagader (PA) weefsel van chirurgie(bijvoorbeeld, lobectomie of longeinderectomie), bewaar in 4 °C koude koordbuffer (4 mM kaliumchloride, 140 mM natriumchloride, 10 mM HEPES, 11 mM D-D-D-, en 1% P/S, pH = 7.3), en houd ijs isolatie tot aan. Isoleer endotheelcellen van PA binnen 2 uur na weefselverwijdering. Neem de PA met tangen en zet het in een 10 cm petrischaaltje te wassen met PBS. Als de PA is nog steeds een ring, snijd de longslagader open met een schaar. Wees zeer voorzichtig om de binnenste laag van het vat niet aan te raken met het gereedschap, omdat het endotheel gemakkelijk kan worden beschadigd en/of verwijderd. Verwijder de fibronectine uit de celkweekschaal en voeg 4 mL cECM-medium toe. Neem het PA-weefsel met tangen en plaats het in het medium. Schraap ondertussen voorzichtig de binnenste laag van het vat in het medium met een scalpel. Vaak zijn lipideaccumulaties te zien in de vaatwand. Probeer deze weg te laten, omdat ze van invloed zijn op de uitgroei van cellen. Houd de cellen in de cultuur tot kleine kolonies van endotheelcellen beginnen te verschijnen. Vervang het medium om de andere dag. Als fibroblasten de cultuur vervuilen, zuiver deze met magnetische affiniteitcelscheiding voor CD144 met een kit, in overeenstemming met de instructies van de fabrikant (zie Tabel van Materialen). Gebruik de methode met twee kolommen voor de eerste zuivering en de methode met één kolom voor elke opeenvolgende zuivering. Over het algemeen wordt een cultuur zuiver gedefinieerd wanneer stromingscytometrie ≤10% vervuilende cellen detecteert. Splits cellen in verhoudingen van 1:3 tot 1:4 totdat voldoende PAECs worden gekweekt voor experimenteel gebruik. Wanneer PAECs klaar zijn voor gebruik, gaat u verder met de volgende stap. Na zuivering moeten primaire endotheelcellen worden gekarakteriseerd voor de aanwezigheid van EG-specifieke markers(bijvoorbeeldVE-cadherin, CD31, TIE2) en voor de afwezigheid van gladde spiercellen (α-SMA), fibroblast (vimentin) en epitheliale (cytokeratine) markers(figuur 1B). 2. Bereiding van stroomkamers en PAEC-monolagen OPMERKING: Gebruik afhankelijk van de hypothese ofwel de commercieel beschikbare stroomkamers (zie Tabel van Materialen en Figuur 1C-optie A, stap 2.1 van het protocol) of een op maat gemaakte microfluïde stroomkamer(figuur 1C-optie B, stap 2.2 van het protocol). Celzaaien van endotheelmonolagen in commercieel verkrijgbare microglijbanenOPMERKING: Commercieel beschikbare stroomkamers zijn gemakkelijk te gebruiken en bieden een laminaire stroompatroon in het hele kanaal dat kan worden gebruikt bij hoge schuifsnelheden. Deze microglijbanen zijn ontworpen om parallelle runs met meerdere kanalen mogelijk te maken en zorgen voor een nauwkeurig en reproduceerbaar stroomprofiel. Omdat ze zijn geoptimaliseerd voor omgekeerde microscopie, is het mogelijk om fluorescerende beelden van hoge kwaliteit vast te leggen. Bovendien zijn verschillende afmetingen van de stroomkamers beschikbaar in verschillende kanaalgroottes of geometrieën. De 6-well flow kanalen hebben de voorkeur voor deze test, omdat deze microslides hebben kleine afmetingen en kunnen multiparallel loopt. Voor de vacht van één kanaal van een 6-well flow slide (3,5 mm breedte x 0,4 mm hoogte x 17 mm lengte) gebruikt u 30 μL van 0,1% gelatine per kanaal en incubeer bij 37 °C gedurende ten minste 15 minuten. Om één kanaal te zaaien, probeer je 10 cm2 samenvloeiing van samenvloeiings-PAECs en spin je 300 x g gedurende 7 minuten op kamertemperatuur (RT). Hang PAECs op in 600 μL cECM en pipet 100 μL (1,5 cm2 ) celsuspensie in één kanaal. Dit dekt de microslide door capillaire werking. Als het te langzaam gaat, zullen luchtbellen vormen. Vermijd de vorming van luchtbellen met behulp van een beetje meer kracht bij het pipetten.OPMERKING: Celdichtheid beïnvloedt endotheel fenotype. Een totaal van 1,5 cm2 van confluent cellen per kanaal is overvloeiend, omdat het kanaal een oppervlakte van 0,6 cm2heeft. Voordat u met het experiment begint, kweekt u deze cellen nog 6 dagen binnen de kanalen totdat ze de maximale samenvloeiing bereiken. Voeg nog eens 50 μL cECM toe aan het kanaal om voldoende medium te bieden voor girubatie ‘s nachts bij 37 °C, 5% CO2. Verander het medium de volgende dag om niet-gebonden cellen weg te spoelen. Houd de cellen 6 dagen in cultuur op 37 °C, 5% CO2 om de PAEC in staat te stellen een stevige, confluent monolayer te vormen. Verander het medium om de andere dag met 150 μL cECM. Behandel de PAEC op dag 7 met 100 μL van 1 μM histamine in ECM en 1% FBS gedurende 30 minuten vóór de test. De stimulus kan worden gekozen ad libitum. TNF-α wordt bijvoorbeeld vaak gebruikt als ontstekingsactivator. Bereiding van op maat gemaakte microfluïde stroomkamersOPMERKING: Op maat gemaakte flowkamers zijn aangepast aan de behoeften van de gebruiker, omdat de afmetingen en geometrieën eenvoudig kunnen worden gewijzigd in voorkeur. Om bijvoorbeeld een fysiologisch relevanter vat na te bootsen, kan een stenose worden geïntroduceerd (figuur 1D). Deze aanpak maakt het gebruik van zeer kleine bloedvolumes zoals te zien in microvasculaire ziekte. Zachte lithografie van polydimethylsiloxaan (PDMS) met behulp van wafers met patroon Combineer PDMS uithardingsmiddel en prepolymeer op een microbalans op een 1:10 verhouding en grondig mengen met een general purpose lab mixer. Om de resulterende luchtbellen te verwijderen, ontgassen de PDMS in een desiccator voor ongeveer 1 uur. Bekleed een glazen petrischaal met aluminiumfolie en voeg een paar druppels water toe voordat je de wafer in de gevoerde petrischaal plaatst. De wafer dient als de mal voor het op maat gemaakte kanaal.LET OP: De wafels of mallen worden verzorgd door de clean room faciliteiten. Negatieve fotoresist is patroon op wafers te creëren uitstekende kanaal-achtige functies met de volgende typische afmetingen: 300 μm breedte x 270 μm hoogte x 14 mm lengte. Giet de ontgaste PDMS op de wafer geplaatst in een glazen petrischaal. Ontgassen de PDMS gegoten op de wafer in een desiccator voor een extra 15 min om eventuele bubbels die kunnen hebben gevormd tijdens het gieten te verwijderen. Verwijder de petrischaal met de mal en PDMS uit de desiccator en plaats deze minimaal 4 uur in een oven van 60 °C om de PDMS te kruisen. Voorbereiding van cross-linked PDMS voor hechting aan glazen glijbanen Verwijder schimmel en cross-linked PDMS uit de oven en ga naar een cross-flow kap voor stofvrije hantering van de PDMS. Verwijder alle PDMS van de onderkant van de mal met behulp van een scalpel en verwijder de bovenste plaat van de cross-linked PDMS uit de mal. Lijn de blootgestelde patroon PDMS plaat met plakband om te voorkomen dat stofdeeltjes in contact komen met de PDMS kanalen. Snijd de PDMS-chips op maat en punch 1 mm diameter inlaten en uitlaten met behulp van een biopsie punch. Sterilisatie en hechting van PDMS microfluïde kanalen en glazen platen Schone glazen microscopie glijdt door grondig spoelen met ethanol, gevolgd door een isopropyl alcohol spoeling. Na elke spoeling, grondig drogen van de glijbanen met een stikstof pistool.OPMERKING: Als alternatief kunnen afdekslipjes worden gebruikt als de analyse wordt uitgevoerd met behulp van een confocale microscoop. Open de plasmakamer en laad de gereinigde microscopieglijbanen en microfluïde chips zonder de beschermende tape. Sluit de kamer, zuiver met stikstof gedurende 1 min, en vul de kamer met gefilterde lucht tot een druk van 500 mTorr is bereikt. Stel de glazen platen en PDMS-chips voor 40 s bloot aan het plasma met een vermogen van 50 W en een frequentie van 5 kHz. Na blootstelling aan het plasma, onmiddellijk binden de glazen dia’s en microfluïde chips. Bewaar de apparaten in steriele petrischaaltjes. Celzaaien van endotheelmonolagen in microfluïde kanalen Coat het op maat gemaakte microkanaal door 10 μL van 0,1 mg/mL collageen type I of 0,1% gelatine per kanaal te pipetten en 30 minuten bij 37 °C te plassen. Om vier microkanalen te zaaien, probeer je 25 cm2 confluent PAECs en spin je naar beneden op 300 x g gedurende 7 minuten bij RT.OPMERKING: Slechts een klein percentage van de cellen zal hechten aan het oppervlak. Daarom is het noodzakelijk om een overmaat aan cellen te gebruiken om een confluente monolaag te bereiken. Schors PAECs in 20 μL cECM en gebruik 5 μL celsuspensie voor elk kanaal. Door de kleine kanaalafmetingen vullen de capillaire krachten de microglijbaan en voorkomen ze luchtbelvorming. Verander medium na 3-4 uur om niet-gebonden cellen te wassen. Houd de cellen 6 dagen in cultuur zodat de PAEC een stevige, confluent monolayer kan vormen. Vanwege het kleine volume, verander het medium elke dag met 150 μL cECM. Laat de pipettepunt gevuld met medium in de inlaat en doe een lege punt in de uitlaat. Dit zal dienen als een reservoir dat voldoende voedingsstoffen en groeifactoren aan de cellen en voorkomen dat de dia uitdrogen. Op dag 7 bevlekken de kernen in de levende cellen met Hoechst (1:5.000 in cECM) en incubeer gedurende maximaal 10 min bij 37 °C en 5% CO2. Was voorzichtig 3x met cECM en behandel met 1 μM histamine in ECM + 1% FBS gedurende 30 minuten voorafgaand aan de test. De stimulus kan worden gekozen ad libitum. TNF-α wordt bijvoorbeeld vaak gebruikt als ontstekingsactivator. Gebruik 1,27 mm diameter 90° schuine roestvrijstalen connectoren om de uitlaat van de PDMS-chips aan te sluiten op buizen. 3. Bereiding van menselijk volbloed Trek veneuze bloed van proefpersonen in 0,109 M natriumcitraat antistollingsmiddel. Dit kan afkomstig zijn van gezonde of zieke proefpersonen die geen antistollingsbehandeling krijgen. Draai de buizen voorzichtig om om te mengen. De totale hoeveelheid bloed die nodig is voor een experiment hangt voornamelijk af van de geselecteerde stroomsnelheid. Met een stroomsnelheid van 25 mL/h, in ibidi 6-well glijbanen, is een totaal volume van 2 mL met een beetje overtollig om kuipen en stroomkanaal te vullen voldoende. Breng het bloed over naar een buis van 50 mL en voeg Calcein AM (1:10.000) toe om bloedcellen en Alexa488-fibrinogen (15 μg/mL) fluoresceren om autologe fibrinogen te vervoegen. Laat het bloed 15 minuten bij 37 °C uitbroeden om volledige absorptie mogelijk te maken. Verdun het bloed 1:1 met recalcificatiebuffer (154 mM natriumchloride, 10,8 m trinatriumcitraat, 2,5 mM calciumchloride en 2 mM magnesiumchloride) vlak voor het begin van het experiment.OPMERKING: Hemodilution met een maximum van 50% had geen invloed op de stollingsreactietijd30. Bovendien kan menselijk bloed virussen en andere middelen bevatten. Werken met bloedmonsters, daarom, draagt een risico van infectie. Het wordt ten zeerste aanbevolen om passende veiligheidsmaatregelen te nemen en het materiaal zorgvuldig te behandelen. 4. Het instelen van het stroomsysteem Voor het aansluiten van de buizen spoelt u de stroombuizen af met een spuit van 20 mL gevuld met wasbuffer (36 mM citroenzuur, 103 mM natriumchloride, 5 mM kaliumchloride, 5 mM EDTA en 0,35% wt/vol runderserum albumin [BSA], pH = 6,5) om stolling van het bloed in de buizen te voorkomen. Gebruik een nieuwe spuit om de stroombuizen te vullen met HEPES-buffer (132 mM natriumchloride, 20 mM HEPES, 6 mM kaliumchloride, 1 mM magnesiumchloride, 1% BSA en 5,5 mM D-glucose, pH = 7,4) en sluit het voorzichtig aan met een elleboogvormige Luer-connector met de micro-glijbaan gevuld met EC-medium. Probeer tijdens het bevestigen van de connectoren aan de microkanalen de vorming van luchtbellen in de dia te voorkomen. Bubbels beschadigen het endotheel en beïnvloeden de resultaten van uw experiment. Verwijder de wasbuffer volledig en laat de buffer niet in contact komen met de cellen, omdat dit de stolling zal remmen. Stel het stroomsysteem in zoals weergegeven in figuur 1E. Neem 2 mL wasbuffer in een spuit van 20 mL in en spoel af om stolling te voorkomen wanneer het bloed in de spuit komt. Steek de lege spuit in de spuitpomp en sluit de uitlaatbuis met een vrouwelijke Luer-connector aan op deze spuit. Doe de inlaatbuis in een container met het bereide menselijke bloed. Schakel de spuitpomp in en bereken de debietsnelheid. Stroomprofielen volgen een parabolisch patroon in hoogte. Ervan uitgaande dat het bloed fungeert als een Newtoniaanse vloeistof, gebruik dan de volgende formule om de stroomsnelheid te berekenen. (Vergelijking 1)Waarτ = schuifstress η = dynamische viscositeit Q = volumetric flow rate h = kanaalhoogte w = kanaalbreedte OPMERKING: Voor de longslagaderstroom met bloed in de commerciële 6-kanaals microslides met rechthoekige afmetingen met een hoogte van 0,4 mm en een breedte van 3,5 mm werd gedurende 5 min een volumetrische stroomsnelheid van 25 mL/h gebruikt. Door de verschillen in de afmetingen van de op maat gemaakte stroomkanalen zal deze dynamiek ook veranderen. Pas de variabelen aan om ervoor te zorgen dat de afschuifspanning gelijk is. Definieer de diameter van de 20 mL spuit tot 19,05 mm en stel het programma in op Terugtrekken. Het bloed door het met cellen bedekte kanaal door toepassing van een negatieve druk garandeert constante afschuifsnelheden en minimale schade aan de cellaag. 5. Het opzetten van de microscoop voor het verwerven van afbeeldingen Gebruik een 20x doelstelling en plaats de microslide op het podium van de omgekeerde fase contrast fluorescerende microscoop. Start de microscoopsoftware om het podium in de Z-richting te verplaatsen om zich te concentreren op de celmonolaag. Selecteer een regio van belang (ROI) in het begin, midden en einde van elk stroomkanaal. Het begin en het einde moeten ten minste 3 mm verwijderd zijn van de inlaat en uitlaat van het kanaal. Stel de blauwe, groene en rode tl-filters in met een laserkracht en lichtintensiteit die een minimale achtergrond weergeven. 6. Perfusie van vol bloed via PAECs Nadat alles is aangesloten zoals in figuur 1E en de microscoop klaar is voor opname, drukt u op Start om een video op te nemen. Druk Op de spuitpomp start je om het bloed over het endotheel te doorsmenten. Zodra het bloed begint te stromen over het endotheel, verwerven beelden met de vooraf geselecteerde actieve kanalen en ROI posities om de 15 s voor 5 min. Na 5 minuten perfusie, afwerking opname en stop de spuitpomp. Demontage van de stroomkamer en verwijder de slang zeer zorgvuldig. Vaak zal zich een luchtbel vormen als dit met te veel kracht wordt gedaan. Probeer dit te voorkomen, want dit spoelt het endotheel weg. 7. Fixatie en analyse na analyse OPMERKING: Om vals-positieve bloedplaatjesver hechting door endotheelschade als gevolg van het perfusie-experiment uit te sluiten, is het noodzakelijk om de endotheelcellen te karakteriseren voor hun gapvorming en monolaag. Dit kan worden gedaan door regelmatige immunofluorescentie kleuring voor VE-cadherine. Na perfusie en demontage van de slang, was het microfluïde kanaal met HEPES. Pipette HEPES in het kanaal, zodat het bloed naar de uitlaat zal duwen. Verwijder het overtollige met een andere pipet. Was het kanaal optioneel met PBS++ (met 0,5 mM magnesiumchloride en 0,9 mM calciumchloride) om neerslag van eiwitsupernatant te voorkomen. Dit vermindert de achtergrond. Een extra wasstap kan echter het cellulaire gedrag en de morfologie veranderen die de beeldvorming na de analyse kunnen beïnvloeden. Verwijder de HEPES en bevestig het endotheel met aangehangen bloedplaatjes en gedeponeerd fibrin door pipetten 37 °C opgewarmd 4% paraformaldehyde (PFA) in het kanaal en incubeer gedurende 15 minuten op RT.OPMERKING: Wees extra voorzichtig bij het repareren van de op maat gemaakte microfluidics omdat deze kanalen nog kleiner zijn, wat hogere afschuifkrachten in het kanaal veroorzaakt tijdens elke behandelingsstap. Haal de PFA uit het kanaal en was 3x met PBS. De microslides zijn nu klaar voor een standaard kleuringsprotocol om endotheelcelmarkeringen zoals VE-cadherine, CD31, P-selectin of integrins, CD42b voor aanhangende bloedplaatjes of CD45 voor leukocyten te karakteriseren. Na het bevlekken, neem ten minste vijf beelden met een regelmatige confocale microscoop te karakteriseren colocalisatie. 8. Beeldanalyse Open een stroomtestafbeelding met fluorescerend gelabelde bloedplaatjes of fluorescerende fibrin in ImageJ. Sleep afbeelding naar ImageJ. De afbeelding is genomen in RGB-kleur. Voor analyse heeft een 8-bits afbeelding de voorkeur, dus verander de afbeelding in 8-bits: Afbeelding | Type | 8-bits. Om de achtergrond tot een minimum te beperken, trek je af met een glijdende paraboloïde, waarbij een rollende bal lokaal achtergrondpixels berekent en aftrekt van de oorspronkelijke afbeelding: Proces | Achtergrond aftrekken | Straal van de rollende bal = 50 pixels | Glijdende paraboloïde.OPMERKING: De afbeeldingsgrootte wordt gedefinieerd in pixels. Om het gebied te meten, is het echter noodzakelijk om de schaal in te stellen. Wanneer de beelden worden genomen met een 20x doelstelling met een numeriek diafragma van 0,45, heeft de microscoop een schaal van 2 pixels per μm. Meestal wordt de benodigde informatie om de schaal in te stellen opgeslagen in de metadata van de afbeelding en kan automatisch worden gebruikt door ImageJ: Analyze | Schaal instellen. Stel een drempel in om aangehangen bloedplaatjes of gedeponeerde fibrine te definiëren. Gebruik de methode Driehoek en de drempelwaarde wordt automatisch aangepast: Afbeelding | Aanpassen | Drempelwaarde. Analyseer het gebied dat door de bloedplaatjes of fibrin wordt bedekt met het commando Deeltjes analyseren. Stel de grootte in op 2-Oneindigheid, omdat de minimale grootte van een bloedplaatje 2 μm is: Analyseren | Deeltjes analyseren. De resultaten geven het totale areaal in μm2,met een gemiddelde grootte van de aggregaten in μm2 en het percentage van het overdekte gebied.

Representative Results

De representatieve resultaten kunnen worden onderverdeeld in drie delen, die elk de respectieve stappen van experimentele installatie, gegevensverzameling en gegevensanalyse vertegenwoordigen. Afhankelijk van de onderzoeksvraag kunnen parameters voor elke stap worden gewijzigd. De gepresenteerde gegevens worden toegepast om de invloed van het endotheel op de trombusvorming te bestuderen. Experimentele installatieHet is algemeen bekend dat endotheelcellen zeer heterogeen zijn in structuur en functie, afhankelijk van locatie en tijd, tijdens gezondheid en ziekte23. Verschillende bronnen van endotheelcellen kunnen worden gebruikt om endotheelbloedinteractie te bestuderen, die in dit geval commercieel beschikbaar waren HUVECs en PAECs(figuur 1A). HUVECs zijn de meest gebruikte in laboratoriummodellen, terwijl PAECs zijn patiënt-afgeleide geïsoleerde cellen uit de longslagaders. Bovendien zijn er gevestigde protocollen beschikbaar om microvasculaire endotheelcellen (MVEC) te isoleren van de longcirculatie of bloedcirculatiecellen (ECFC)25,28,29. Na isolatie werden endotheelcellen gekenmerkt door VE-cadherin, CD31 en TIE2-kleuring om een endotheel fenotype te bevestigen. Karakterisering voor de aanwezigheid van αSMA en cytokeratine duidde op het ontbreken van een fibroblast of epitheelachtig fenotype (figuur 1B). Na het verkrijgen van een zeer zuivere populatie van ECs, passage 3-5 cellen werden gebruikt om ofwel een commerciële microslide of op maat gemaakte microfluïde stroomkanalen zaad (Figuur 1C). Hoewel de commercieel verkrijgbare microglijbanen voornamelijk parallelle stroomkamers zijn, of Y-vormige kanalen met specifiek gedefinieerde parameters in hoogte- of bifurcatiehoek, maakt het gebruik van microfluïde dia’s het mogelijk om de experimentele parameters aan te passen aan in vivo geometrie en bloedstroomdynamiek31. Echter, op maat gemaakte microfluidic maten zijn kleiner en hebben de neiging om celverspreiding te beperken en meer celdood32,33induceren . Het gebruik van een overschot aan cellen compenseert het feit dat slechts een klein percentage van de cellen zich zal hechten. Dit werd waargenomen bij de introductie van een stenose, waarbij endotheelcellen een langwerpiger fenotype vertoonden in vergelijking met een parallel microfluïdisch kanaal(figuur 1D). Commerciële stroomkamers hebben een groter oppervlak waar cellen zich aan kunnen binden. Dit vereist minder celnummers voor zaaien. Om endotheelcelbloedinteractie te bestuderen, werd volbloed geperfundeerd over een endotheelmonolaag. Citrated bloed werd verzameld op de dag van het experiment en onmiddellijk voor perfusie recalcified. Cellen werden met histamine gestimuleerd om VWF-afgifte en bloedplaatjes adhesie 30 min vóór perfusie(figuur 1E)34,35te induceren . Vanwege de kleine afmetingen, de op maat gemaakte microfluïde kanalen toegestaan gebruik van kleinere bloedvolumes. GegevensverzamelingOm de vorming van trombus op PAECs te onderzoeken, werden Calcein AM-Red fluorescerend gelabelde bloedcellen en Alexa488-geconjugeerde fibrin gedurende 5 minuten geperfuseerd bij 2,5 dyne/cm2 (Figuur 2A–C). Aanhangende bloedcellen en gedeponeerde fibrine werden gekwantificeerd. Beelden werden verworven om de 30 s en gekwantificeerd met ImageJ. Het was belangrijk om de achtergrond af te trekken om de autofluorescentie van niet-kralen bloedplaatjes te elimineren. Het driehoeksalgoritme voor thresholding is gebruikt om minimale achtergrond te definiëren. Het was toegestaan voor het meten van kleine bloedplaatjes aggregaten (figuur 2D). Naar verwachting was er onder niet-stimulerende omstandigheden geen binding van bloedplaatjes en fibrin aan het endotheel. Om vwf-afgifte en bloedplaatjesbinding te bevorderen, werden PAECs gestimuleerd met histamine, wat resulteerde in een onmiddellijke toename van de bloedplaatjesverkleving die na 2,5 min een plateau bereikte. Op dit moment begonnen bloedplaatjes autocrinefactoren af te scheiden die bloedplaatjesaggregatie en fibrinogen decolleté in fibrine veroorzaakten. Fibrin werd na 3 min gedeponeerd en vormde na 4 min een stabiel aggregaat met bloedplaatjes (figuur 2E). Om te onderzoeken of dit effect kan worden geremd door een direct oraal antistollingsmiddel (DOAC), werd bloed behandeld met 10 nM dabigatran. Dabigatran werd toegevoegd aan de bloedverdunning, waar het factor IIa in de stollingsroute remt en het decolleté van fibrinogen verhinderde om fibrinevezels te vormen. Wanneer met dabigatranbehandeld bloed werd geperfuseerd over gestimuleerde PAECs, kon de stolselvorming direct worden geremd, voornamelijk door fibrindepositie uit te stellen (figuur 2F). GegevensanalyseOm de invloed van verschillende endotheelbronnen op trombusvorming te bestuderen, werden de cellulaire veranderingen op 5 min bloedperfusie geanalyseerd. Het endotheel werd bevestigd en aanhangende bloedplaatjes werden gelabeld met CD42b voordat beeldvorming onder een confocale microscoop. Dit leverde een gedetailleerde analyse op voor colocalisatie van bloedplaatjes en fibrin die kunnen wijzen op disfunctionele stollingsfactoren in het bloed. De invloed van EC op stolselvorming werd bepaald door standaard immunofluorescente kleuring. Endotheel cel-cel contacten werden gehandhaafd, zoals bevestigd door VE-cadherine vlekken, wat aangeeft dat de bloedstolsels gevormd op de top van de endotheel monolaag in plaats van op de onderliggende matrix tussen endothelial hiaten (Figuur 3). Bovendien resulteerde het gebruik van verschillende celbronnen in verschillende patronen van trombivorming op het endotheel. HUVECs zijn veneuze endotheelcellen en vertoonden beperkte bloedplaatjesver hechting en fibrinafzetting, terwijl zieke primaire PAEC van CTEPH-patiënten overvloedige bloedplaatjeshechting en meer fibrinafzetting vertoonde bij histaminestimulatie in vergelijking met gezonde PAEC. Dit suggereert dat het endotheel van CTEPH-patiënten een hogere respons op vasoactivatie vertoont, wat resulteert in verhoogde trombusvorming. Figuur 1: Schematisch overzicht van het protocol. (A) Verschillende bronnen en verschillende soorten endotheelcellen werden geïsoleerd en gekweekt voor gebruik in een microfluïdisch stroomkanaal voor perfusieexperimenten. Representatieve brightfield beelden van verschillende soorten endotheelcellen. Schaalbalk = 50 μm. (B) Geïsoleerde cellen werden gekenmerkt door immunofluorescente kleuring om een endotheel fenotype te bevestigen. Schaalbalk = 50 μm.(C)Cellen kunnen worden gezaaid in commerciële stroomdia’s of op maat gemaakte microfluïde kanalen. (D) Representatieve brightfield beelden van HUVEC gegroeid in verschillende kanaal geometrieën. Schaalbalk = 50 μm. (E) Experimentele opstelling van bloedperfusie-experimenten. Citrated bloed werd verzameld, verdund met zoutbuffer, en geperfundeerd over endotheliale cellen met een spuitpomp. De long- en navelstreng in dit cijfer werden gewijzigd van Servier Medical Art, gelicentieerd onder een Creative Common Attribution 3.0 Generieke Licentie. http://smart.servier.com/ Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 2: Beeldacquisitie en kwantificering van trombusvorming. (A) Representatieve time-lapse beeldvorming van aangehangen Calcein AM-Red gelabelde bloedplaatjes en gedeponeerd Alexa488-geconjugeerde fibrine op 1, 3 en 5 min na gehele bloedperfusie over niet-gestimuleerde PAECs(B)en over histamine gestimuleerd PAECs. (C) Representatieve time-lapse beelden van bloedplaatjes adhesie en fibrin depositie op 1, 3 en 5 min perfusie met volbloed geïncubeerd met dabigatran perfused over histamine-gestimuleerde PAECs. Schaalbalk = 50 μm.(D)Schematisch overzicht van beeldkwantificering in ImageJ. (E) Kwantificering van bloedplaatjes adhesie en fibrin afzetting voor elke 30 s op een niet-gestimuleerd en histamine gestimuleerd endotheel. (F) Kwantificering van het effect van dabigatran op trombusvorming gekwantificeerd door bloedplaatjesver hechting en fibrindepositie. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD, n = 3. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 3: Representatieve confocale beelden van stroomexperimenten om de vorming van trombus in bloedplaatjesver hechting en fibrinafzetting op endotheelcellen te karakteriseren. Endotheel cel-celcontacten werden gekenmerkt door VE-cadherine en gemeten in controle PAECs, patiënt-afgeleide CTEPH PAECs, en HUVEC. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussion

Stolling is een gevolg van het complexe en tijdelijk gecontroleerde samenspel tussen het endotheel en de bloedbestanddelen. Deze in vitro test presenteert een methode om trombogene eigenschappen van endotheelcellen in real-time te onderzoeken. Verschillende soorten primaire menselijke endotheelcellen kunnen worden gebruikt, waardoor in situ trombose op een orgaan- en patiëntspecifieke manier wordt vergemakkelijkt. In deze studie illustreerden we het gebruik van dit protocol waarbij trombogene eigenschappen van PAECs geïsoleerd van gezonde donoren vergeleken met CTEPH-patiënten worden vergeleken. Live trombusvorming werd bestudeerd door perfusie van volbloed van gezonde proefpersonen over histamine-geactiveerd endotheel, terwijl het effect van een DOAC werd getest als een antitrombotisch middel.

Naast het gebruik van commercieel verkrijgbare microkanalen, zoals blijkt uit de representatieve resultaten, maakt de introductie van de op maat gemaakte microfluïde kanalen het mogelijk om de invloed van vasculaire geometrieveranderingen op de trombusvorming te bestuderen. Bijvoorbeeld, stroom afneemt op een tak punt of stenose resulteert in een toename van schuifspanning en meer bloedplaatjes activering36. Een belangrijke beperking van deze op maat gemaakte microfluïde kanalen is echter de eis van hoge celnummers om een stabiele monolaag van EC’s te vormen, zoals beschreven in stap 2.3.2. Dit kan een beperkende factor zijn wanneer patiënt-afgeleide cellen schaars zijn. De sterke punten van de commercieel beschikbare microglijbanen zijn dat oppervlaktes worden aangepast voor celkweek en groeigebieden groter zijn, waardoor EC’s een confluent en stabiele monolaag kunnen vormen. Aan de andere kant, een groter oppervlak zal resulteren in een groter lumen. Volgens vergelijking 1vereist dit hogere bloedvolumes om vergelijkbare stroomsnelheden te bereiken als in de op maat gemaakte microfluidics.

Een verbetering van dit protocol zou kunnen zijn om levend EG-verlies of veranderingen in de integriteit van de belemmering te onderzoeken. Eg-schade in dit protocol wordt pas aan het einde van het experiment gemeten. Voor live tracking kunnen ECs worden getagd met mCherry VE-cadherin, bijvoorbeeld37. Echter, omdat dit een zeer geoptimaliseerd protocol met efficiënte virustransfectie nodig zou hebben, kan Electric Cell-substraat Impedance Sensing (ECIS) worden gebruikt als alternatief voor het bestuderen van endotheelintegriteit en barrièrefunctie38. Perfusie via speciale ECIS-stroomkanalen maakt longitudinale monitoring van de integriteit van de endotheliale barrière onder stroom mogelijk. Deze specifieke ECIS-kenmerken maken parallelle metingen van endotheelbarrière-eigenschappen en trombusvorming mogelijk. Alternatieve manieren voor parallelle EG-barrièremetingen, met name in de op maat gemaakte arrays, zijn het gebruik van fluorescerende dextrans in het perfusaat, dat zich uit het lumen verspreidt, afhankelijk van de eigenschappen van de EG-barrière.

Een beperking van het beschreven protocol is dat ECs uit het menselijk lichaam worden verwijderd en gekweekt op weefselkweekplastic, wat een stijf, kunstmatig substraat is. Cellen passen zich aan hun biofysische omgeving aan. Dit kan mogelijk van invloed zijn op de endotheelrespons op de activering van bloedplaatjes, omdat er een verband is tussen de activering van bloedplaatjes en de stijfheid van de wand39. Ondanks deze aanpassingen aan kweekplastics, houden cellen ziektespecifieke kenmerken die kunnen worden geïdentificeerd in directe vergelijking met EC’s die zijn afgeleid van gezonde donoren, zoals aangetoond met controle, CTEPH-PAEC en HUVEC die verschillende patronen van bloedplaatjesver hechting en fibrinafzetting na 5 min bloedperfusie uitoefenden.

In tegenstelling tot andere protocollen gebruikt dit systeem volbloed, terwijl anderen de interactie van de EG bestuderen met een enkele bloedcomponent zoals bloedplaatjes en leukocyten19,20,21. Er zijn meer geavanceerde microfluïde modellen ontwikkeld die het mogelijk maken de studie van endotheelfunctie in een vasculaire model met een ronde vat geometrie en zachte extracellulaire matrix. Deze zijn echter geoptimaliseerd met HUVEC’s40,41,42. De nieuwigheid van het beschreven protocol is het gebruik van primaire EU’s in combinatie met volbloed waardoor de modellering van in situ trombose een stap dichter bij in vivo omstandigheden komt. Na het protocol voor het gebruik van door de patiënt afgeleide ECs en door patiënten afgeleid bloed te hebben geoptimaliseerd, optimaliseert het ziektemodellering in vitroverder, waardoor de beoordeling van gepersonaliseerde trombusvorming en medicamenteuze behandeling mogelijk is.

Het beschreven protocol kan worden toegepast om het effect van antistollingstherapieën op patiëntcellen te bestuderen. Terwijl we dabigatran gebruikten om de vorming van trombus te remmen, is het mogelijk om andere antistollingsmiddelen te gebruiken, zoals rivaroxaban, wat direct factor Xa in de stollingscascade remt. Direct-bloedplaatjes remmers zoals clopidogrel of aspirine kan ook worden bestudeerd, omdat deze werken op de primaire fase van hemostase waar bloedplaatjes binden aan ECs. Uiteindelijk kan de trombogene capaciteiten van patiëntspecifieke ECs in interactie met het eigen bloed van de patiënt worden gebruikt om het persoonlijke effect van antistollingstherapie op de individuele patiënt te voorspellen. Bovendien kan een knockdown van specifieke eiwitten extra functionele informatie opleveren.

Er zijn enkele stappen in het beschreven protocol die van cruciaal belang zijn voor een succesvol perfusie-experiment. Ten eerste is het tijdens de isolatie van primaire cellen noodzakelijk om een zeer zuivere EG-cultuur te verkrijgen. Ten tweede is het belangrijk dat de EU’s een stabiele confluent monolayer vormen. Als dit niet het geval is, kan een lichte verandering in schuinspanning endotheliale schade en activering van de stollingscascade veroorzaken, of bloedplaatjes kunnen beginnen binden aan het keldermembraan, wat fout-positieve resultaten zal opleveren. Ten derde is het essentieel om luchtbellen te voorkomen, omdat die het endotheel kunnen beschadigen en daardoor de resultaten kunnen beïnvloeden.

Na herkalking van het citrated bloed met calciumchloride en magnesiumchloride is het belangrijk om onmiddellijk met het perfusie-experiment te beginnen. Recalcificatie induceert een snelle respons bij bloedplaatjesactivering en trombusvorming, wat resulteert in een snelle stolling in het monster.

Tot slot beschrijven we een zeer veelzijdig protocol om hele bloed-endotheelcelinteracties te bestuderen tijdens trombose.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij danken Jan Voorberg van de afdeling Plasma Eiwitten, Sanquin Research en Landsteiner Laboratory, Amsterdam UMC, Academisch Medisch Centrum, Amsterdam, Nederland, voor zijn inbreng in dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door de Nederlandse CardioVascular Alliance (DCVA) [2012-08, 2014-11] toegekend aan het Phaedra en het Reconnect consortium en de Impulse grant 2018 toegekend aan het Phaedra IMPACT consortium. Deze subsidies omvatten collectieve financiering door de Nederlandse Hartstichting, Nederlandse Federatie van Universitair Medische Centra, De Nederlandse Organisatie voor Gezondheidsonderzoek en Ontwikkeling, en de Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen. Bovendien werd dit werk gefinancierd door de Europese Onderzoeksraad in het kader van het Advanced Grant ‘VESCEL’-programma (Grant number: 669768). XDM wordt gefinancierd door een onderzoeksbeurs van het Institute for CardioVascular Research (ICaR-VU) van het VU Medisch Centrum, Amsterdam.

Materials

20 mL syringe BD Plastipak 300613
20X objective Olympus
2-Propanol (IPA) Boom 76051455 . 5000
Aladdin Syringe Pump Word Precision Instruments AL-4000
Alexa488-Fibrinogen Invitrogen F13191 15 ug/mL
Alexa647 Goat anti Rabbit Invitrogen A21245 0.180555556
Biopsy punch 1 mm diameter, Integra Miltex Ted Pella 15110-10
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Aldrich A9647
CaCl2 Sigma Aldrich 21115
Calcein AM-Red Invitrogen C3099 1:1000
CD42b-APC Miltenyi Biotec 130-100-208 1:100
Citric Acid Merck 244
Collagen Typ I Corning 354249 0,1 mg/mL
Corning CellBIND Surface 60 mm Culture Dish Corning 3295
Cross-flow hood Basan
Desiccator Duran 24 782 69
D-Glucose Merck 14431-43-7
EDTA Invitrogen 15575-038
Endothelial Cell Medium (ECM) ScienCell 1001
Fibronectin Sigma Aldrich F0895
Flow tubings ibidi 10831, 10841
Gelatin Merck 104070 0.1%
HEPES Sigma Aldrich H4034
Hoechst 33342 Invitrogen H1399 1:1000
ibidi µ-Slide VI 0.4 flow chambers ibidi 80606
ImageJ ImageJ v1.49
KCl Merck 7447-40-7
Lab oven Quincy 10GC
LS720 Fluorescent microscope etaluma LS720
Luer connector ibidi 10802, 10825 Male elbow connectors, and Female tube connectors
MACS magnetic beads (anti-CD144) Miltenyi Biotec 130-097-857 1:5
MgCl2 Sigma Aldrich M1028
Microscopy slides, 76 x 26 mm Thermo Scientific AAAA000001##12E
Negative photoresist, SU-8 Microchem
Non-Essential Amino Acids (NEAA) Lonza 13-114E
Paraformaldehyde (PFA) Merck 818715 4% PFA in PBS
Penicillin/streptomycin (P/S) Gibco 15140-122 1%
Phosphate Buffered Saline (PBS) Gibco 14190-094
Plasma chamber, CUTE Femto Science
Polydimethylsiloxane (PDMS), Sylgard 184 Dow 101697
sodium citrate blood collection tubes BD Vacutainer 363048
trisodium citrate Merck 6448
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Gibco 25300-045
VE-Cadherin (D87F2)-XP Cell Signaling 2500 1:300
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yau, J. W., Teoh, H., Verma, S. Endothelial cell control of thrombosis. BMC Cardiovascular Disorders. 15, 130 (2015).
  2. Pearson, J. D. Endothelial cell function and thrombosis. Best Practice & Research: Clinical Haematology. 12 (3), 329-341 (1999).
  3. Bochenek, M. L., Schafer, K. Role of Endothelial Cells in Acute and Chronic Thrombosis. Hamostaseologie. 39 (2), 128-139 (2019).
  4. Swieringa, F., et al. Platelet Control of Fibrin Distribution and Microelasticity in Thrombus Formation Under Flow. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 36 (4), 692-699 (2016).
  5. Macfarlane, R. G. An Enzyme Cascade in the Blood Clotting Mechanism, and Its Function as a Biochemical Amplifier. Nature. 202, 498-499 (1964).
  6. Versteeg, H. H., Heemskerk, J. W., Levi, M., Reitsma, P. H. New fundamentals in hemostasis. Physiological Reviews. 93 (1), 327-358 (2013).
  7. Opneja, A., Kapoor, S., Stavrou, E. X. Contribution of platelets, the coagulation and fibrinolytic systems to cutaneous wound healing. Thrombosis Research. 179, 56-63 (2019).
  8. Tabas, I., Garcia-Cardena, G., Owens, G. K. Recent insights into the cellular biology of atherosclerosis. Journal of Cell Biology. 209 (1), 13-22 (2015).
  9. Karino, T., Motomiya, M. Flow through a venous valve and its implication for thrombus formation. Thrombosis Research. 36 (3), 245-257 (1984).
  10. ISTH Steering Committee for World Thrombosis Day. Thrombosis: a major contributor to global disease burden. Thrombosis Research. 134 (5), 931-938 (2014).
  11. Witkin, A. S. Acute and chronic pulmonary embolism: the role of the pulmonary embolism response team. Current Opinion in Cardiology. 32 (6), 672-678 (2017).
  12. Kim, N. H., et al. Chronic thromboembolic pulmonary hypertension. European Respiratory Journal. 53 (1), 1801915 (2019).
  13. Zhang, M., Zhang, Y., Pang, W., Zhai, Z., Wang, C. Circulating biomarkers in chronic thromboembolic pulmonary hypertension. Pulmonary Circulation. 9 (2), 2045894019844480 (2019).
  14. Giri, J., et al. Interventional Therapies for Acute Pulmonary Embolism: Current Status and Principles for the Development of Novel Evidence: A Scientific Statement From the American Heart Association. Circulation. 140 (20), 774-801 (2019).
  15. Sharma, S., Lang, I. M. Current understanding of the pathophysiology of chronic thromboembolic pulmonary hypertension. Thrombosis Research. 164, 136-144 (2018).
  16. Eisenberg, P. R., et al. Fibrinopeptide A levels indicative of pulmonary vascular thrombosis in patients with primary pulmonary hypertension. Circulation. 82 (3), 841-847 (1990).
  17. Bochenek, M. L., et al. From thrombosis to fibrosis in chronic thromboembolic pulmonary hypertension. Thrombosis and Haemostasis. 117 (4), 769-783 (2017).
  18. Nagy, M., Heemskerk, J. W. M., Swieringa, F. Use of microfluidics to assess the platelet-based control of coagulation. Platelets. 28 (5), 441-448 (2017).
  19. Barendrecht, A. D., et al. Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow. Journal of Visualized Experiments. (125), e55658 (2017).
  20. Vajen, T., et al. Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets. Journal of Visualized Experiments. (134), e57009 (2018).
  21. Michels, A., Swystun, L. L., Mewburn, J., Albanez, S., Lillicrap, D. Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation. Journal of Visualized Experiments. (126), e55917 (2017).
  22. Smeets, M. W. J., Mourik, M. J., Niessen, H. W. M., Hordijk, P. L. Stasis Promotes Erythrocyte Adhesion to von Willebrand Factor. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (9), 1618-1627 (2017).
  23. Aird, W. C. Endothelial cell heterogeneity. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (1), 006429 (2012).
  24. Aitsebaomo, J., Portbury, A. L., Schisler, J. C., Patterson, C. Brothers and sisters: molecular insights into arterial-venous heterogeneity. Circulation Research. 103 (9), 929-939 (2008).
  25. Szulcek, R., et al. Delayed Microvascular Shear Adaptation in Pulmonary Arterial Hypertension. Role of Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule-1 Cleavage. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 193 (12), 1410-1420 (2016).
  26. Casa, L. D., Deaton, D. H., Ku, D. N. Role of high shear rate in thrombosis. Journal of Vascular Surgery. 61 (4), 1068-1080 (2015).
  27. Jain, A., et al. Assessment of whole blood thrombosis in a microfluidic device lined by fixed human endothelium. Biomedical Microdevices. 18 (4), 73 (2016).
  28. van Nieuw Amerongen, G. P., Draijer, R., Vermeer, M. A., van Hinsbergh, V. W. Transient and prolonged increase in endothelial permeability induced by histamine and thrombin: role of protein kinases, calcium, and RhoA. Circulation Research. 83 (11), 1115-1123 (1998).
  29. Smits, J., et al. Blood Outgrowth and Proliferation of Endothelial Colony Forming Cells are Related to Markers of Disease Severity in Patients with Pulmonary Arterial Hypertension. International Journal of Molecular Sciences. 19 (12), 3763 (2018).
  30. Tobias, M. D., Wambold, D., Pilla, M. A., Greer, F. Differential effects of serial hemodilution with hydroxyethyl starch, albumin, and 0.9% saline on whole blood coagulation. Journal of Clinical Anesthesia. 10 (5), 366-371 (1998).
  31. Jain, A., et al. Primary Human Lung Alveolus-on-a-chip Model of Intravascular Thrombosis for Assessment of Therapeutics. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 103 (2), 332-340 (2018).
  32. Veiseh, M., Veiseh, O., Martin, M. C., Asphahani, F., Zhang, M. Short peptides enhance single cell adhesion and viability on microarrays. Langmuir-ACS. 23 (8), 4472-4479 (2007).
  33. Kuo, C. W., Chueh, D. Y., Chen, P. Investigation of size-dependent cell adhesion on nanostructured interfaces. Journal of Nanobiotechnology. 12, 54 (2014).
  34. McCormack, J. J., Lopes da Silva, M., Ferraro, F., Patella, F., Cutler, D. F. Weibel-Palade bodies at a glance. Journal of Cell Science. 130 (21), 3611-3617 (2017).
  35. Guilarte, M., Sala-Cunill, A., Luengo, O., Labrador-Horrillo, M., Cardona, V. The Mast Cell, Contact, and Coagulation System Connection in Anaphylaxis. Frontiers in Immunology. 8, 846 (2017).
  36. Westein, E., et al. Atherosclerotic geometries exacerbate pathological thrombus formation poststenosis in a von Willebrand factor-dependent manner. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (4), 1357-1362 (2013).
  37. Huveneers, S., et al. Vinculin associates with endothelial VE-cadherin junctions to control force-dependent remodeling. Journal of Cell Biology. 196 (5), 641-652 (2012).
  38. Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. Journal of Visualized Experiments. (85), e51300 (2014).
  39. Yamasaki, F., et al. Association between arterial stiffness and platelet activation. Journal of Human Hypertension. 19 (7), 527-533 (2005).
  40. Tsai, M., et al. In vitro modeling of the microvascular occlusion and thrombosis that occur in hematologic diseases using microfluidic technology. Journal of Clinical Investigation. 122 (1), 408-418 (2012).
  41. Zheng, Y., et al. In vitro microvessels for the study of angiogenesis and thrombosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (24), 9342-9347 (2012).
  42. Myers, D. R., et al. Endothelialized microfluidics for studying microvascular interactions in hematologic diseases. Journal of Visualized Experiments. (64), e3958 (2012).

Tags

In VitroMicrofluidicDisease ModelWhole BloodEndothelialBlood ClotThrombogenicityAnticoagulantInflammatoryPersonalized MedicinePulmonary ArteryFibroronectinEndothelial CellCD144Flow CytometryFlow ChamberGelatin

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Manz, X. D., Albers, H. J., Symersky, P., Aman, J., van der Meer, A. D., Bogaard, H. J., Szulcek, R. In Vitro Microfluidic Disease Model to Study Whole Blood-Endothelial Interactions and Blood Clot Dynamics in Real-Time. J. Vis. Exp. (159), e61068, doi:10.3791/61068 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image