في نموذج المرض Microfluidic في المختبر لدراسة تفاعلات الدم الواهية الكاملة وديناميات تجلط الدم في الوقت الحقيقي
Summary
نقدم نموذج مرض الأوعية الدموية في المختبر للتحقيق في تفاعلات الدم بالكامل مع الـ endothelium المشتق من المريض. يسمح هذا النظام بدراسة خصائص المخثّات المخيّخة للخلايا البطانية الأولية في ظل ظروف مختلفة. وهذه الطريقة مناسبة بشكل خاص لتقييم التجلط الموضعي والعلاج من التخثر خلال مراحل مختلفة من التخثر.
Abstract
ينطوي تكوين جلطات الدم على تفاعلات معقدة بين الخلايا البطانية والمصفوفة الأساسية وخلايا الدم المختلفة والبروتينات. إن بطانة الغدد هو المصدر الرئيسي للعديد من الجزيئات الهفوستية الرئيسية التي تتحكم في تجميع الصفائح الدموية والتخثر والتحلل. على الرغم من أن آلية تجلط الدم قد تم التحقيق فيها لعقود، والدراسات في المختبر تركز أساسا على حالات تلف الأوعية الدموية حيث يحصل على كشف المصفوفة تحت الغدد الصماء، أو على التفاعلات بين الخلايا مع مكونات الدم واحد. تسمح طريقتنا بدراسة التفاعلات بين الدم كله وشبكة خلايا الأوعية الدموية السليمة.
من خلال استخدام الخلايا البطانية البشرية الأولية ، يوفر هذا البروتوكول فرصة فريدة لدراسة تأثير الخلايا البطانية على ديناميكيات الخثرة ويعطي رؤى قيمة في الفيزيولوجيا المرضية من الأمراض الخثارية. استخدام قنوات تدفق microfluidic حسب الطلب يسمح تطبيق هندسات الأوعية الدموية محددة المرض ونموذج تغييرات الأوعية الدموية المورفولوجية محددة. يتم تسجيل تطوير خثرة في الوقت الحقيقي وتتميز كميا التصاق الصفائح الدموية وترسب الفيبرين. يتم تحديد تأثير وظيفة البطانية في ديناميات الخثرة المعدلة عن طريق ما بعد التحليل من خلال تلطيخ الفلوروس المناعي لجزيئات محددة.
تصف النتائج التمثيلية الإعداد التجريبي، وجمع البيانات، وتحليل البيانات. اعتمادا على سؤال البحث، يمكن تعديل المعلمات لكل قسم بما في ذلك نوع الخلية، ومعدلات القص، وهندسة القناة، والعلاج الدوائي، وإجراءات ما بعد الكلى. يتم التحقق من صحة البروتوكول عن طريق تحديد كمي تشكيل خثرات على endothelium الشريان الرئوي من المرضى الذين يعانون من مرض الجلطات الدموية المزمن.
Introduction
يشكل endothelium الطبقة الخلوية الداخلية من الأوعية الدموية ويفصل الدم عن الأنسجة المحيطة. وقد وصفت بأنها جهاز ديناميكي ينظم بنشاط بيئتها الدقيقة ويستجيب للمحفزات الخارجية1. بسبب اتصالها المباشر مع تدفق الدم، و endothelium هو محوري في السيطرة على الهفوات والتخثر وهو المصدر الرئيسي للعديد من الجزيئات التنظيمية الرئيسية التي تتحكم في تجميع الصفائح الدموية، والتخثر، وتحلل2. خلايا البطاحلية صحية وغير معطلة (EC) تنتج عدة جزيئات التي تتصدى لتنشيط الصفائح الدموية ومنع التخثر وتشكيل الخثرة للحفاظ على تدفق الدم، مثل prostacyclin، الجلطات مودولين، أو مثبطات مسار عامل الأنسجة (TFPI)2،3. وهذا يمنع التصاق الصفائح الدموية، وتجميع الصفائح الدموية، وتشكيل خثرات. إصابة أو تنشيط جدار السفينة النتائج في النمط الظاهري الغدد الغدد الغدد الغدد الغدد الغدد الغدد الغدد الغدد الغدد الغدد التي تبدأ التصاق الصفائح الدموية المترجمة وتشكيل جلطة2,4. عند الصفائح الدموية التنشيط endothelial تلتزم فون ويلبراند Factor (VWF)، وهو بروتين متعدد اميركات صدر من ECs، أو إلى مواقع الربط المكشوفة للمصفوفة تحت الغدد الصماء الأساسية. في وقت لاحق، والتغيرات الجزيئية في الصفائح الدموية والتعرض لعوامل الأنسجة (TF) بدء تفعيل نظام التخثر، الذي يحفز تشكيل خثرة بواسطة البلمرة الفيبرين5،6. معا، والجلطة الناتجة يوفر الأساس لإغلاق الجرح عن طريق إعادة endothelialization7. قد تؤدي اضطرابات نظام التخثر إلى اضطرابات نزيف ، مثل مرض فون ويليبراند ، الهيموفيليا ، أو تجلط الدم ، التي غالبًا ما تنتج عن توازن متوازن ومضاد التشنج في المسار الهتمى البطاريجي2،3.
تحدث عملية الهباس في الدورة الدموية الشريانية والريدية. ومع ذلك، فإن الآليات الكامنة الكامنة في تجلط الشرايين والوريع مختلفة جذريا. بينما تجلط الشرايين، كما رأينا في مرض القلب الإقفائي، هو في الغالب مدفوعة بتمزق البلاك تصلب الشرايين في ظل ظروف من الإجهاد القص عالية، الخثار الوريدي يتطور في الغالب في غياب إصابة البطانية في حالة ركود8،9،10. قد تصمام خثرة الوريد العميق وتنتقل نحو الشرايين الرئوية، حيث تسبب انسداد رئوي. وهذا يمكن أن يؤدي إلى انسداد الأوعية الدموية المزمنة مما يؤدي إلى ضعف كبير القدرات الوظيفية التي قد تعزز تطور أمراض الرئة chonic بما في ذلك تطوير ارتفاع ضغط الدم الرئوي المزمن الجلومبومبولي (CTEPH)11,12,13,14. يتميز CTEPH بارتفاع الضغط الرئوي بسبب انسداد الشرايين الرئوية بواسطة مادة خثارية بعد ثلاثة أشهر على الأقل من العلاج باتخثر15. بالإضافة إلى خمولي الرئة، فمن المسلم به أن البطين الرئوي يوفر بيئة البروثرمومبوتيك في CTEPH التي تسهل في الموقع تخثر وانسداد الشرايين الرئوية المزمنة، مما تسبب في زيادة في ضغط الدم التي يمكن أن تؤدي في نهاية المطاف إلى فشل القلب، إذا لم تعالج16،17.
على مدى السنوات الماضية، أدت دراسات مختلفة إلى تطوير المقايسات لفحص تشكيل خثرات من خلال قياس وظيفة الصفائح الدموية والتخثر18. ومع ذلك، معظمهم إما دراسة تفاعل الدم كله مع مكونات مصفوفة خارج الخلية واحد مثل الكولاجين أو الفيبرين، أو وظيفة البطانية في التفاعل مع مكونات الدم واحد، مثل البطانية الصفائح الدموية أو التفاعل البطانية الكريات البيض19،20،21،22. هذه الأقوال هي الأكثر شيوعاً مع الخلايا الوريدية الوريدية (HUVEC)، كما يتم الحصول على هذه الخلايا بسهولة. ومع ذلك، يتم التعبير عن الجينات هيمستيك بشكل تفاضلي عبر شجرة الأوعية الدموية، وأنواع الأوعية، وأنظمة الجهاز23،24، مما يجعل استخدام HUVECs لتمثيل الخلايا البطانية المشاركة في تجلط الشرايين أو الانسداد الرئوي إشكالية23.
بالإضافة إلى اللدونة EC، يمكن أن تعزز التعديلات والمتغيرات في رفرف الأوعية الدموية في الدمانية الخاصة بالأمراض تشكيل الخثرة في الـ endotheliumالعادي 25. معدلات القص الأعلى، بسبب تضيق الأوعية المحلية أو التغيرات في هندسة السفينة، على سبيل المثال، قد يؤدي إلى تشكيل الخثارة الحادة، مما تسبب في تضيق أن يسرع وقف تدفق الدم26. استخدام قنوات تدفق microengineered حسب الطلب يسمح لتصميم على وجه التحديد هندسات الأوعية الدموية التي تمثل البيولوجيا (patho). وبهذه الطريقة، فمن الممكن لدراسة تأثير القوى البيوميكانيكية المحلية على صحية أو المرضى EC27.
هناك علاجات التخثر المتاحة لاستهداف مراحل وجزيئات مختلفة في سلسلة التخثر، والتي تشكل جميعها مخاطر وفوائد خاصة يمكن أن تكون محددة لبعض الاضطرابات. إن نهج نمّجة المرض الموصوف في هذه الورقة مناسب بشكل خاص لاختبار آثار مضادات التخثر المختلفة والعلاجات المضادة للصفيحات على ديناميكيات الخثرة.
والهدف من ذلك هو تقديم نموذج من تجلط الدم الذي يشمل اللجان الإلكترونية الأولية، مما يؤدي إلى نموذج متعدد الاستخدامات مناسب لتحليل مختلف أشكال الخثار حسب نوع اللجان الإلكترونية الأولية المستخدمة. وكمثال على ذلك، استخدمنا الخلايا البطاية الشريانية الرئوية من مرضى CTEPH في التفاعل مع الدم البشري كله التي تحتوي على جميع المكونات المشاركة في تشكيل خثرة (الصفائح الدموية، الكريات البيض، كريات الدم الحمراء، البروتينات التخثر، والمحسنات). ويمكن تطبيق هذا النهج في قنوات التدفق الموازي التجارية أو في قنوات التدفق المجهرية المصنوعة خصيصاً مع تصميم خاص للأوعية الدموية. على هذا النحو، يمكن استخدام النموذج في نهاية المطاف في دراسة تشكيل الخثرة والقرار، لتقييم الاستجابات الالتهابية في نميطة المرض، لعلاج مضاد القشرة أو مضادات التخثر، وفي نهاية المطاف للطب الشخصي.
تصف هذه الدراسة عزل الخلايا البطانية الشريانية الرئوية الأساسية. لعزل أنواع الخلايا البطانية البشرية الأساسية الأخرى، نشير إلى الأساليب المنشورة سابقا، بما في ذلك الخلايا البطانية البطانية الدقيقة الأوعية الدموية الرئوية25، الخلايا البطانية الوريدية البشرية28، والدم تعميم مستعمرة البطانية تشكيل الخلايا الشكل 1A29.
Protocol
Representative Results
Discussion
التخثر هو نتيجة للتفاعل المعقد والمتحكم فيه زمنيا بين بطانة الدم ومكونات الدم. يقدم هذا الفحص في المختبر طريقة للتحقيق في الخصائص المخبوطاتية للخلايا البطانية في الوقت الحقيقي. يمكن استخدام أنواع مختلفة من الخلايا البطانية البشرية الأولية ، مما يسهل التجلط في الموقع بطريقة خاصة بالأعضاء والمريض. في هذه الدراسة، أوضحنا استخدام هذا البروتوكول مقارنة الخصائص الخثرة من PAECs معزولة عن المتبرعين الأصحاء مقابل مرضى CTEPH. تمت دراسة تكوين الخثرة الحية عن طريق ضخ الدم كله من الموضوعات الصحية على endothelium المنشطة الهستامين ، في حين تم اختبار تأثير DOAC كعامل مضاد للتشنج.
إلى جانب استخدام القنوات الصغيرة المتاحة تجاريا، كما هو مبين في النتائج التمثيلية، وإدخال القنوات microfluidic حسب الطلب تمكن من دراسة تأثير التغيرات الهندسية الوعائية على تشكيل خثرة. على سبيل المثال، انخفاض تدفق عند نقطة فرع أو تضيق يؤدي إلى زيادة في الإجهاد القص وتنشيط أكثر الصفائحالدموية 36. ومع ذلك، هناك قيد كبير لهذه الأقنية microfluidic حسب الطلب هو شرط أرقام الخلايا العالية لتشكيل أحادية ثابتة من ECs كما هو موضح في الخطوة 2.3.2. وهذا قد يمثل عاملاً مقيداً عندما تكون الخلايا المشتقة من المريض نادرة. نقاط القوة في الانهيارات الصغيرة المتاحة تجاريا هي أن يتم تعديل المناطق السطحية لثقافة الخلية ومناطق النمو هي أكبر، مما يسمح ECs لتشكيل أحادية التقاء ومستقرة. من ناحية أخرى، فإن مساحة أكبر من السطح يؤدي إلى أكبر التجويف. وفقاً للمعادلة 1، يتطلب هذا كميات دم أعلى للوصول إلى معدلات تدفق مماثلة كما هو الحال في microfluidics المصنوع خصيصًا.
يمكن أن يكون تحسين هذا البروتوكول هو التحقق من فقدان EC مباشرة أو تغييرات في سلامة الحاجز. ولا يقاس الضرر الذي يلحق باتفاقية الاتحاد الأوروبي في هذا البروتوكول إلا في نهاية التجربة. للتتبع المباشر ، يمكن أن يتم وضع علامة على ECs باستخدام mCherry VE-cadherin ، على سبيل المثال37. ومع ذلك ، لأن هذا من شأنه أن يحتاج إلى بروتوكول الأمثل للغاية مع الفيروسات كفاءة transfection ، الخلية الكهربائية الركيزة المعاوقة الاستشعار (ECIS) يمكن استخدامها كبديل لدراسة سلامة endothelial و وظيفة الحاجز38. يسمح الضخ عبر قنوات تدفق ECIS الخاصة بالرصد الطولي لسلامة الحاجز البطانية تحت التدفق. تسمح هذه الميزات المحددة ECIS بقياسات متوازية لخصائص الحاجز البطانية وتشكيل الخثرة. وتشمل الطرق البديلة لقياسات حاجز EC المتوازية، وخاصة في صفائف حسب الطلب استخدام الفلورسنت ديكسترانس في perfusate، التي تنتشر خارج تجويف، اعتمادا على خصائص حاجز الجماعة الأوروبية.
وهناك قيد من البروتوكول الموصوف هو أن يتم إزالة ECs من جسم الإنسان ومثقف على البلاستيك ثقافة الأنسجة، وهو صلب، الركيزة الاصطناعية. تتكيف الخلايا مع بيئتها البيوفيزيائية. هذا يمكن أن تؤثر ربما على الاستجابة البطانية لتنشيط الصفائح الدموية، كما أن هناك علاقة بين تنشيط الصفائح الدموية وصلابة الجدار39. على الرغم من هذه التكيفات مع البلاستيك الثقافة, الخلايا لا تبقي خصائص خاصة بمرض التي يمكن تحديدها في المقارنة المباشرة مع ECs المستمدة من المتبرعين الأصحاء كما هو مبين مع السيطرة, CTEPH-PAEC, و HUVEC التي بذلت أنماط مختلفة من التصاق الصفائح الدموية وترسب الفيبرين بعد 5 دقيقة من ضخ الدم.
على النقيض من البروتوكولات الأخرى، يستخدم هذا النظام الدم كله بينما يدرس آخرون تفاعل EC مع مكون دم واحد مثل الصفائح الدموية و كريات الدم البيض19،20،21. كانت هناك نماذج microfluidic أكثر تقدما المتقدمة التي تسمح لدراسة وظيفة endothelial في نموذج الأوعية الدموية مع هندسة السفينة جولة ومصفوفة لينة خارج الخلية. ومع ذلك ، يتم تحسين هذه مع HUVECs40،41،42. الجدة من البروتوكول الموصوف هو استخدام ECs الأولية جنبا إلى جنب مع الدم كله جلب نمذجة في الموقع الخثار خطوة واحدة أقرب إلى في الظروف الجسمية. بعد أن الأمثل بروتوكول لاستخدام المرضى المستمدة من ECs والدم المستمدة من المريض مزيد من تحسين النمذجة المرض في المختبر، والسماح لتقييم شخصية تشكيل خثرة والعلاج من المخدرات.
يمكن تطبيق البروتوكول الموصوف لدراسة تأثير علاجات التخثر على الخلايا المشتقة من المريض. في حين أننا استخدمنا dabigatran لمنع تشكيل خثرات، فمن الممكن استخدام مضادات التخثر الأخرى، مثل rivaroxaban، الذي يمنع مباشرة عامل Xa في سلسلة التخثر. يمكن دراسة مثبطات الصفائح الدموية المباشرة مثل clopidogrel أو الأسبرين أيضًا ، حيث تعمل هذه على المرحلة الأولية من الهباسات حيث ترتبط الصفائح الدموية بـ ECs. في نهاية المطاف، يمكن استخدام القدرات الجلطاتية للمرضى في التفاعل مع دم المريض نفسه للتنبؤ بالتأثير الشخصي للعلاج باتخثر على المريض الفردي. وعلاوة على ذلك، يمكن أن توفر ضربة قاضية من بروتينات محددة معلومات وظيفية إضافية.
هناك بعض الخطوات في البروتوكول الموصوفة التي تعتبر هامة لتجربة تخبط ناجحة. أولاً، أثناء عزل الخلايا الأولية، من الضروري الحصول على ثقافة EC نقية للغاية. ثانياً، من المهم أن تشكل اللجان الأوروبية طبقة أحادية ثابتة. إذا لم يكن هذا هو الحال، يمكن أن يسبب تغيير طفيف في الإجهاد القص الضرر البطانية وتفعيل تتالي التخثر، أو الصفائح الدموية يمكن أن تبدأ ملزمة لغشاء الطابق السفلي، والتي سوف توفر نتائج إيجابية كاذبة. ثالثا، من الضروري منع فقاعات الهواء، لأن تلك يمكن أن تلحق الضرر بـ endothelium وبالتالي التأثير على النتائج.
بعد إعادة معايرة الدم المُسَتَلَد بكلوريد الكالسيوم وكلوريد المغنسيوم، من المهم البدء فوراً في تجربة الضخ. يؤدي إعادة التكلس إلى استجابة سريعة في تنشيط الصفائح الدموية وتشكيل الخثرة ، مما يؤدي إلى تخثر سريع في العينة.
في الختام، نحن وصف بروتوكول تنوعا للغاية لدراسة تفاعلات الخلايا البطانية الدم كامل أثناء تجلط الدم.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر يان فوربرغ من قسم بروتينات البلازما، Sanquin Research ومختبر Landsteiner، أمستردام UMC، المركز الطبي الأكاديمي، أمستردام، هولندا، على إسهاماته في هذه المخطوطة. وقد تم دعم هذا العمل من قبل التحالف الهولندي للقلب الفاشه (DCVA) [2012-08، 2014-11] الذي مُنح لـ Phaedra واتحاد Reconnect وكذلك منحة Impulse لعام 2018 الممنوحة لكونسورتيوم فايدرا إمباكت. وتشمل هذه المنح التمويل الجماعي من قبل مؤسسة القلب الهولندية، والاتحاد الهولندي للمراكز الطبية الجامعية، والمنظمة الهولندية للبحوث الصحية والتنمية، وأكاديمية هولندا الملكية للعلوم. وعلاوة على ذلك، تم تمويل هذا العمل من قبل مجلس البحوث الأوروبية في إطار برنامج المنح المتقدمة ‘VESCEL’ (رقم المنحة: 669768). يتم تمويل XDM من خلال منحة بحثية من معهد البحوث القلبية الوعائية (ICaR-VU) في المركز الطبي لجامعة VU، أمستردام، هولندا.
Materials
| 20 mL syringe | BD Plastipak | 300613 | |
| 20X objective | Olympus | ||
| 2-Propanol (IPA) | Boom | 76051455 . 5000 | |
| Aladdin Syringe Pump | Word Precision Instruments | AL-4000 | |
| Alexa488-Fibrinogen | Invitrogen | F13191 | 15 ug/mL |
| Alexa647 Goat anti Rabbit | Invitrogen | A21245 | 0.180555556 |
| Biopsy punch 1 mm diameter, Integra Miltex | Ted Pella | 15110-10 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A9647 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | 21115 | |
| Calcein AM-Red | Invitrogen | C3099 | 1:1000 |
| CD42b-APC | Miltenyi Biotec | 130-100-208 | 1:100 |
| Citric Acid | Merck | 244 | |
| Collagen Typ I | Corning | 354249 | 0,1 mg/mL |
| Corning CellBIND Surface 60 mm Culture Dish | Corning | 3295 | |
| Cross-flow hood | Basan | ||
| Desiccator | Duran | 24 782 69 | |
| D-Glucose | Merck | 14431-43-7 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
| Endothelial Cell Medium (ECM) | ScienCell | 1001 | |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F0895 | |
| Flow tubings | ibidi | 10831, 10841 | |
| Gelatin | Merck | 104070 | 0.1% |
| HEPES | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | 1:1000 |
| ibidi µ-Slide VI 0.4 flow chambers | ibidi | 80606 | |
| ImageJ | ImageJ | v1.49 | |
| KCl | Merck | 7447-40-7 | |
| Lab oven | Quincy | 10GC | |
| LS720 Fluorescent microscope | etaluma | LS720 | |
| Luer connector | ibidi | 10802, 10825 | Male elbow connectors, and Female tube connectors |
| MACS magnetic beads (anti-CD144) | Miltenyi Biotec | 130-097-857 | 1:5 |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M1028 | |
| Microscopy slides, 76 x 26 mm | Thermo Scientific | AAAA000001##12E | |
| Negative photoresist, SU-8 | Microchem | ||
| Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Lonza | 13-114E | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Merck | 818715 | 4% PFA in PBS |
| Penicillin/streptomycin (P/S) | Gibco | 15140-122 | 1% |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-094 | |
| Plasma chamber, CUTE | Femto Science | ||
| Polydimethylsiloxane (PDMS), Sylgard 184 | Dow | 101697 | |
| sodium citrate blood collection tubes | BD Vacutainer | 363048 | |
| trisodium citrate | Merck | 6448 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300-045 | |
| VE-Cadherin (D87F2)-XP | Cell Signaling | 2500 | 1:300 |
References
- Yau, J. W., Teoh, H., Verma, S. Endothelial cell control of thrombosis. BMC Cardiovascular Disorders. 15, 130 (2015).
- Pearson, J. D. Endothelial cell function and thrombosis. Best Practice & Research: Clinical Haematology. 12 (3), 329-341 (1999).
- Bochenek, M. L., Schafer, K. Role of Endothelial Cells in Acute and Chronic Thrombosis. Hamostaseologie. 39 (2), 128-139 (2019).
- Swieringa, F., et al. Platelet Control of Fibrin Distribution and Microelasticity in Thrombus Formation Under Flow. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 36 (4), 692-699 (2016).
- Macfarlane, R. G. An Enzyme Cascade in the Blood Clotting Mechanism, and Its Function as a Biochemical Amplifier. Nature. 202, 498-499 (1964).
- Versteeg, H. H., Heemskerk, J. W., Levi, M., Reitsma, P. H. New fundamentals in hemostasis. Physiological Reviews. 93 (1), 327-358 (2013).
- Opneja, A., Kapoor, S., Stavrou, E. X. Contribution of platelets, the coagulation and fibrinolytic systems to cutaneous wound healing. Thrombosis Research. 179, 56-63 (2019).
- Tabas, I., Garcia-Cardena, G., Owens, G. K. Recent insights into the cellular biology of atherosclerosis. Journal of Cell Biology. 209 (1), 13-22 (2015).
- Karino, T., Motomiya, M. Flow through a venous valve and its implication for thrombus formation. Thrombosis Research. 36 (3), 245-257 (1984).
- ISTH Steering Committee for World Thrombosis Day. Thrombosis: a major contributor to global disease burden. Thrombosis Research. 134 (5), 931-938 (2014).
- Witkin, A. S. Acute and chronic pulmonary embolism: the role of the pulmonary embolism response team. Current Opinion in Cardiology. 32 (6), 672-678 (2017).
- Kim, N. H., et al. Chronic thromboembolic pulmonary hypertension. European Respiratory Journal. 53 (1), 1801915 (2019).
- Zhang, M., Zhang, Y., Pang, W., Zhai, Z., Wang, C. Circulating biomarkers in chronic thromboembolic pulmonary hypertension. Pulmonary Circulation. 9 (2), 2045894019844480 (2019).
- Giri, J., et al. Interventional Therapies for Acute Pulmonary Embolism: Current Status and Principles for the Development of Novel Evidence: A Scientific Statement From the American Heart Association. Circulation. 140 (20), 774-801 (2019).
- Sharma, S., Lang, I. M. Current understanding of the pathophysiology of chronic thromboembolic pulmonary hypertension. Thrombosis Research. 164, 136-144 (2018).
- Eisenberg, P. R., et al. Fibrinopeptide A levels indicative of pulmonary vascular thrombosis in patients with primary pulmonary hypertension. Circulation. 82 (3), 841-847 (1990).
- Bochenek, M. L., et al. From thrombosis to fibrosis in chronic thromboembolic pulmonary hypertension. Thrombosis and Haemostasis. 117 (4), 769-783 (2017).
- Nagy, M., Heemskerk, J. W. M., Swieringa, F. Use of microfluidics to assess the platelet-based control of coagulation. Platelets. 28 (5), 441-448 (2017).
- Barendrecht, A. D., et al. Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow. Journal of Visualized Experiments. (125), e55658 (2017).
- Vajen, T., et al. Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets. Journal of Visualized Experiments. (134), e57009 (2018).
- Michels, A., Swystun, L. L., Mewburn, J., Albanez, S., Lillicrap, D. Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation. Journal of Visualized Experiments. (126), e55917 (2017).
- Smeets, M. W. J., Mourik, M. J., Niessen, H. W. M., Hordijk, P. L. Stasis Promotes Erythrocyte Adhesion to von Willebrand Factor. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (9), 1618-1627 (2017).
- Aird, W. C. Endothelial cell heterogeneity. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (1), 006429 (2012).
- Aitsebaomo, J., Portbury, A. L., Schisler, J. C., Patterson, C. Brothers and sisters: molecular insights into arterial-venous heterogeneity. Circulation Research. 103 (9), 929-939 (2008).
- Szulcek, R., et al. Delayed Microvascular Shear Adaptation in Pulmonary Arterial Hypertension. Role of Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule-1 Cleavage. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 193 (12), 1410-1420 (2016).
- Casa, L. D., Deaton, D. H., Ku, D. N. Role of high shear rate in thrombosis. Journal of Vascular Surgery. 61 (4), 1068-1080 (2015).
- Jain, A., et al. Assessment of whole blood thrombosis in a microfluidic device lined by fixed human endothelium. Biomedical Microdevices. 18 (4), 73 (2016).
- van Nieuw Amerongen, G. P., Draijer, R., Vermeer, M. A., van Hinsbergh, V. W. Transient and prolonged increase in endothelial permeability induced by histamine and thrombin: role of protein kinases, calcium, and RhoA. Circulation Research. 83 (11), 1115-1123 (1998).
- Smits, J., et al. Blood Outgrowth and Proliferation of Endothelial Colony Forming Cells are Related to Markers of Disease Severity in Patients with Pulmonary Arterial Hypertension. International Journal of Molecular Sciences. 19 (12), 3763 (2018).
- Tobias, M. D., Wambold, D., Pilla, M. A., Greer, F. Differential effects of serial hemodilution with hydroxyethyl starch, albumin, and 0.9% saline on whole blood coagulation. Journal of Clinical Anesthesia. 10 (5), 366-371 (1998).
- Jain, A., et al. Primary Human Lung Alveolus-on-a-chip Model of Intravascular Thrombosis for Assessment of Therapeutics. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 103 (2), 332-340 (2018).
- Veiseh, M., Veiseh, O., Martin, M. C., Asphahani, F., Zhang, M. Short peptides enhance single cell adhesion and viability on microarrays. Langmuir-ACS. 23 (8), 4472-4479 (2007).
- Kuo, C. W., Chueh, D. Y., Chen, P. Investigation of size-dependent cell adhesion on nanostructured interfaces. Journal of Nanobiotechnology. 12, 54 (2014).
- McCormack, J. J., Lopes da Silva, M., Ferraro, F., Patella, F., Cutler, D. F. Weibel-Palade bodies at a glance. Journal of Cell Science. 130 (21), 3611-3617 (2017).
- Guilarte, M., Sala-Cunill, A., Luengo, O., Labrador-Horrillo, M., Cardona, V. The Mast Cell, Contact, and Coagulation System Connection in Anaphylaxis. Frontiers in Immunology. 8, 846 (2017).
- Westein, E., et al. Atherosclerotic geometries exacerbate pathological thrombus formation poststenosis in a von Willebrand factor-dependent manner. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (4), 1357-1362 (2013).
- Huveneers, S., et al. Vinculin associates with endothelial VE-cadherin junctions to control force-dependent remodeling. Journal of Cell Biology. 196 (5), 641-652 (2012).
- Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. Journal of Visualized Experiments. (85), e51300 (2014).
- Yamasaki, F., et al. Association between arterial stiffness and platelet activation. Journal of Human Hypertension. 19 (7), 527-533 (2005).
- Tsai, M., et al. In vitro modeling of the microvascular occlusion and thrombosis that occur in hematologic diseases using microfluidic technology. Journal of Clinical Investigation. 122 (1), 408-418 (2012).
- Zheng, Y., et al. In vitro microvessels for the study of angiogenesis and thrombosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (24), 9342-9347 (2012).
- Myers, D. R., et al. Endothelialized microfluidics for studying microvascular interactions in hematologic diseases. Journal of Visualized Experiments. (64), e3958 (2012).
