自由に動くマウスの行動を調節する神経活動の光遺伝学的操作
Summary
特定の神経集団や脳領域の光遺伝学的操作により、自由に動く動物の高い時間的および空間的分解能で行動を修正することができる。慢性に埋め込まれた光ファイバーと組み合わせて異なる光遺伝学的ツールを使用することにより、さまざまな神経変調および行動検査を行うことができます。
Abstract
自由に動くマウスにおける神経回路の光遺伝学的調節は、急性および長期の行動に影響を及ぼす。この方法は、中枢神経系のニューロン回路全体まで、単一ニューロンおよび領域特異的送信機放出の操作を行い、行動結果の直接測定を可能にする。ニューロンは、Channelrhodopsin2(ChR2)などの選択したDNAを運ぶウイルスベクターの注入を介して光遺伝学的ツールを発現する。光は、標的領域の真上に終了する慢性光学インプラントを介して特定の脳領域に持ち込まれる。2週間の回復と適切なツール発現の後、マウスは目的のニューロンの光遺伝学的刺激を伴う行動検査に繰り返し使用することができる。
光遺伝学的変調は、化学的または電気的刺激などの一般的に使用される方法と比較して、高い細胞特異性で達成することができる高い時間的および空間的分解能を有する。光は神経組織に害を与えないため、1つのマウスでの複数の行動実験だけでなく、長期実験にも使用できます。光遺伝学的ツールの可能性はほぼ無制限であり、ニューロン全体の活性化またはサイレンシング、あるいは光による特定の受容体タイプの操作を可能にします。
このような光遺伝学的刺激を用いた行動実験の結果は、操作によって引き起こされる行動の変化を直接可視化する。ベースラインとして光刺激を伴わない同じ動物の挙動は、誘発変化に対する良好な制御である。これは、神経の種類や神経伝達物質システムの詳細な概要を可能にする, 不安など、特定の行動に関与.また、神経回路網の可塑性は、光刺激後の長期刺激や行動観察を通じて、非常に詳細に調べることができます。光遺伝学は、神経疾患のいくつかの種類の神経シグナル伝達を啓発するのに役立ちます。
Introduction
中枢神経系における神経回路の調節とその行動結果は、特に精神疾患や学習や記憶などの認知タスクにおいて、脳の仕組みを理解するために重要です。光遺伝学では、単一細胞または細胞集団は、回路全体まで光によって変調することができる。Channelrhodopsin2(ChR2)やArchaerhodopsin(Arch)のような一般的な光遺伝学的ツールは、ニューロンを活性化または沈黙させ、または別個の脳領域11、2、3、42,3に投影する軸索末端での送信機放出を増加または阻害することができる。,4しかし、Archは、シナプス前の端末での活性化が自発的な送信機放出を増加させることが示されたように、慎重に使用する必要があります5.アーチは、細胞内のpH値を変化させる外側の整流プロトンポンプである。このアルカリミリューはカルシウム流入を誘導し、送信機放出を増強する 5.細胞内シグナル伝達経路を特異的に調節するために、ロドプシンやコーンオプシンなどの光活性化可能な光遺伝学的ツールからなる受容体キメラを、適切なGタンパク質共役受容体と組み合わせて、6、7、86,7,8を作成することができる。利用可能な光遺伝学的ツールの量と変動は、過去10年間で大幅に増加しました 9.
光遺伝学の目的は、行動中に神経回路を操作することです。光遺伝学は、例えば、不安行動の変化などの急性行動変化の測定を可能にする。光遺伝学的ツールは、ウイルスベクターを介して脳の標的領域に送達される。特別なプロモーターやエンハンサー、またはCre-loxPシステムの助けを借りて、細胞型特異性は光遺伝学的ツールの発現のために保証することができる(図1A)。特定の細胞タイプでのみ酵素Cre-Recombinaseを発現する遺伝子組み換えマウスラインがいくつか存在する。例えば、Nex-Creマウスは、皮質中の錐体ニューロンおよびNex-促進器10の制御下の海馬におけるクレリコンビナーゼを発現する。この酵素は、loxP側11に横たわるDNA配列を反転させることができる。したがって、loxP側によって反転され、横たわっている二重凝解光遺伝学的ツールのDNA配列は、他のニューロンタイプ12、13,13ではなく、Cre-Recombinaseを有するニューロンによってのみ転写することができる。Nex-Creマウスの場合、光遺伝学的ツールはピラミッド型ニューロンのみで発現する。特定の脳領域の光刺激は、その後、関心領域の真上の光ファイバーの慢性注入を介して達成される。動物は適切な光源に結合され、ほぼすべての種類の行動テストで自由に行動することができます。
図1:注射と注入。A) ChR2-YFP 用の Cre-loxP システム。二重凝集光遺伝学的ツールは、脳組織への注射のためのアデノ関連ウイルス(AAV)に詰め込まれています。B)mPFCのIL領域への/上の光学神経インターフェースのウイルス注入および注入の矢状の見解。注射および注入は上から行った。対象地域である IL、BLA、DRN が表示されます。C)埋め込み光ファイバー、スリーブ、光源の詳細図。D)200μm光ファイバーから灰色物質の脳組織に青と赤のレーザー光刺激を広げる(Yizharら 2011)。青色光が広がり、最大で0.5mmの組織に、赤色光は約1mmです。色分け:赤50%、黄色10%、緑5%、青色1%(光がこの領域に到達した場合)。EE)200 μmの光ファイバーを用いた左ILの真上の一方的な注入のコロナ図。IL領域は、各半球で0.25ミリメートルの幅と0.2ミリメートルの深さを持っています。青と赤の電球は、5%の光が広がるボーダーであり、Yizharらから適切なサイズに転送されます。ロクスP:X-オーバーP1の軌跡;ChR2: チャネルロドプシン;YFP: 黄色の蛍光タンパク質;dflox: ダブルフラックス;IL: 赤外線皮質;BLA: バソラテラアミダラ;DRN: 後回しのラフェ核;PrL: 前縁領域。この図は、Berg 201948から変更されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
光遺伝学的アプローチは、高い時間的および空間的分解能14 および細胞型特異的変調の両方を可能にするとして利用される。さらに、それ以上の治療を行うことなく、埋め込み装置を繰り返し使用することができる。定位的手術の後、光遺伝学的ツールを運ぶアデノ関連ウイルスの注入および光ファイバーの移植が行われるところで、マウスは2週間回復することができる。手術から回復し、ウイルスが発現するのに十分な時間であるため、我々は、わずか2週間の回復時間を選択しました。行動実験は免疫検査が続くため、実験中にマウスが古くなりすぎないようにする必要があります。そうでなければ、組織の質が低下します。彼らはインプラントから明らかな行動障害を示さないし、典型的なケージの行動に従事する。もちろん、移植は重要な外科的病変を伴う。したがって、マウスは集中的に監視されます。手術後、グループ収容マウスはお互いの新鮮な傷やインプラントを傷つける傾向があり、マウスは単座化する必要があります。しかし、単一の収容マウスは不安レベルが低い15 を示し、一般的にうつ病のような症状が少ない16の場合、住宅状態は雄マウスの不安レベルに大きな影響を与える。
脳回路の化学的または電気的操作は、光遺伝学の高い細胞型特異性を欠き、より低い時間的および空間分解能14、17、1817,18を有する。14実験問題に応じて、電気的または化学的刺激は異なる利点を有することができる。特定の領域でファイバー端子を通過する場合も刺激する必要がある、電気刺激が最良の方法です。化学刺激は、全領域の送信機特異的受容体がアゴニストによって活性化されるべき場合に適した選択である。光遺伝学の化学的または電気的刺激と比較する別の大きな利点は、内因的には、ニューロンが光に敏感ではないということで、副作用19の発生を回避する。確かに、高い光強度は加熱効果88、2020を誘発するかもしれないが、適切な対照群のために、光遺伝学的操作による行動効果を排除することができる。
げっ歯類の挙動を調査することは、特に精神疾患に関して、自由に動く動物の光遺伝学によって、特定の細胞集団21および回路22までの単一の受容体の直接変調を可能にするので、大幅に改善された。このような変調の急性の影響を測定する可能性は、定義された時間23後または慢性刺激24後の長期的な行動効果と同様に、実験設計の広い柔軟性を可能にし、脳回路に非常に詳細な洞察を提供する。光刺激は、光遺伝学的ツールの注射部位に位置するニューロンを調節するために使用することができる。注射と注入の両方が同じ脳領域に対処する場合、この領域における主体ニューロンおよびインターニューロンの軸索を突き出す細胞体および背部は33、6、86,8を標的とすることができる。しかし、光繊維は、注入されたものとは異なる領域に移植することもできる。この場合、光刺激は、注入領域25、26、27,26,27の突起領域における軸索末端での送信機放出を調節することができる。
ここでの研究では、光遺伝学は、不安関連の行動を分析するための実験と組み合わせて使用されます。不安関連の精神疾患は、世界人口の3分の1以上に影響を及ぼす28,29,30人で、経済的負担が高い28,29,3031.影響を受けた人々は、覚醒感、緊張感、心配の後に回避行動32、33,33に苦しんでいます。これらの慢性的に発生する否定的な感情は、主に将来の出来事34に焦点を当て、患者の日常生活を強く妨げる。ベンゾジアゼピンや選択的セロトニン再取り込み阻害薬(SSRI)のような一般的な治療法は、患者の一部でのみ成功しています。35の治療に多くの人が反応せず、そのような35病気の根底にあるメカニズムがまだ完全には理解されていない。内側前頭前野(mPFC)は、,不安,21、25、27、36、37、38の発達と症状において重要な役割21,25,2737を38果たすることが知られている。36具体的には、mPFCにおける眼内皮質(IL)領域の過剰活性化は、不安関連障害の一部である可能性があります39,,40.ここで説明する実験例は、mPFC の IL 領域の変調が不安行動にどのように影響するかを理解するのに役立ちます。さらに、不安関連精神疾患に対する新しい治療戦略の開発も潜在的に支持される可能性がある。
生後2〜6ヶ月の雄のNex-Creマウスは、mPFC41のIL領域内の錐体ニューロンにおいて特にChR2を発現するために使用される。Nex-CreマウスはC57Bl/6バックグラウンドを有し、酵素Cre-recombinaseを特に錐体ニューロンで発現する。立体的手術中、二重凝集したChR2-DNAは、アデノ関連ウイルスベクターを介してIL領域に注入される。光学インプラントは関心のある領域の真上に置かれ(図1B)、インプラントは歯科用セメントで固定される。コントロール動物は、細胞特異的発現を模倣するために、同じ領域で二重フロックスtdTomato-DNAの注射を受ける。
動物は手術の日までグループ収容され、その後は他のマウスによる怪我を避けるために単座化されています。マウスは、単一のマウス用のTypI-Lケージ内の個々の換気ケージ(IVC)ラックに収容されます。明暗サイクルは12:12のリズムに従い、明度の位相は午前10時から始まります。すべての行動実験は、げっ歯類の活性段階に似た暗い段階で行われます。水および標準的な食糧の餌は、アドリビタム利用可能である。2週間の回復の後、錐体ニューロンにおけるChR2の十分な発現を保証し、マウスは行動実験に使用される。
オープンフィールド(OF)は、サンドブラスト40センチの高い壁を持つ50cm x 50 cmの正方形の迷路です。地面は、内側の4が中心を表す16の正方形に分割されています。測定される動作は、1) 中心に費やされた時間、2) 中心エントリ数、および 3) 移動距離の合計です。この実験の間、合計20分の4つの試験があります。試験1および3では、光刺激が起こらず、かつ試験2および4において、5ms光パルスと1mWの光強度473nmの20Hz刺激が行われる(図2A)。後の試験では、検査領域への慣れが考慮されたが、シャム注入対照動物の使用は、習慣がどのように表現されているかを示す。
バーンズ迷路は学習と記憶のための実験です。直径92cmの円形プラットフォームで、円周の周りに20の等距離の穴が含まれています。19の穴が閉じられ、1つの穴の下にエスケープボックスが提示されます。4日間連続して、マウスは脱出箱の位置を知るために4つのトレーニング試験を受ける。5日目にエスケープボックスを取り除き、マウスは正しい穴を見つけるのにどれくらいの時間が必要かをテストされます。測定された動作は、1)エスケープボックス/正しい穴が見つかるまでの時間、2)ターゲットの訪問数とエラー数、および3)エスケープボックス内に移動するまでの距離です。異なるグループの光刺激は、トレーニング日1〜4日に行われる取得または統合中、または試験日の検索中(5日目)に行われます(図2D)。
図2 光遺伝学的プロトコルを用いた行動実験A)対応する光刺激プロトコルを用いたオープンフィールド実験の模式図。 C)対応する光刺激プロトコルを用いた上昇プラス迷路実験の模式図。 D)対応する光刺激プロトコルを用いたバーンズ迷路実験の模式図。EPM: 上昇プラス迷路;OF: オープンフィールド;BM:バーンズ迷路テスト。この図は、Berg 201948から変更されています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
光遺伝学的刺激のためには、光強度と周波数を、調査中の光遺伝学的ツールと神経細胞型に適合させなければならない。いくつかの研究は、強い光強度88、2020のために可能な加熱効果があることを示しているように、組織への損傷を避けるために、可能な限り低い光強度を使用する必要があります。ChR2の場合、5 msの光パルスを有する20Hzの刺激が一般的に2.ChR2は非常に光に敏感であるため、1mWの光強度で十分です。光刺激プロトコルは、光のオフと試験の間で交互に行動の変化を測定します。行動実験のための外部の部屋の条件は、動物のグループ全体のために安定したままでなければなりません.考慮すべき重要な条件は、ノイズ(デバイス自体がノイズを作る可能性があることを覚えておいてください)、臭い(常にエタノールで行動設定をきれいにする)、光強度、および実験者です。実験者は常に同じ人物でなければなりません。さらに、実験の時間は、1つのグループ内のすべての動物について同じであるべきであるが、施設内の暗位相の開始の数時間後が好ましい。
この実験の目的は、励起的な錐体ニューロンの強い活性化を通じてIL領域の励起/阻害(E/I)比を増加させることである。この特殊な皮質領域におけるE/I比の強化は、マウス40、42、43、4442,43,44の不安レベルを増加させることが知られている。40
Protocol
Representative Results
Discussion
光を使って神経信号を操作することは、10年近く前から選択されています。,2005年以降、新しい光遺伝学的ツール,,44、6、8、14、49、50、51の開発に関する論文の発表数と、6,814,49,脳回路5121、23、40、43、52,52の研究に利用される研究が大幅に増加しました。21,235040,43,一方で、注射可能な光遺伝学的ツール、移植変異体、トランスジェニックマウスラインおよび行動実験の巨大な多様性により、実験の可能性は多様で無制限である。一方、実験条件を選択する際に障害を起させる可能性は非常に高く、実験は非常に特異的であり、しばしば他の研究との比較が困難である。
重要なステップ
このプロトコルの重要な重要なステップの 1 つは、適切な計画です。光遺伝学的ツールの選択は、科学的な質問と一致する必要があります。ニューロンやシナプスの全体的な活性を操作する必要がありますか?その後、市販のChR22121、25、27、Arch25,27 37などのツールが良い選択です。しかし、それとは別に、1つの特別な神経伝達物質システム、あるいは単一の受容体が操作されるべきならば、個々の受容体キメラはしばしばより良い選択である3、6。6GPCRsを持ついくつかの受容体キメラ、いわゆるOpto-Xr、およびそれらを生成するためのガイドラインは、すでに44、5050利用可能です。光遺伝学的ツールの選択以外に、行動実験と組み合わせたマウスラインも重要です。C57Bl/6 や BALB/cByJ のような異なるバックグラウンド株は、いくつかの点で異なる行動の型を表示します53,,54.C57Bl/6マウスはベースライン不安が低く、抗不安作用に使用できるのに対し、BALB/cByJは不安レベルが高いため、抗不安薬に対してより敏感である。さらに、これらのバックグラウンド株のトランスジェニック変異体も、その表現型48において変化し得る。光遺伝学的ツールおよびトランスジェニックマウスラインと組み合わせて特定のプロモーターの適切な組み合わせを使用すると、ほぼすべての所望の細胞集団を標的とすることができる。
手術中の重要なステップは、正しい場所をターゲットにしています。マウス脳アトラスの助けを借りて、前部後軸、および内側横軸に対する適切な座標、および構造の深さが45に確立され得る。実際には、すべての頭蓋骨は少し異なる形と大きさを持っています。したがって、F因子46 は、立体的手術中の正しい鼻および耳の固定と同様に、立体的座標を調整することは非常に重要である。マウスの頭部が傾いている場合、注入canulaは目的の領域をターゲットにすることができません。
さらに、注入カヌラの直径も重要です。それが小さすぎると、ウイルスを組織に放出することはなく、広すぎると、カヌラは関心のある領域に向かう途中でウイルス溶液を漏らします。埋め込まれた光ファイバーが標的領域の真上で終了する場合、上記皮質領域におけるウイルス発現は重要ではない。しかし、インプラントが軸索末端を刺激するために他の領域の上に置かれる場合、上皮質領域の軸索も光によって活性化され、得られたデータを改ざんする。例として:IL領域と前脳(PrL)領域は、両方とも基礎扁桃体55、56に投影するが、不安26、57の変調において全く異なる26機能と役割を有する。56 57インプラントが扁桃体の上に配置されてIL領域から軸索末端を活性化し、かつ注入ウイルス溶液が誤った注入カヌラのためにPrLに入れられた間に、PrLから軸索末端も活性化するリスクが非常に高い。
インプラントの固定のための頭蓋骨の準備の間に、プライマーおよび結合のまばらな使用は信頼でき、耐久の固定のために重要である。2成分接着システムが薄く適用されない場合、歯科用セメントは数日または数週間後に頭蓋骨から切り離される可能性があります。さらに、そうでなければセメントが頭蓋骨に適切に取り付けられなくなるので、頭蓋骨はまたインプラントを固定する前に完全に乾燥しなければならない。
このプロトコルの動作部分には、重要なステップも存在します。まず、迷路の建設は非常に重要です。すべての動作設定では、サイズとフォームに関する文献に、また、プロシージャ自体58、59、6059に関するいくつかの変種が60存在します。58データを比較可能で再現可能にするバリアントを選択することが重要です。また、使用されるマウスラインの特別な要件は、考慮に入れるべきである 43,,48.EPMの代表的なデータでは、いくつかのNex-Creマウスが迷路から落ちたり、数回滑り落ちたりすることが分かります(図2b)。これらのマウスにとって、両手を広げて小さな壁を持つ迷路は、より良い選択肢だったでしょう。
第二に、すべての外部室条件を一定に保つことが重要である61、そうでなければマウスの異なるグループは全く比較できないであろう。この点で、実験の時間を実験の設定が空いていて、実験者が常に存在する場所として選択することが非常に重要です。さらに、建設工事、システムの試験(火災報知器)やマウス施設の清掃日など、建物内のイベントは、取得したデータとの干渉を避けるために考慮する必要があります。
最後に、行動実験には取り扱いや住宅条件が重要です。移植が行われると、他のマウスによる傷害のリスクがあるため、マウスは単座に収容される必要があります。グループ間の良好な比較と1つのグループ内の低いエラーを確保するために、すべてのマウスは同じケージサイズと濃縮を持っている必要があります。不安関連の実験では、単一のハウジングは、単一の住宅は、singe収容された雄マウスがより低いベースライン不安レベル、不安レベルの変動が少なく、およびより少ないうつ病のような症状15、16を示すようにいくつかの利点を16有する。グループ収容雄マウスは、マウス間の階層のために不安レベルが大きく異なる可能性があります。ハウジングに加えて、すべてのマウスとグループの一定の平等な取り扱いも重要です。インプラントの光ファイバーを接続するためにマウスをつかむことは非常にストレスです。したがって、この手順は、同じ手法と同じ実験者を意味し、すべてのマウスで同じである必要があります。さらに、ストレスの多い接続手順からマウスを落ち着かせるための待機ケージの習慣化時間は、迷路までの期間、ごみ、位置において等しい条件を持つ必要があります。マウス機能内での処理は、後での動作のパフォーマンスにも重要です。実験動物とコントロール動物は、マウスにとってもストレスであるため、異なる日や異なる人々によって洗浄されるべきではありません。さらに、動作の違いを避けるために、洗浄日は実験日であってはなりません。
トラブルシューティング
プロトコル中に発生する可能性のあるいくつかの問題があります。例えば、定位手術中に頭蓋骨全体を掘削すると血管に損傷を与える可能性があります。通常、強い出血は、特にブレグマおよびλの上に起こる。これが起こった場合、彼らはその吸収性のために血管からさらに多くの出血を拡張する傾向があるので、綿棒で出血を止めようとしないでください。
また、ウイルス溶液の圧力注入が機能しないことも起こり得る。この場合、パラフィルム、バリ穴または脳組織からのかさぶたがカヌラの先端を詰まらせている可能性がある。この場合、X軸またはy軸を変更せずに脳からゆっくりとカニューラを取り出し、ツイーザを使用してカニューラ先端の前部の1〜2mmを除去します。再度カンデュラを下げる前に、少量の圧力を加え、ウイルスがカニューラチップから出ているかどうかを確認して機能をテストします。便秘を避けるために、一定の速度でカヌラを下げ、注射側の最も深い深さに達するまで動きを止めないでください。カニューラ先端の多くが除去され、直径が大きすぎると、カニューラは組織に損傷を与え、ウイルスを一度に適用するリスクが高くなります。したがって、チップの詰まった部分のみが慎重に取り除かれないようにしてください。
行動実験中に、ビデオトラッキングソフトウェア(例えば、Ethovision XT)での実験のセットアップが問題を引き起こす可能性があります。たとえば、光出力が正常に動作しない場合、これはいくつかの理由が考えられます。Pulserは、エトビジョンXTが開かれる前に開かれ、プログラムされ、開始されなければならない。ハードウェアは「実験用セットアップ」で正しく選択する必要があります(ステップ3.2.2.4)。間違ったIO-Box、または「コスチュームハードウェア」以外が選択されている場合、Pulserデバイスはエチビジョンによって制御することはできません。光出力のテストが成功しても、取得時に「試行制御設定」のプログラムされたライトプロトコルが機能しない場合、サブルールまたはサブルールの参照が正しく見つからないか、条件とアクションが不明である可能性があります。たとえば、参照は正しいサブルールに属していますか?参照は正しくプログラムされていますか (たとえば、サブルールの実行頻度など)。
さらに、「検出設定」の間に動物が適切に追跡される可能性がありますが、取得中に被験者が見つからないサンプルがあります。この場合、実験室の照明が変更されたか、迷路内で不要な影が生じなかったかを確認します。設定は1つの特定の組み合わせに対してのみ動作するので、迷路の底部全体は同じ色を持っている必要があります。何らかの理由で異なる下の色や影を避けることができない場合は、迷路の最も暗い部分で検出設定を定義します。
最初の動物の取得後に設定を変更する場合は、すでに使用されている設定でこれらの変更を適用しないでください。それらを調整するためにそれらを複製します。これは、既に記録されている試用版がデータ分析に対して有効でなくなったことも意味します。このような場合は、この実験グループのすべての動物を元の設定で記録し、その後、ライブトラッキングの代わりに記録されたビデオを分析する新しい実験を作成します。この「ビデオから」実験では、動物間の比較性やデータを失うことなく、いくつかの設定を分析に使用できます。
制限事項と将来のアプリケーション
自由に動く動物の光遺伝学で行動を操作するこの方法には、制限も含まれる。手術中、2つのインプラントの近接性が制限される。二重注入の場合、2つのインプラント間の距離は、インプラントを保持する装置の幅を最小限にする必要があります。装置は、第1のインプラントが既に固定されている間、バリ穴に第2のインプラントを下げる必要がある。,この解決策は、ガラス繊維の先端が非常に近く、頭蓋骨の上のセラミックフェルールが,23、55、56、57、62、63の方が大きいとき23,55,5657、62斜めの注入であるかもしれません。63斜めの埋め込みの欠点は、光の広がりです。繊維先端が真上からではなく傾斜すると、刺激された領域が異なる。近接して2つのターゲット領域の場合、光刺激の位置の変化を考慮する必要があります。
行動実験の間、迷路の建設は動物に接続された光ケーブルに干渉するかもしれない。明暗ボックスなどの一部の動作テストには、屋内領域64、,65が含まれており、他の迷路にはマウスが入力する必要があるコンパートメントが含まれています。このような実験は、この設定では実行できません。または、ワイヤレス システムはオプション22、26、6626,66です。22しかし、幸いなことに、バーンズ迷路のようないくつかの迷路は、マウスが関連するコンパートメント67に入ることができるような方法で配置することができます。
閉鎖されたゾーンを持つものに加えて、広すぎる迷路も問題を引き起こす可能性があります。迷路の面積が大きいほど、動物が迷路内のすべての位置に移動できるようにケーブルが長くならなければなりません。動物がケーブルを踏んだり、それをつかんで噛むことができないことを注意する必要があります。その解決策は、冗長ケーブルをロールアップする構造である可能性があります。欠点は、ケーブルを展開するドラッグがマウスにとって難しいということです。この溶液は、ラットに適した方が良いでしょう。別の可能な選択肢は、実験中ではなく、光刺激を事前に行うためであり得るが、もちろんこれは光刺激による長期的な効果が23に生じる場合にのみ実現可能である。
既存/代替方法との比較
別の方法は、行動88、1818の間に化学的または電気的刺激である。化学アゴニストまたはアンタゴニストは、特定の受容体を介してニューロンを活性化または沈黙させることができ、また、単一の神経伝達物質システム38、68,68を操作することができる。一方で、受容体特異性は、特定のアゴニストまたはアンタゴニストが特定の受容体39のみを活性化するので、化学物質にとって非常に高い。一方、同一神経伝達物質群の受容体サブタイプに対する特異性は、しばしば不十分である。ほとんどの化学物質は、確率が異なる少なくとも2つのサブタイプに結合する。さらに、化学物質は、同じ受容体タイプを持っている限り、神経細胞タイプを区別することはできません。それ以上に、時間的および空間的分解能は、光遺伝学と比較して化学操作に対して貧弱である。アゴニストまたはアンタゴニストは、しばしば経口35または全身注射57、70,70を介して投与される。化学物質の注入が脳組織で直接行われる場合、効果は経口用途よりも速く現れるが、光刺激よりも遅いタイムスケールではまだ遅い。投与された化学物質は脳内に拡散し、神経細胞の種類や脳領域に特異的ではないため、特定の脳回路の操作は不可能である。
電気刺激は、化学的刺激99,1414よりも高い時間分解能を有する。神経組織内の広がりは化学的刺激よりも少なく、空間分解能は化学的刺激よりも優れています。しかし、電気刺激は、電極に近接するすべてのニューロンが電気刺激に応答するので、異なるニューロン細胞タイプまたは受容体タイプに特異的に対処する可能性を欠いている。
自由に動くマウスにおける行動の代替方法は、例えば脳スライスにおける電気生理学的記録であり、そこで単一のニューロンまたは軸索を光遺伝学で変調することができ、誘引効果は、記録電極66、7171を介して測定することができる。インビトロ実験は、光遺伝学的刺激の分子および細胞基盤を調査する可能性を提供するが、他の脳領域からの本質的な接続性および入力が欠落しているという制限がある。もう一つの選択肢は、光遺伝学を多光子イメージング11,72と組み合わせて使用することです。この場合、マウスは頭を固定し、麻酔をしたり、単純なタスクを解決するために目を覚ますことができます。
光遺伝学的実験を成功させるために、幅広いツールやアプリケーションが利用可能です。光遺伝学的ツールの選択と行動のセットアップは、特定の研究の質問に答えるために重要です。ツールと実験の適切な組み合わせを選択した場合、光遺伝学は、高い時間的および空間的分解能を持つニューロン回路の前例のない、詳細な調査を可能にします。これは、精神疾患や認知のための新しい治療戦略を理解し、開発するのに役立ちます.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
クラウス・アルミン・ナルヴェ教授とサンドラ・ゲッベルス博士(ドイツ・ゲッティンゲンのマックス・プランク実験医学研究所)に感謝します。また、この記事のJoVEビデオの録画と処理に関するビデオチームのユヌス・ディキチとルーベン・ヴィースナーに感謝します。さらに、クリスティン・クラウセンのナレーションとキンバリー・アン・ゴーが原稿を校正してくれたおかげです。
提示された結果はボーフムのルール大学で得られ、ビデオはブレーメン大学で記録されました。
この作品は、ドイツ・フォルシュングスゲマイインシャフト(DFG、ドイツ研究財団)によって資金提供されました – Projektnummer 122679504 – SFB 874とDFG MA 4692/3-2。
Materials
| Ketamin | Sigma-Aldrich | K2753-64 | Anestasia |
| 20 % Glucose | AlleMan Pharma | Injection s.c. for fast recovery | |
| Behavioral mazes | Costum made | Measure anxiety | |
| Bepanthen | Bayer | Ophthalmic oinment | |
| Betaisodona | Monodipharma | Sterilant containing iodine | |
| Betaisodona | Monodipharma | Iodine oinment | |
| Binocular | Olympus | SZ52, 110AL0.62x WD160 | Surgery |
| Ceramic ferrules | Thorlabs | CFLC230-10 | Implant |
| Ceramic Fiber Scribe | Thorlabs | CSW12.5 | Cutting of the glass fiber |
| Channelrhodopsin2-YFP virus | Penn Vector Core | Addgene 20298 | Optogenetic tool |
| Compressed air | Kontakt Chemie | Druckluft 67 | Drying of the skull |
| Coordinate system | Stoelting | Stereotactic coordinates for the surgery | |
| Correl Draw | Graphical software version 13 | ||
| Cryoslicer | MICROM | HM500OM | Production of brain slices for staining |
| Ethovision XT 14 | Noldus | Software for behavioral tracking | |
| Exel | Statistical Software | ||
| Ferrule Polishing Puck | Thorlabs | D50-F | Polishing implants round side |
| Fiber Patch Cord dual | Prizmatix | Optogenetics-Fiber 500, 1,20 m, Ferrule core 1,25 mm | Cables, which are connected with the two implants of a bilateral implantation |
| Fiber Patch Cord single | Prizmatix | Optogenetics-Fiber 500, 1,20 m, Ferrule core 1,25 mm | Cable, which is connected with the implant via a sleeve |
| Fiber Stripping Tool | Thorlabs | T06S13 | Stripping glass fiber for implant |
| Filter paper | VWR European | 516-0300 | Cut into pieces for the Novelty-Suppressed Feeding test |
| Food pellets | Mühle Levers | Höveler Nagerfutter | Nutrition for the mice |
| Glass pipettes | Harvard Apparatus | GC150-10 | Injection pipettes |
| Gradia direct-Flo | Henry Schein | 103322 | Fluid dental cementum |
| Heating lamp | efbe-Schott/Phillips | R95E | Prevent the mice from cooling after the surgery |
| Heating plate | Stoelting | Integrated into coordinate system | |
| Injection canula | Braun | 100 Sterican, 0,4 x 20 mm, Gr. 20 | All injections and to bore hole into the skull |
| Litter | T 1350 | Grounding for the Novelty-Supressed Feeding test | |
| Mouse cages | Zoonlab | 405 cm^2 | Single housing for experiments |
| Optibond FL | Kerr | 26684E | Preparation of the skull for implantation |
| Optical glass fiber | Thorlabs | FT200EMT | Light fiber for implant |
| Optogenetics-LED.STSI | Prizmatix | Optogenetic toolbox for light stimulation during behavioral experiments | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 16005-1KG-R | Perfusion of mice to remove the brains |
| Polishing sheet 0.02 µm grit | Thorlabs | LFCF | Polishing implants round side |
| Polishing sheet 1 µm grit | Thorlabs | LF1D | Polishing implants round side |
| Polishing sheet 30 µm grit | Thorlabs | LF30D | Polishing implants round side |
| Polishing sheet 6 µm grit | Thorlabs | LF6D | Polishing implants round side |
| Pulser Software | Prizmatix | Software for light device control | |
| Rimadyl-Carprofen | Zoetis | Analgesia | |
| Sigma Plot | Software for statistics | ||
| Sleeve | Thorlabs | FT200EMT | Connection of implant and light cable |
| SodiumCloride (NaCl) | Braun | 3570410 | Rinsing of the skull |
| Superglue | Pattex Henkel | To Fix the glass fiber in the ferrule | |
| td-Tomato virus | Penn Vector Core | Addgene 51503 | Optogenetic tool |
| UV light | KoQGHJ | wireless, 1200 mW/cm^2 | Polymeration lamp for dental cementum |
| Xylavet-Xylazin | cp pharma | Anesthesia |
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