Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity to Modulate Behavior in Freely Moving Mice

Laura Berg; Jill Gerdey; Olivia  A. Masseck

doi:10.3791/61023

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Behavior

Manipolazione optogenetica dell'attività neuronale per modulare il comportamento nei topi in movimento libero

Published: October 27, 2020

doi:

10.3791/61023

Laura Berg^1,2, Jill Gerdey^1,2, Olivia A. Masseck^1,2

¹Biology and Chemistry, Synthetic Biology,University of Bremen, ²Advanced Fluorescence Microscopy, Faculty of Biology and Biotechnology,Ruhr-Universität Bochum

Summary

Con la manipolazione optogenetica di specifiche popolazioni neuronali o regioni cerebrali, il comportamento può essere modificato con alta risoluzione temporale e spaziale in animali in movimento libero. Utilizzando diversi strumenti optogenetici in combinazione con fibre ottiche cronicamente impiantate, è possibile eseguire una varietà di modulazioni neuronali e test comportamentali.

Abstract

La modulazione optogenetica dei circuiti neuronali nei topi in movimento libero influisce sul comportamento acuto e a lungo termine. Questo metodo è in grado di eseguire manipolazioni di singoli neuroni e rilascio del trasmettitore specifico della regione, fino a interi circuiti neuronali nel sistema nervoso centrale, e consente la misurazione diretta dei risultati comportamentali. I neuroni esprimono strumenti optogenetici attraverso un’iniezione di vettori virali che trasportano il DNA preferito, come Channelrhodopsin2 (ChR2). La luce viene portata in specifiche regioni cerebrali tramite impianti ottici cronici che terminano direttamente sopra la regione di destinazione. Dopo due settimane di recupero e corretta espressione-strumento, i topi possono essere ripetutamente utilizzati per test comportamentali con stimolazione optogenetica dei neuroni di interesse.

La modulazione optogenetica ha un’alta risoluzione temporale e spaziale che può essere eseguita con un’elevata specificità cellulare, rispetto ai metodi comunemente utilizzati come la stimolazione chimica o elettrica. La luce non danneggia il tessuto neuronale e può quindi essere utilizzata per esperimenti a lungo termine e per più esperimenti comportamentali in un topo. Le possibilità di strumenti optogenetici sono quasi illimitate e consentono l’attivazione o il silenziamento di interi neuroni, o anche la manipolazione di un tipo di recettore specifico dalla luce.

I risultati di tali esperimenti comportamentali con stimolazione optogenetica integrata visualizza direttamente i cambiamenti nel comportamento causati dalla manipolazione. Il comportamento dello stesso animale senza stimolazione leggera come base è un buon controllo per i cambiamenti indotti. Questo permette una panoramica dettagliata dei tipi neuronali o sistemi di neurotrasmettitori coinvolti in comportamenti specifici, come l’ansia. La plasticità delle reti neuronali può anche essere studiata in grande dettaglio attraverso la stimolazione a lungo termine o le osservazioni comportamentali dopo la stimolazione ottica. L’optogenetica aiuterà a illuminare la segnalazione neuronale in diversi tipi di malattie neurologiche.

Introduction

La modulazione dei circuiti neuronali nel sistema nervoso centrale e i loro esiti comportamentali sono importanti per capire come funziona il cervello, soprattutto nelle malattie psichiatriche e nei compiti cognitivi come l’apprendimento e la memoria. Con l’optogenetica, le singole cellule o le popolazioni cellulari fino a circuiti interi possono essere modulate dalla luce. Gli strumenti optogenetici comuni come Channelrhodopsin2 (ChR2) o Archaerhodopsin (Arco) sono in grado di attivare o silenziare i neuroni, o aumentare o inibire il rilascio del trasmettitore ai terminali assoni che proiettano in regioni cerebrali^{distinte 1}^,²^,³^,⁴. Tuttavia, Arch deve essere utilizzato con attenzione come è stato dimostrato che la sua attivazione ai terminali presinaptici aumenta il rilascio spontaneo del trasmettitore⁵. Arch è una pompa di protone di rettifica verso l’esterno che modifica il valore del pH all’interno della cella. Questo ambiente alcalino induce l’afflusso di calcio e migliora il rilascio del trasmettitore⁵. Per modulare in modo specifico le vie di segnalazione intracellulari, le chimere recettorie composte da uno strumento optogenetico leggero, come la rodopsina o l’opsin cono, in combinazione con un adeguato recettore accoppiato G-proteina, possono essere^{create 6}^,⁷^,⁸. La quantità e la variazione degli strumenti optogenetici disponibili è aumentata in modo significativo nell’ultimo decennio⁹.

Lo scopo dell’optogenetica è quello di manipolare i circuiti neuronali durante il comportamento. L’optogenetica consente, ad esempio, la misurazione di cambiamenti comportamentali acuti come i cambiamenti nel comportamento di ansia. Gli strumenti optogenetici vengono consegnati nelle regioni bersaglio del cervello tramite vettori virali. Con l’aiuto di promotori e potenziatori speciali, o del sistema Cre-loxP, è possibile garantire la specificità del tipo di cella per l’espressione di strumenti optogenetici (Figura 1A). Ci sono diverse linee di topo geneticamente modificate che esprimono l’enzima Cre-Recombinase solo in tipi di cellule specifiche. Ad esempio, i topi Nex-Cre esprimono la Cre-Recombinase nei neuroni piramidali nella corteccia e nell’ippocampo sotto il controllo del Nex-promotore¹⁰. Questo enzima è in grado di invertire le sequenze di DNA, che sono affiancate da lati loxP¹¹. Di conseguenza, la sequenza di DNA di uno strumento optogenetico a doppio floxed, invertito e affiancato da lati loxP, può essere trascritta solo da neuroni che possiedono la Cre-Recombinase, ma non da altri tipi neuronali¹²^,¹³. Nel caso dei topi Nex-Cre, lo strumento optogenetico sarà espresso esclusivamente nei neuroni piramidali. La stimolazione della luce di alcune regioni cerebrali viene quindi ottenuta attraverso l’impianto cronico di fibre ottiche direttamente sopra la regione di interesse. Gli animali possono quindi essere accoppiati a una fonte di luce adatta e comportarsi liberamente in quasi tutti i tipi di test comportamentali.

Figura 1: Iniezione e impianto. A) Sistema Cre-loxP per ChR2-YFP. Doppio strumento optogenetico floxed è confezionato in un virus associato adeno (AAV) per l’iniezione nel tessuto cerebrale. B) Vista sagittale dell’iniezione di virus e dell’impianto di un’interfaccia neuronale ottica nella/sopra la regione IL dell’mPFC. L’iniezione e l’impianto sono stati fatti dall’alto. Vengono visualizzate tutte le aree di interesse, IL, BLA e DRN. C) Vista dettagliata della fibra ottica impiantata, del manicotto e della sorgente luminosa. D) Diffusione della stimolazione della luce laser blu e rossa nel tessuto cerebrale della materia grigia da una fibra luminosa di 200 m (Yizhar et al. 2011). La luce blu si diffonde, al massimo, 0,5 mm nel tessuto, luce rossa di circa 1 mm. Codifica a colori: rosso 50%, giallo 10%, verde 5%, blu 1% se la luce raggiunge quest’area. E) Vista coronale dell’impianto unilaterale direttamente sopra l’IL sinistro con una fibra ottica di 200 m. La regione IL ha una larghezza di 0,25 mm in ogni emisfero e una profondità di 0,2 mm. Le lampadine blu e rosse sono il boarder di diffusione della luce del 5% e vengono trasferite da Yizhar et al alla giusta dimensione. LoxP: locus di X-over P1; ChR2: Channelrhodopsin; YFP: proteina fluorescente gialla; dflox: doppio floxed; IL: corteccia infralimobica; BLA: amigdala basolaterale; DRN: nuclei di raphe dorsali; PrL: regione prelimbica. Questa cifra è stata modificata da Berg 2019⁴⁸. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli approcci optogenetici sono utilizzati in quanto consente sia alta risoluzione temporale e spaziale^{14 e la} modulazione specifica del tipo di cellula. Inoltre, è possibile utilizzare ripetutamente il dispositivo impiantato senza ulteriori trattamenti. Dopo un intervento chirurgico stereotattico, in cui viene eseguita l’iniezione di un virus associato all’adeno che trasporta lo strumento optogenetico e l’impianto della fibra ottica, i topi possono recuperare per due settimane. Abbiamo scelto un tempo di recupero di solo 2 settimane, perché questo è abbastanza tempo per recuperare dall’intervento chirurgico e per il virus di esprimere. Poiché gli esperimenti comportamentali sono seguiti dall’immunohistochimica, dobbiamo garantire che i topi non dis abbiano troppo a lungo durante l’esperimento; in caso contrario, la qualità del tessuto è diminuita. Non mostrano evidenti danni comportamentali dall’impianto e si impegnano in un comportamento tipico della gabbia. Naturalmente, l’impianto è accompagnato da una lesione chirurgica significativa; pertanto, i topi sono monitorati intensamente. Dopo l’intervento chirurgico, i topi devono essere alloggiati in un singolo, poiché i topi alloggiati in gruppo tendono a ferire le ferite e gli impianti freschi dell’altro. Tuttavia, le condizioni abitative hanno un grande impatto sul livello di ansia dei topi maschi, poiché i topi singoli ospitati mostrano livelli di ansia^{più bassi 15} e in generale sintomi meno depressivi¹⁶.

La manipolazione chimica o elettrica dei circuiti cerebrali non ha l’alta specificità del tipo di cellula dell’optogenetica e ha una risoluzione temporale e spaziale^{inferiore 14}^,¹⁷^,¹⁸. A seconda della domanda sperimentale, la stimolazione elettrica o chimica può avere diversi vantaggi. Quando si passano terminali in fibra in una regione specifica anche bisogno di essere stimolato, stimolazione elettrica è il metodo migliore. La stimolazione chimica è una buona scelta per quando i recettori specifici del trasmettitore in un’intera regione dovrebbero essere attivati dagli agonisti. Un altro grande vantaggio dell’optogenetica rispetto alla stimolazione chimica o elettrica è che endogenamente, i neuroni non sono sensibili alla luce, che evita l’insorgenza di effetti^{collaterali 19}. Infatti, intensità di luce elevata potrebbe indurre effetti di riscaldamento⁸^,²⁰, ma a causa di gruppi di controllo adeguati, gli effetti comportamentali dovuti alla manipolazione optogenetica possono essere eliminati.

Lo esame del comportamento dei roditori, soprattutto per quanto riguarda le malattie psichiatriche, è notevolmente migliorato con l’optogenetica negli animali in movimento libero, in quanto consente la modulazione diretta di singoli recettori fino a specifiche popolazioni^{cellulari 21} e circuiti²². La possibilità di misurare gli effetti acuti di tali modulazioni, così come gli effetti comportamentali a lungo termine dopo un tempo^{definito 23} o dopo la stimolazione^{cronica 24}, consente un’ampia flessibilità di progetti sperimentali e fornisce informazioni molto dettagliate sui circuiti cerebrali. La stimolazione della luce può essere utilizzata per modulare i neuroni situati nel sito di iniezione dello strumento optogenetico. Quando sia l’iniezione che l’impianto rifornano alla stessa regione del cervello, i corpi cellulari e gli assoni di protesi posteriore di neuroni e interneuroni principali in questa regione possono essere^{mirati 3}^,⁶^,⁸. Tuttavia, la fibra luminosa può anche essere impiantata in una regione diversa da quella iniettata. In questo caso, la stimolazione della luce può modulare il rilascio del trasmettitore ai terminali d’assone nelle aree di proiezione della regione iniettata²⁵^,²⁶^,²⁷.

Nello studio qui, l’optogenetica viene utilizzata in combinazione con esperimenti per analizzare il comportamento legato all’ansia. Le malattie psichiatriche legate all’ansia colpiscono più di un terzo della popolazione^{mondiale 28}^,²⁹^,^{30 e} causano un elevato onere economico³¹. Le persone colpite soffrono di una sensazione di eccitazione, tensione e preoccupazione seguita dal comportamento di^{evitamento 32}^,³³. Queste emozioni negative cronicamente presenti, che si concentrano principalmente su eventi futuri³⁴, interferiscono fortemente con la vita quotidiana dei pazienti. Trattamenti comuni come benzodiazepine o inibitori selettivi della ricorsiva della serotonina (SSRI) hanno successo solo in alcuni dei pazienti. Una grande quantità di persone non risponde al trattamento a^{tutti 35}, dimostrando che il meccanismo alla base di tali malattie non è ancora pienamente compreso. La corteccia prefrontale mediale (mPFC) è nota per svolgere un ruolo importante nello sviluppo e nella manifestazione^{dell’ansia 21}^,²⁵^,²⁷^,³⁶^,³⁷^,³⁸. In particolare, l’iperattivazione della regione di corteccia infralimbice (IL) nell’mPFC potrebbe far parte di disturbi legati^{all’ansia 39}^,⁴⁰. L’esperimento di esempio qui descritto potrebbe aiutare a capire come le modulazioni nella regione IL del mPFC influenzano il comportamento di ansia. Inoltre, lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche per le malattie psichiatriche legate all’ansia può anche essere potenzialmente supportato.

Topi Nex-Cre maschi di 2-6 mesi sono utilizzati per esprimere ChR2 specificamente nei neuroni piramidali all’interno della regione IL del mPFC⁴¹. I topi Nex-Cre hanno uno sfondo C57Bl/6 ed esprimono l’enzima Cre-ricombinazione specificamente nei neuroni piramidali. Durante un intervento stereotattico, il doppio ChR2-DNA viene iniettato nella regione IL tramite vettori virali associati a adeno. L’impianto ottico è posizionato direttamente sopra la regione di interesse (Figura 1B) e l’impianto è fissato con cemento dentale. Gli animali di controllo ricevono un’iniezione di tdTomato-DNA a doppia floxed nella stessa regione per simulare l’espressione specifica delle cellule.

Gli animali sono alloggiati in gruppo fino al giorno dell’intervento chirurgico e successivamente sono alloggiati in modo singolo per evitare lesioni da altri topi. I topi sono alloggiati in singoli rack di gabbia ventilata (IVC) in gabbie TypI-L per topi singoli alloggiati. Il ciclo chiaro-scuro segue un ritmo di 12:12 h, la fase di luce a partire dalle 10:00. Tutti gli esperimenti comportamentali vengono eseguiti nella fase oscura, che assomiglia alla fase attiva dei roditori. Acqua e pellet di cibo standard sono disponibili al libitum. Dopo due settimane di recupero, che assicura un’espressione sufficiente di ChR2 nei neuroni piramidali, i topi vengono utilizzati per esperimenti comportamentali.

L’Open Field (OF) è un labirinto quadrato di 50 cm x 50 cm con pareti alte 40 cm. Il terreno è diviso in 16 quadrati dove il 4 interno rappresenta il centro. Il comportamento misurato è: 1) tempo trascorso al centro, 2) numero di voci centrale e 3) distanza totale spostata. Durante questo esperimento, ci sono 4 prove per un totale di 20 minuti. Nelle prove 1 e 3, non si verifica alcuna stimolazione della luce e nelle prove 2 e 4 viene eseguita una stimolazione a 20 Hz con impulso di luce di 5 ms e un’intensità di luce di 1 mW di 473 nm (Figura 2A). Nelle prove successive, è stata presa in considerazione l’assu stesse assu stesse esodimento dell’area di prova, ma l’uso di animali di controllo finti indica come viene espressa l’assuno.

Il Labirinto barnes è un esperimento per l’apprendimento e la memoria. Si tratta di una piattaforma circolare di 92 cm di diametro e contiene 20 fori equidibili intorno alla circonferenza. 19 dei fori sono chiusi e sotto un foro viene presentata una scatola di fuga. Per 4 giorni consecutivi, i topi hanno 4 prove di formazione per imparare la posizione della scatola di fuga. Il quinto^{giorno, la} scatola di fuga viene rimossa e i topi vengono testati su quanto tempo hanno bisogno per trovare il foro corretto. Il comportamento misurato è: 1) Tempo fino a quando non viene trovata la casella di fuga/foro corretto, 2) Numero di visite e errori di destinazione e 3) Distanza spostata fino a quando nella casella di fuga. La stimolazione leggera in diversi gruppi viene eseguita durante l’acquisizione o il consolidamento, che si svolgono nei giorni di allenamento 1-4, o durante il recupero il giorno di test, che è il giorno 5 (Figura 2D).

Figura 2: Esperimenti comportamentali con protocolli optogenetici. Oggetto T:System.Drawing.Drawing2D.Drawing2D4D.A4 per il metodo F:System.Windows.Data.Data. C) Disegno schematico dell’esperimento Elevated-Plus Maze con il protocollo di stimolazione della luce corrispondente. D) Disegno schematico dell’esperimento Barnes Maze con il corrispondente protocollo di stimolazione della luce. EPM: Labirinto Elevato-Plus; OF: Campo aperto; BM: Barnes Maze Test. Questa cifra è stata modificata da Berg 2019⁴⁸. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Per la stimolazione optogenetica, l’intensità e la frequenza della luce devono essere adattate allo strumento optogenetico e al tipo neuronale in esame. La più bassa intensità di luce possibile deve essere utilizzata per evitare danni al tessuto, come diversi studi hanno dimostrato che ci sono possibili effetti di riscaldamento a causa della forte intensità^{della luce 8}^,²⁰. Per ChR2, una stimolazione a 20 Hz con un impulso di luce di 5 ms è comunemente utilizzata². Poiché ChR2 è abbastanza sensibile alla luce, l’intensità della luce di 1 mW è sufficiente. Il protocollo di stimolazione della luce si alterna tra le prove di luce spenta e su per misurare direttamente i cambiamenti comportamentali. Le condizioni della stanza esterna per gli esperimenti comportamentali dovrebbero rimanere stabili per l’intero gruppo di animali. Condizioni importanti da considerare sono il rumore (tenere a mente che i dispositivi stessi potrebbero fare rumore), l’odore (pulire sempre le configurazioni comportamentali con l’etanolo), l’intensità della luce e lo sperimentatore. Lo sperimentatore deve essere sempre la stessa persona. Inoltre, l’ora del giorno degli esperimenti dovrebbe essere la stessa per tutti gli animali in un gruppo, poche ore dopo l’inizio della fase oscura nella struttura è preferito.

L’obiettivo di questo esperimento è quello di aumentare il rapporto eccitazione/inibizione (E/I) nella regione IL attraverso una forte attivazione di neuroni piramidali eccitatori. Un rapporto E/I migliorato in questa regione speciale della corteccia è noto per aumentare i livelli di ansia nei topi⁴⁰^,⁴²^,⁴³^,⁴⁴.

Protocol

Le procedure che coinvolgono soggetti animali sono state approvate dalla struttura istituzionale di ricerca sugli animali e dal “Senatorin fàr Wissenschaft, Gesundheit und Verbraucherschutz” presso l’Università di Brema (#146) 1. Preparazione dell’impianto ottico9 (Figura 1C) Mettere un lato piatto di ferrule in ceramica in una morsa panca. Spogliare il mantello di una fibra di vetro di 200 m di diametro con uno strumento di stripping fibra e tagliare pezzi lunghi 2-3 cm con uno scriba in fibra ceramica. Posizionare il pezzo di fibra di vetro nel ferrule ceramico con uno sbalzo uniforme su entrambi i lati. Posizionare una goccia di supercolla sul lato piatto della ferrule in ceramica con una canula di iniezione.NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui. Togliere il pre-impianto dalla morsa della panca e sul lato rotondo della ferrule in ceramica, tagliare la fibra di vetro il più breve possibile con lo scriba in fibra ceramica. Posizionare il preimpianto su un disco di lucidatura ferrule e lucidare il lato rotondo su 4 diverse carte di lucidatura, disegnando un otto 20 volte per carta (30 grana di zm, 6 grana di zm, 1 m di grana, e infine 0,02 m di grinta). Togliere il pre-impianto dal disco di lucidatura ferrule e tagliare la fibra di vetro sul lato piatto della ferrule in ceramica fino alla lunghezza necessaria per l’impianto. Iniziate a misurare la lunghezza dietro la supercolla sporgente. Per una superficie di taglio uniforme basta graffiare la fibra di vetro 2-3 volte e poi romperla.NOTA: Utilizzare l’atlante cerebrale del topo di Paxinos e Franklin45 per calcolare la lunghezza dell’impianto. L’impianto deve terminare direttamente sopra la regione di interesse e lo spessore del cranio deve essere incluso nel calcolo della lunghezza. Per stimolare la regione IL, la fibra di vetro ha una lunghezza di 1,8 mm (Figura 3). Figura 3: Atlante del cervello del topo (Paxinos e Franklin) con lunghezza rappresentativa dell’impianto per raggiungere la regione IL. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Disinfettare l’impianto finito per 10 minuti in etanolo e lasciarlo asciugare prima dell’impianto. 2. Iniezione e impianto Trasportare un singolo topo nella sala operatoria e pesarlo. Applicare l’anestesia con un’iniezione intraperitoneale (i.p.) di Ketamina/Xylazine (Ketamina 0,12 mg/g, Xylazine 0,01 mg/g). Fissare il mouse con la mano sinistra e girarlo sulla schiena con la testa tenuta bassa. Mirare il quadrante inferiore sinistro dell’addome con la siringa ed inserire la canula di iniezione 1 cm sotto la pelle. Iniettare l’anestesia in un movimento lento e costante nella cavità addominale. Mettere il mouse di nuovo nella sua gabbia e attendere che raggiunga un profondo stato di anestesia.NOTA: La profondità dell’anestesia può essere determinata dall’assenza di riflessi lampeggianti e tra le dita dei piedi. Posizionare il mouse su una piastra di riscaldamento e fissare la testa in un telaio stereotattico. Fissare il naso e i denti nella parte anteriore, e le orecchie su entrambi i lati.NOTA: la testa deve essere dritta sull’asse sinistra-destra e rostral-caudal per garantire la corretta coordinazione stereotassica. Applicare l’analgesia con 2 mg/kg Carprofen sottocutaneamente nella parte posteriore del mouse e applicare un unguento opaco sull’occhio su entrambi gli occhi per proteggerli dall’essiccazione. Inumidire i capelli sul cuoio capelluto con un tovagliolo di carta bagnato e poi tagliarlo con le forbici. Assicurarsi di rimuovere tutti i capelli sciolti con l’asciugamano di carta bagnata. Per disinfettare il cuoio capelluto, utilizzare un bastoncini di cotone e prendere 0,5 mL di una tintura contenente iodio (Betaisodona 100 mg/mL iodio Povidon e 11 mg/mL di iodio) e lasciare asciugare l’aria.NOTA: Invece di forbici, anche un tagliacapello elettrico può essere utilizzato per una corretta depilazione. Sollevare il cuoio capelluto sopra la regione di interesse con un tweezer e tagliare 1 cm lungo la linea mediana. Utilizzare due pinzette per spingere la pelle da parte per esporre il cranio. Assicurarsi di rimuovere anche la pelle sottile sopra il cranio e lasciare asciugare il cranio esposto. Sgrossare il cranio per un successivo impianto. Applicare una goccia di acido fosforico di 2 mm x 2 mm (37%) dal kit adesivo (ad esempio, Optibond) sul cranio, distribuirlo con la punta della siringa e lasciare che abbia effetto per 15 s. Togliere tutto l’acido con un bastoncini di cotone e sciacquare il cranio con 1 mL dello 0,9% NaCl due volte. Asciugare il cranio con un bastoncini di cotone e aria compressa.Attenzione: L’acido fosforico è pericoloso e deve essere rimosso completamente per evitare danni ai tessuti. Calcolare il fattore F per le singole coordinate. Posizionare una canula di vetro nel telaio stereotattico e localizzarla direttamente sopra bregma. Azzera il sistema di coordinate e sposta la canula di vetro nell’espressione lambda. Calcolare il fattore F46 con la seguente formula: Moltiplicare il fattore F con le coordinate dell’atlante del cervello del mouse per regolarle sul singolo mouse. Forare un foro nel cranio per l’iniezione. Utilizzare le coordinate regolate per trovare la posizione sul cranio direttamente sopra la struttura di interesse e contrassegnarlo utilizzando la punta di una canula di iniezione graffiando sopra la superficie ossea. Utilizzare la canula di iniezione per praticare un foro nel cranio nella posizione contrassegnata ruotando la canula sul posto. Se il sangue fuoriescono dal foro della bava, risciacquare con 1 mL di 0,9% NaCl e asciugare il cranio in seguito. Prendere la soluzione di virus nella canula di vetro. Posizionare una goccia di 100 L di 0,9% NaCl sul cranio e un pezzo di parafilm (1 cm x 1 cm) in cima, lato sterile in su. Posizionare 1-2 L della soluzione di virus sul parafilm e abbassare la punta della canula di vetro in esso. Collegare la canula di vetro a una siringa, applicare una pressione negativa minima e attendere che la soluzione di virus sia presa dalla cannula (entro pochi secondi).NOTA: È importante interrompere l’applicazione della pressione negativa, prima che l’aria venga prelevata nella canula. Pertanto, ci sarà sempre un piccolo residuo della soluzione di virus. Iniettare la soluzione antivirus nella regione di interesse. Posizionare la canula di vetro riempita dal virus sopra il foro della bava. Abbassare lentamente la canula nel foro della bava e azzerare la coordinata z quando la punta della canula è al livello del cranio. Abbassare la canula con attenzione alla posizione più bassa del sito di iniezione. Concentrare il binocolo al menisco della soluzione virale all’interno della canula. Applicare una piccola quantità di pressione positiva con la siringa fino a quando il menisco non viene abbassato marginalmente. Lasciare che il virus si diffonda per 2-3 minuti prima di spostare la canula di vetro verso l’alto nella posizione successiva. Applicare la soluzione antivirus ogni 200-300 m in tutta la regione di interesse. Rimuovere la canula di vetro molto lentamente e scartarla dopo l’iniezione finale. Preparare il cranio per l’impianto con il kit di adesione (ad esempio, OptibondTMFL). Asciugare il cranio con aria compressa. Applicare 5 L di primer (ad es., Optibond, 1-30% (etanolo, acido silicico, glicerinphosphatdimethacrylat, 2-(Methacryloyloxy)ethoxycarbonyl)benzoes-ure, 2-Hydroxyethylmethacrylat)) con il bastone corrispondente e lasciarlo asciugare per 15 s. Applicare 5 L di legame (ad esempio, Optibond, 15-20% 2-Hydroxyethylmethacrylat – 1-2% Alkalihexafluorosilikat(Na)) con lo stesso bastone e curarlo per 20 s con luce UV (420-480 nm).NOTA: È essenziale che il cranio sia asciutto e che il primer e il legame siano applicati in uno strato molto sottile.Attenzione: Non guardare direttamente nella luce UV, poiché la luce UV può danneggiare gli occhi. Posizionare l’impianto direttamente sopra la regione di interesse. Fissare l’impianto nel supporto corrispondente. Asciugare il cranio con aria compressa. Posizionare la punta della fibra di vetro direttamente sopra il foro della bava e abbassarla con attenzione. Smettere di abbassare l’impianto quando la lampadina rimanente di supercolla tocca il cranio. Non esercitare pressione sul cranio!NOTA: Se l’iniezione e l’impianto vengono eseguiti in diverse regioni (ad esempio, raphe dorsale e ippocampo),praticare tutti i fori necessari dopo l’applicazione dell’acido fosforico, ma prima dell’adesione a 2 componenti, seguire le istruzioni descritte in precedenza (passaggio 2.8-2.14). Fissare l’impianto. Controllare se il cranio è ancora completamente asciutto. Applicare il cemento dentale fluido (ad esempio, Gradia direct flo) intorno all’impianto e nell’area circostante e curare per 20 s con luce UV (420-480 nm).NOTA: La quantità di cemento dentale dipende dalla zona del cranio libero. L’intero cranio deve essere coperto da cemento dentale. Applicare altri due strati di cemento e riempire completamente l’area del cranio libera e secca. Curare ogni strato con luce UV (420-480 nm). Finisci l’operazione. Applicare 0,5 g di unguento di iodio (Betaisodona 100 mg/mL di iodio povidone e 11 mg/mL di iodio) all’intera ferita. Iniettare 0,1 mL di glucosio disciolto nello 0,9% di NaCl sottocutaneamente nel collo per un rapido recupero. Rilasciare la fissazione del naso e dell’orecchio, portare il mouse in una gabbia fresca e posizionarlo sotto una lampada riscaldante per evitare la perdita di calore corporeo. Quando il mouse si sveglia, riportarlo nella struttura. Controllare lo stato di integrità almeno una volta al giorno. Prendere le misure appropriate se i topi mostrano costituzioni cattive (ad esempio, garantire analgesia post-operatoria con Carprofen fino a 3 giorni se i topi mostrano segni di dolore).NOTA: Dopo due settimane di recupero, i topi possono essere utilizzati per esperimenti comportamentali. 3. Impostazione di un nuovo esperimento (Esempio di stimolazione ChR2 e campo aperto) Pulsatori Programmare l’impulsore (ad esempio Prizmatix) per la stimolazione della luce. Aprire il software e selezionare la porta COM USB a cui è collegata la sorgente luminosa. Scegliere Seleziona modalità operativa (3) Eseguire la sequenza di impulsi dopo il trigger HIGH, quindi interrompere quando LOW per consentire a un software esterno di controllare la sorgente luminosa. Programmare il protocollo della luce. Per una stimolazione di 20 Hz con impulso di luce di 5 ms: scegliere TI – 23 ms, P1D – 5 ms, P1I – 22 ms e P2D – 0 ms. Premere Avvia sequenza. Questo stato rimarrà fino al termine degli esperimenti.NOTA: Il software di pulsatore (Prizmatix Pulser) deve essere lanciato prima del software di tracciamento video; in caso contrario, il software di tracciamento video non sarà in grado di riconoscere il dispositivo. Software di tracciamento video (ad esempio, Ethovision XT)Crea un nuovo esperimento da un modello predefinito. Aprire il software, passare a File, scegliere Nuovo da modello. Selezionare Applica un modello predefinito. Scegli Live tracking e seleziona la fotocamera premendo Sorgente e conferma la Basler GenICam collegata.NOTA: l’immagine in diretta della fotocamera verrà ora visualizzata nella finestra in alto a destra. Premere Avanti e scegliere l’animale da registrare (Roditori, Mouse). Premere Avanti e selezionare il modello di arena Campo aperto, quadrato. Selezionare il modello di zona Centro, Bordo, Angoli e confermare con Successivo. Confermare 1 oggetto che deve essere monitorato con Successivo. Selezionare Punto centrale, naso-punto e coda-base e confermare il colore animale rispetto allo sfondo come più scuro con Successivo. Confermare la frequenza di campionamento consigliata di 12.5 con Avanti e completare il passaggio. Assegnare un nome appropriato all’esperimento e scegliere un percorso da salvare. Definire le impostazioni sperimentali. Passare a Impostazioni e impostazioni sperimentali. Scegliete rilevamento punto centrale, punto naso e base della coda come feature tracciate. Selezionare Usa hardware di controllo di prova e passare a Impostazioni. Selezionare noldus USB-IO box e confermare con Ok. Scegliere Hardware personalizzato come Tipo di dispositivo alla porta TTL, che è stata collegata al dispositivo a impulsi, e confermare con Ok. Definire le impostazioni dell’arena. Vai a Impostazioni Arena e seleziona Impostazioni Arena 1.NOTA: la fotocamera ora aprirà automaticamente un’immagine di sfondo. Confermare l’immagine con Afferra. Adatta le zone predefinite all’arena reale cambiandone le dimensioni. Utilizzare la freccia e i due simboli alla sua destra. Se alcune zone non sono necessarie, eliminarle. Premere 1. Disegnare Scala per calibrare e tirare una linea da un angolo del labirinto all’altro. Immettere la lunghezza della distanza reale in cm. Ripetere l’operazione per l’altro asse. Verificare se la stimolazione della luce funziona. Vai a Arena – Mappatura hardware e seleziona Test sulla barra grigia. Selezionare Uscita comando 1 Alta e premere Test.NOTA: Ci dovrebbe essere luce che emette dalla fine della fibra ottica. Quando si seleziona Uscita 1 Basso e Test, la stimolazione dovrebbe interromperla. Definire le impostazioni di controllo di prova per 20 minuti di esperimento. Impostare le prove Off1, On1, Off2 e On2 su ciascuna di 5 minuti. Vai a Impostazione controllo prova e seleziona Durata traccia 30 minuti. Preparare la regola principale regolando la condizione: tempo a 20 minuti selezionando Impostazioni e modificare 30 a 20 minuti. Confermare con Ok.NOTA: la condizione per la traccia di avvio deve essere quando il soggetto è nell’arena per 2 secondi. In questo modo il sistema inizierà automaticamente il tracciamento quando il mouse è nell’arena. Creare una regola secondaria per la stimolazione della luce: Vai a Strutture , Altro e selezionare Sottoreno . Assegnare un nome, ad esempio il protocollo di stimolazione della luce. Posizionarlo sotto la regola principale e stendere le due caselle selezionando l’area blu con il courser del mouse. Vai a Condizioni, Tempo e assegna un nome come luce su 1. Regola condizione viene soddisfatta dopo 5 minuti. Confermare con Ok. Posizionare la casella direttamente dietro la casella Inizio regola della sottorete tirandola sulla linea nera. Vai all’azione Hardware personalizzato e denorlo: light ON 1. Selezionare Azione per eseguire come Output 1 Alto e confermare con Ok. Posizionare la casella direttamente dietro la casella Condizione.NOTA: Ora dopo 5 minuti dall’esperimento dovrebbe iniziare la stimolazione della luce. Ripetere i passaggi per definire la condizione di tempo dopo 5 minuti e l’azione Uscita 1 Basso per interrompere la stimolazione della luce dopo altri 5 minuti. Ripetere nuovamente i passaggi per programmare un’altra luce Spent e light On trial. Vai a Strutture Riferimento alla regola secondaria e verificare che il riferimento appartenga alla sottorete corretta. Scegliere Condizioni di avvio come Senza ritardo e Condizioni di arresto come Esegui una volta per ogni condizione di avvio. Confermare con Ok. Posizionare la casella di riferimento tra la casella di azione 1 e la casella di condizione 2 della regola principale e disegnare una linea da Azione – traccia iniziale al Riferimento.NOTA: Ora la regola principale avvia direttamente la sottorete dopo l’avvio della traccia. Definire le impostazioni di rilevamento per mostrare al sistema ciò che dovrebbe tenere traccia. Passare a Impostazioni di rilevamento e selezionare Impostazioni rilevamento 1. Inserire un mouse di prova nell’arena e selezionare Configurazione automatica. Scegli Roditore come tipo di animale e usa il maledetto topo per disegnare una casella intorno al mouse nell’arena. Confermare i risultati OK? domanda con Sì. Definire l’elenco di prova per tutti gli animali sperimentali che devono essere tracciati. Vai all’elenco di prova e pianifica tutti gli animali da registrare oggi: seleziona Aggiungi prove e seleziona un numero. Selezionare tutte le condizioni definite prima per ogni mouse. Denominare correttamente l’ID animale e il trattamento per semplificare successivamente l’analisi.NOTA: l’Animal-ID è irrilevante per il sistema e importante solo per l’analisi dei dati successivi da parte dello sperimentatore. Il raggruppamento nel gruppo Trattamento e controllo è importante per il sistema per sapere come raggruppare e come confrontare tutte le tracce nei passaggi di analisi successivi. Vai a Acquisizione e inizia con l’esperimento. 4. Esperimento Open Field (ansia) Portare il mouse sperimentale nella stanza comportamentale subito prima dell’esperimento per garantire un adeguato livello di ansia.NOTA: Gli esperimenti comportamentali devono essere eseguiti durante la fase buia quando i topi sono svegli e sempre nella stessa fasce oraria per garantire la comparabilità. Accoppiare il mouse attraverso una manica alla sorgente luminosa premendolo delicatamente sulla griglia della gabbia. Mettilo in una gabbia in attesa con lettiera fresca per 10 minuti per abituarsi al cavo leggero. Avviare l’acquisizione premendo il pulsante Start nel software di monitoraggio video (ad esempio, Ethovision XT). Trasferire il mouse dalla gabbia in attesa nell’angolo superiore sinistro del campo aperto. Rimuovere il braccio entro 2 secondi per evitare di tracciare un braccio invece del mouse. Lasciare il campo visivo del mouse durante l’esperimento e mantenere la calma. Dopo 20 minuti, quando l’esperimento è finito, rimuovere il mouse dal labirinto, scollegare il cavo leggero e rimetterlo nella sua gabbia di casa. Riportare il mouse nella struttura. 5. Labirinto Barnes (apprendimento) Portare tutti i topi sperimentali nella stanza comportamentale circa 1 ora prima dell’esperimento. Preparare il Labirinto barneso chiudendo tutti i fori tranne uno, sotto il quale è posizionata una scatola di fuga. Posizionare un muro di cartone al centro della piattaforma, che è l’area di partenza per il mouse. Collegare un mouse alla sorgente luminosa (manicotto su un cavo leggero) in entrambi gli impianti. Posizionare il mouse direttamente nel mezzo del Labirinto di Barnes nella parete del cartone, che impedisce al mouse di correre prima dell’inizio dell’esperimento. Premere Start nel software di tracciamento video (ad esempio, Ethovision XT) e rimuovere il cartone.NOTA: Il software tiene traccia del mouse fino a quando non viene raggiunto il foro corretto, ma si prepara a interrompere manualmente la prova nel caso in cui il software non riconosca la transizione del foro. Togliere il mouse dal labirinto e rimuovere la connessione al cavo della luce.NOTA: se si tratta di una giornata di allenamento con diverse prove per mouse, lasciare il mouse nella sala d’attesa accanto alla sala comportamentale fino all’inizio della sessione di allenamento successiva. Se questo è stato il giorno di prova con una sola prova di prova per mouse, riportare il mouse alla struttura. 6. Analisi dei dati (dati di esempio Open Field con 4 prove distinguibili) Software di tracciamento video (ad esempio, Ethovision XT) Definire i gruppi sperimentali e le prove nel profilo dati. Passare a Profili dati a sinistra e scegliere Controllo . Vai a Nidificazione nella nuova finestra in mezzo a sinistra e seleziona Stato controllo prova. Scegliere l’intervallo di stato dall’azione elemento: avviare traccia per l’azione elemento: la luce va ON 1. Posizionare la casella Nidificazione tra la casella Filtro e la casella dei risultati corrispondente.NOTA: Questo intervallo definito è Off1, che descrive i primi 2,5 minuti dell’esperimento in cui non è presente alcuna stimolazione della luce. Ripetere i passaggi per gli intervalli On1 (dall’elemento Azione: la luce si accende 1 all’elemento Azione: la luce si spegne 1), Off2 (dall’elemento Azione: la luce si spegne 1 alla luce dell’elemento va accesa 2) e On2 (dall’elemento Azione: la luce si accende 2 all’elemento Azione: stop track). Ripetere i 4 intervalli per il gruppo di filtri di controllo.NOTA: ogni casella di annidamento ha bisogno di una propria casella dei risultati con i nomi Off1, On1, Off2, On2. Ora sia il gruppo di trattamento che quello di controllo sono divisi in 4 diverse prove di stimolazione della luce che vengono analizzate separatamente. Definire i parametri da analizzare nel profilo di analisi. Passare a Profili analisi a sinistra e selezionare In zone. Selezionare Variabile dipendente nella zona e selezionare Centro come zona. Fare doppio clic su Al centro e scegliere uno dei punti selezionati e selezionare solo al centro. Prima di uscire dalla finestra, passare a Statistiche di prova e selezionareFrequenza , Durata cumulativa e Latenza per prima. Aggiungere la distanza variabile dipendente spostata.NOTA: in Statistiche grupposcegliere se utilizzare l’errore standard o la deviazione standard come errore. Con questo profilo, sono disponibili i dati per Il tempo trascorso al centro, le voci del centro e la distanza totale spostata. Estrarre i dati Passare a Risultati e selezionare Statistiche e grafici. Premere Calcola per visualizzare i dati analizzati.NOTA: le statistiche di prova fornisce informazioni su ogni singolo mouse e le statistiche di gruppo analizza la media e l’errore per entrambi i gruppi, suddivisi in 4 prove con il grafico a barre corrispondente. Premere Esporta dati e selezionare le statistiche di prova e il percorso da salvare.NOTA: i dati esportati vengono salvati come file Excel e con singoli valori per ogni mouse. In questo file di Excel l’ANIMAL-ID aiuta a identificare i topi. Passare a Visualizzazione Mappa termica e premere Mappe di calore di stampa. Seleziona Prove a destra per vedere le singole mappe di calore per ogni mouse e prova. Fare un clic destro sul mouse ed esportare le mappe di calore come immagini. Tracciato Aprire il file del foglio di calcolo al computer e calcolare i mezzi e gli errori standard (SEM) per tutte e 4 le prove in ogni condizione e gruppo misurato. Generare grafici in un programma di statistiche (ad esempio, Sigma Plot). Copiare i mezzi e SEM nell’ordine corretto dal file del foglio di calcolo a Sigma Plot. Le righe devono contenere i dati per Off1, On1 e così via e le colonne contengono trial, mean e SEM come testine. Selezionare tutte e tre le colonne e passare a Crea grafico. Selezionare la casella Barra e scegliere barre non raggruppate con errore (riga superiore, terza casella). Confermare con Fine per aprire una nuova pagina del grafico. Etichettare l’intero grafico, quindi passare a Home, selezionare la casella Grafico a sinistra e premere Esporta. Selezionare una cartella di destinazione e scegliere MetaFile (.wmf) come formato.NOTA: il formato .wmf può essere elaborato in un secondo momento in un software grafico come CorelDraw. Calcolare le statistiche per i dati ottenuti. Copiare i dati non elaborati dal foglio di calcolo (Off1, On1 e così via) in singole colonne di Sigma Plot. Contrassegnare le colonne da confrontare e passare ad Analisi, scegliere t-test e premere Esegui. Confermare il formato dati Raw con Next ed eseguire il test con Finish.

Representative Results

Lo scopo di questo protocollo è quello di misurare i cambiamenti nel comportamento dei topi geneticamente modificati durante un esperimento optogenetico. La manipolazione optogenetica viene eseguita per iniezione di un vettore virale associato a adeno. La stimolazione della luce nei topi in movimento libero è possibile attraverso l’impianto di una fibra luminosa direttamente sopra la regione di interesse. Nella Figura 4vengono presentati i risultati di un esperimento optogenetico. Una forte attivazione di neuroni piramidali eccitatori nella regione IL tramite ChR2 ha aumentato il comportamento legato all’ansia nel campo aperto. ChR2 è stato iniettato nella regione IL del mPFC nei topi Nex-Cre per l’espressione nei neuroni piramidali (Figura 4A). Durante due test di ansia, il campo aperto (Figura 4B,C) e il test di alimentazione soppressa novità (Figura 4F,G), ChR2 viene stimolato con la luce blu e attiva i neuroni piramidali. Come controllo, un altro gruppo di topi ha ricevuto un’iniezione del fluoroforo tdTomato invece di ChR2(Figura 4D,G). In tale esperimento, l’ansia è definita come evitare l’area centrale più luminosa. I topi mostrano un’elusione intrinseca delle aree aperte perché sono ansiosi di predatori. Nell’esperimento Open Field, illustrato nella Figura 4B, i mouse hanno eseguito 4 prove di 5 minuti ciascuna. Nelle prove 1 e 3 non si è verificata alcuna stimolazione della luce (Off1,2) e nelle prove 2 e 4, è stata eseguita una stimolazione della luce blu con 20 Hz (5 ms impulso di luce) e intensità di 1 mW (On1,2). Le mappe di calore mostrano che, nel gruppo sperimentale, la durata del centro differiva tra le prove Off e On. Durante la stimolazione della luce, i topi rimangono preferibilmente nella zona di confine. Gli animali di controllo preferiscono anche il bordo, ma non cambiano il loro comportamento sulla stimolazione della luce. Nella Figura 4C, le principali misurazioni comportamentali durante l’esperimento Open Field sono mostrate per il gruppo sperimentale. Se i dati hanno superato il test Shapiro-Wilk per la normalità, le statistiche sono state fatte con un test t a due code indipendente. Se il test di normalità non è riuscito, il test Mann-Whitney-Rank Sum è stato utilizzato come alternativa non parametrica. Per questi tipi di esperimenti, è stato scelto un confronto all’interno del gruppo per studiare se la stimolazione della luce può cambiare direttamente il comportamento di ansia nel tempo, indipendentemente dall’ansia di base degli animali sperimentali e di controllo. La durata del centro è diminuita in modo significativo durante entrambe le prove di stimolazione della luce, indicando un aumento dei livelli di ansia. La distanza totale spostata non è stata alterata, dimostrando che il comportamento del locomotore non è stato influenzato. Il numero di voci del centro è stato aumentato, anche se non in modo significativo. Nella Figura 4D, vengono visualizzati i dati del gruppo di controllo. Gli animali di controllo non hanno mostrato alcun cambiamento comportamentale tra le prove Off e On in nessuno dei parametri analizzati, dimostrando che la stimolazione della luce o l’impianto non ha causato gli effetti osservati. In sintesi, questo test mostra una maggiore ansia durante la stimolazione della luce dei neuroni piramidali IL tramite ChR2. Nella Figura 5, i dati di un esperimento optogenetico non riuscito vengono visualizzati per il labirinto Elevated-Plus. Durante l’esperimento Elevated-Plus Maze, presentato nella Figura 5A, i topi hanno completato 6 prove di 3 minuti ciascuna. Nelle prove 1, 3 e 5 non è stata eseguita alcuna stimolazione della luce (Off1, Off2, Off3) e nelle prove 2, 4 e 6, è stata eseguita la stimolazione della luce blu con 20 Hz (5 ms impulso di luce) e 1 mW di intensità (On1, On2, On3). In questi risultati esemplari, la lunghezza del protocollo optogenetico e la costruzione del labirinto stesso non erano adatte alla linea del topo transgenico. In Figura 5B, si può vedere, che diversi topi scivolato fuori dal labirinto con le zampe della schiena o addirittura caduto. Quando questo è accaduto, i topi hanno avuto una seconda possibilità di eseguire l’EPM un giorno dopo. Se sono caduti di nuovo, sono stati esclusi dall’analisi. Quando i topi sono scivolati via più volte, ma sono riusciti a rimanere nel labirinto, i dati sono stati analizzati normalmente. Tuttavia, i dati devono essere interpretati con molta attenzione e gli animali di controllo hanno maggiore importanza. I topi Nex-Cre avevano difficoltà motorie a rimanere a braccia aperte. Per evitare questo, piccole pareti, con un’altezza di 1 cm, avrebbero aiutato per una presa sicura delle zampe di schiena sulle braccia del labirinto. Sia le mappe di calore che i grafici mostrano che i topi sperimentali, così come i topi di controllo, hanno iniziato ad evitare le braccia aperte dalla prova 2 (On1) su (Figura 5C-E). Il tempo a braccia aperte è significativamente diminuito per entrambi i gruppi, così come le voci del braccio aperto. L’analisi del gruppo sperimentale ha ottenuto solo dati che implicano un grande effetto ansiogenico della stimolazione della luce, poiché il tempo sul braccio aperto e le voci del braccio aperto sono significativamente diminuiti durante lo studio On1. Tuttavia, quando si confrontano questi dati con il gruppo di controllo, che mostrano lo stesso comportamento, diventa chiaro che il comportamento osservato non è mediato dalla stimolazione optogenetica, ma per evitare le braccia aperte in generale a causa dell’assuolazione al labirinto. Questi dati sottolineano l’importanza di un gruppo di controllo adeguato per distinguere tra effetti comportamentali mediati dalla stimolazione optogenetica e un possibile adattamento comportamentale. Inoltre, questi dati fanno luce sull’importanza di adattare correttamente un setup sperimentale per soddisfare la linea di mousse specifica e la domanda sperimentale. Per convalidare e rafforzare i dati comportamentali raccolti, i cervelli dei topi vengono rimossi dopo l’ultimo esperimento per controllare la corretta iniezione e impianto (Figura 6). I cervelli sono fissati in paraformaldeide del 4% e rimossi dal cranio. I cervelli sono disidratati nel 30% di saccarosio per 1-2 giorni e criosliced in seguito. Le fette cerebrali coronali spesse 40 m vengono lavate e montate su scivoli oggettivi superfrost con un mezzo di montaggio contenente DAPI, che macchia i nuclei cellulari. Ciò consente l’identificazione delle aree di destinazione nelle sezioni coronali. La fluorescenza del tag YFP o tdTomato indica la posizione dell’iniezione di virus. Nella Figura 6B sono presentati i siti di iniezione esemplari di ChR2-YFP a sinistra (giallo) e tdTomato a destra (rosso). Con l’aiuto di un modello, adattato dall’atlante del cervello dei topi Paxinos e Franklin45, è possibile identificare la regione IL. In entrambe le diapositive, lo strumento optogenetico è espresso nella regione IL, ma anche nelle regioni cerebrali adiacenti. Per una corretta interpretazione, la diffusione della luce blu nel tessuto cerebrale èconsultata 8 (Figura 1D,E). Si può vedere che la luce blu raggiungerà la regione DP al di sotto dell’IL con solo meno del 5% dell’intensità iniziale di 1 mW alla punta della fibra (linea blu nella figura 1D)8. Inoltre, una piccola quantità di luce può andare verso l’alto verso la regione PrL a causa di back-scattering47. Di conseguenza si può dire che la regione IL è illuminata più fortemente, tuttavia anche le regioni adiacenti come la regione DP e PrL possono essere leggermente stimolate. Pertanto, la stimolazione specifica delle cellule IL non è garantita e deve essere eseguita un’analisi immunostochimica delle regioni adiacenti, per vedere se l’attività delle cellule PrL e DP è modulata tramite la luce. Nella Figura 6Cè illustrato un altro importante controllo: la specificità della linea del mouse Nex-Cre. Attraverso la colorazione anticorpale contro i due tipi di cellule nella regione IL, neuroni principio glutatergico e interneuroni GABAergici, si può vedere, che l’espressione ChR2-YFP si verifica solo nei neuroni glutatergici e non con quelli GABAergici. Tutto in tutto, i nostri esperimenti mostrano che con la manipolazione optogenetica durante i test comportamentali, si potrebbero osservare cambiamenti nel comportamento legato all’ansia. Utilizzando più di un test per lo stesso comportamento, è possibile trarre una conclusione affidabile. Inoltre, l’analisi immunostochimica conferma i dati ottenuti. I nostri esperimenti suggeriscono, che l’attivazione specifica dei neuroni piramidali nella corteccia infralimbica ha aumentato il comportamento correlato all’ansia in alcuni saggi. Figura 4: Attivazione optogenetica dei neuroni piramidali IL aumenta il comportamento di ansia. Stimolazione della luce durante gli esperimenti: 473 nm, 1 mW, 20 Hz stimolazione. Oggetto T:System.Windows.Media.Media3D.Media3D.IsDTomato da aggiungere all’oggetto T:System.Windows.Media.Media3D.Is Durante l’esperimento, i neuroni piramidali nella regione IL del mPFC vengono attivati da ChR2. Fette di cervello saggita adattate dall’atlante del cervello del topo Paxinos e Franklin, saggital: lateral o,6. B) Labirinto Open Field con protocollo di stimolazione della luce (20 min con 4×5 min alternati Off e On prove; sinistra) e mappe termiche di esemplari ChR2-iniettati (EXP) e tdTomato-iniettato (CT) topi in tutte e 4 le prove dell’esperimento (a destra). Gli animali EXP trascorrono meno tempo al centro dell’OF quando stimolati con luce laser blu. Per gli animali TC, il tempo trascorso al centro non differisce tra le prove di luce Off e On. C) Dati di gruppo per gli animali EXP nell’OF, n.11. I topi trascorrono molto meno tempo al centro dell’OF quando stimolati con la luce blu (Off1 39.49±6.9 s, Su 19.87±4.47 s, Off2 28.13±8.55 s, On2 23.42±9.32 s, Off1:On1, t-test, p – 0.033, Off1:On2, MWRS, p-0,049, La distanza spostata non è interessata (Off1 2703.09±292,65 cm, On1 3113.4±491,15 cm, Off2 3331.86 ±482,62 cm, On2 3082.17±658,61 cm). Le voci di centro diminuiscono con il tempo, ma non mostrano differenze significative (Off 1 22±3,78, On1 18.45±3.95, Off2 17.36±1.99, On2 13.27±2.64). D) Dati di gruppo per gli animali TC nell’OF, n. 15. Tempo topi trascorrere al centro del OF, la distanza spostata, il numero di voci di centro non cambia tra le prove di luce On e Off (Tempo al centro Off116.73±2,65 s, On1 16.02±1.89 s, Off2 12.02±1.76 s, On2 13.04±2.58 s; Distanza Off1 3399.69±296,77 cm, On1 3210.6±446,9 cm, Off2 3030.28±513,83 cm, On2 2955±617,7 cm; Numero di voci del centro Off1 14.2±1.98, On1 13.6±2.02, Off2 10.8±1.88, On2 11.67±2.5). I topi TC mostrano un’ansia di base significativamente più elevata (Off1 EXP:CT, MWRS, p.0.005, . I valori sono ±S.E.M. – indicano differenze significative (p≤0,05), indicano differenze significative (p≤0.01). test t sempre a due code, MWRS: Mann-Whitney Rank Sum test; IL: corteccia infralimobica; BLA: amigdala basolaterale; DRN: nuclei di raphe dorsali; OF: Campo aperto; CT: animali di controllo; EXP: animale sperimentale; L: luce. Questa cifra è stata modificata da Berg et al. 2019, PLoS One43 e da Berg 201948. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5: Esperimento EPM non è riuscito a mostrare gli effetti comportamentali nei topi Nex-Cre. Stimolazione della luce durante gli esperimenti: 473 nm, 1 mW, 20 Hz stimolazione. A) Labirinto Elevated-Plus con protocollo di stimolazione della luce (18 min, 6×3 min, alternando off e On prove). B) I dati di gruppo per i topi che “scivolano” sono inclusi nei dati, totale n. 23. I topi Nex-Cre avevano la tendenza a scivolare via dal braccio aperto con le zampe della schiena, indipendentemente dal gruppo sperimentale (a sinistra). Solo i topi che sono rimasti nel labirinto per tutte e 6 le prove sono stati considerati nelle analisi successive. Slip off nella prima fase Off1 sono motivo per evitare successivamente le braccia aperte (Off1 EXP 1.63±0.6, CT 2.2±0.79, Off2, 3 EXP 0.125±0.125, CT 0±0, On1,2,3 EXP 0.625±0.26, CT 0.1±0.1). Il grafico a torta (a destra) mostra i topi che cadono dal labirinto durante il 18 min con il 42,42%. Solo il 57,57% ha terminato l’esperimento. C) Mappe termiche di topi esemplari EXP e CT in tutte e 6 le prove dell’esperimento. Entrambi i gruppi mostrano una diminuzione della durata del braccio aperto dopo la prova Off1. D) Dati di gruppo per gli animali EXP nell’EPM, n.12. Il tempo trascorso a braccia aperte è diminuito in modo significativo durante le prime due prove e costantemente in seguito (Off1 73±12,22 s, On1 36.15±14.65 s, Off2 15.61±6.23 s, On2 19.49±7.51 s, Off3 9.36±4.44 s, On3 7.96±3.47 s. Off1:On1, t-test, p’0,041, .). La distanza spostata non è interessata (Off1 679.96±71,63 cm, On1 712.24±112,82 cm, Off2 717.49±97,39 cm, On2 782.51±81,11 cm, Off3 722.11±68,60 cm, On3 663.90±106,57 cm). La quantità di movimenti di braccio aperto diminuisce in modo significativo da Off1 a On1 e quindi rimane costante (Off1 8.08±1.08, Su 1 3.33±0.76, Off2 2.16±0.69, On2 2.91±1.09, Off3 1.73±0.75, On3 1.73±0.66. Off1:On1, t-test, p-0.002, . Il tempo trascorso al centro dell’EPM diminuisce lungo le prove, ma non mostra alcuna differenza significativa da Off a On trial (Off1 41.71±5.34 s, Su 1 31.2±4.59 s, Off2 19.8±3.44 s, On2 24.49±3.38 s, Off3 20.37±4.77 s, On3 18.85±4.07 s). E) Dati di gruppo per gli animali TC nell’EPM, n.11. I dati CT mostrano le stesse diminuzioni significative dei dati EXP, indicando che l’esperimento non ha funzionato correttamente (Tempo a braccia aperte Off1 86.92±12,74 s, On1 33.78±14.38 s, Off2 18.01±11.61 s, On2 16.41±9.61 s, Off3 11.36±4.01 s, On3 5.43±2.07 s. Off1:On1, MWRS, p Distanza Off1 705.11±88,36 cm, On1 789.45±77,53 cm, Off2 724.74±80.49 cm, On2 676.57±111,99 cm, Off3 716.99±132,47 cm, On3 663.03±132,46 cm; Aprire le voci di braccio Off1 7.09±1, On1 3.72±1.17, Off2 1.45±0.47, On2 1.36±0.58, Off3 0.91±0.43, Off3 1.64±0.59. Off1:On1, MWRS, p-0.01, Tempo trascorso nel centro Off1 35.89 s, Su 1 29.25±3.96 s, Off2 22.17±3.58 s, On2 15.9±2.57 s, Off3 13.86±4.2 s, On3 16.89±5.75 s). I valori sono ± S.E.M. – indicano differenze significative (p≤0,05), indicano differenze significative (p≤0,01). t-test è sempre a due code, MWRS: Mann-Whitney Rank Sum test; EPM: Labirinto Elevato-Plus; CT: animali di controllo; EXP: animale sperimentale; OA: braccia aperte. Questa cifra è stata modificata da Berg et al. 2019, PLoS One43 e da Berg 201948. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 6: Lato di iniezione di ChR2 e tdTomato nella specificità IL e Nex-Cre. A) Disegno schematico del sito di impianto su fette cerebrali coronali a AP : 1,66 mm, mL 0,3 mm, DV -1,8 mm, con iniezione unilaterale e impianto (adattato dall’atlante cerebrale del topo, Paxinos e Franklin, Bregma 1,54 mm). B) Siti di iniezione esemplari di ChR2-YFP (sinistra, giallo) e tdTomato (destra, rosso) fusi con i nuclei delle cellule macchiate DAPI (blu) nei topi Nex-Cre. Barra di scala 1 mm. Gli inset mostrano un elevato ingrandimento dell’area IL. Barra della scala 150 m. Le caselle bianche indicano la posizione degliinset. C) Riga superiore: immagini confocali della regione IL sinistra di un topo Nex-Cre macchiato con CamKII come marcatore per i neuroni glutamatorgici (blu) e ChR2-YFP (giallo) o Gad67 come marcatore per i neuroni GABAergic (verde), di un topo Nex-Cre. Riga inferiore: colocalizzazione di ChR2-YFP (giallo) con CamKII (sinistra, blu), ma non con Gad67 (destra, verde), che mostra specificità dei topi Nex-Cre per i neuroni glutamatogici. Barra di scala 50 m. PrL: corteccia prelimbica; IL: corteccia infralimobica; DP: corteccia peduncolare dorsale. Questa cifra è stata modificata da Berg et al. 2019, PLoS One43 e da Berg 201948. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

L’uso della luce per manipolare la segnalazione neuronale è stato il metodo di scelta per quasi un decennio. Dal 2005, il numero di articoli pubblicati sullo sviluppo di nuovi strumenti optogenetici⁴^,⁶^,⁸^,¹⁴^,⁴⁹^,⁵⁰^,⁵¹ e studi in cui tali strumenti sono utilizzati per indagare circuiti cerebrali²¹^,²³^,⁴⁰^,⁴³^,⁵², altamente aumentato. Da un lato, con l’enorme diversità di strumenti optogenetici iniettabili, varianti di impianto, linee di topi transgenici ed esperimenti comportamentali, la possibilità di esperimenti è molteplici e illimitata. D’altra parte, la possibilità di fare difetti nella scelta delle condizioni sperimentali è molto alta e gli esperimenti sono così specifici, che spesso la comparabilità ad altri studi è difficile.

Passaggi critici
Un importante passo critico di questo protocollo è la corretta pianificazione. La scelta dello strumento optogenetico dovrebbe corrispondere alla questione scientifica. È solo necessario manipolare l’attività complessiva di un neurone o di una sinapsi? Poi strumenti forniti commercialmente come ChR2²¹^,²⁵^,²⁷ e Arch³⁷ sono una buona scelta. Ma a parte questo, se un sistema speciale di neurotrasmettitore o anche un singolo recettore dovrebbe essere manipolato, un singolo recettore chimera è spesso la scelta migliore³^,⁶. Diverse chimere recettoriali con GPCR, i cosiddetti Opto-XR, e le linee guida per produrle sono già^{disponibili 4}^,⁵⁰. Oltre alla scelta degli strumenti optogenetici, anche la linea del mouse in combinazione con l’esperimento comportamentale è fondamentale. Diversi ceppi di fondo, come ad esempio C57Bl/6 e BALB/cByJ, visualizzano diversi fenotipi comportamentali per^{alcuni aspetti 53}^,⁵⁴. I topi C57Bl/6 hanno una bassa ansia di base e possono essere utilizzati per la manipolazione anssiogenica, mentre BALB/cByJ mostrano livelli di ansia più elevati e sono quindi più sensibili ai farmaci ansiotici. Inoltre, le varianti transgeniche di questi ceppi di fondo possono anche variare nel loro fenotipo⁴⁸. Con una corretta combinazione di promotori specifici in combinazione con uno strumento optogenetico e una linea di topo transgenica, quasi ogni popolazione di cellule desiderata può essere mirata.

Un passaggio critico durante l’intervento chirurgico è la destinazione della posizione corretta. Con l’aiuto dell’atlante del cervello del topo, è possibile stabilire le coordinate corrette per l’asse anteriore-posteriore e l’asse mediale-laterale e la profondità^{della struttura 45}. In realtà, ogni teschio ha una forma e dimensioni leggermente diverse. Così, il fattore F^{46 per} regolare le coordinate stereotattiche è abbastanza importante, così come la corretta fissazione del naso e dell’orecchio durante la chirurgia stereotassica. Se la testa del mouse è inclinata, la canula di iniezione non riuscirà a colpire la regione di interesse desiderata.

Inoltre, il diametro della canula di iniezione è anche critico. Se è troppo piccolo, nessun virus può essere rilasciato nel tessuto, se è troppo largo, la canula perderà soluzione di virus sulla sua strada verso la regione di interesse. Se la fibra ottica impiantata termina direttamente sopra la regione di destinazione, l’espressione del virus nelle regioni della corteccia di cui sopra non ha importanza. Ma se l’impianto è posizionato sopra altre regioni per stimolare i terminali assoni, gli assoni delle regioni della corteccia superiore saranno attivati anche dalla luce e falsificano i dati ottenuti. Ad esempio: la regione IL e la regione prelimbice (PrL) proiettano entrambi l’amigdala basale⁵⁵^,⁵⁶ ma hanno funzioni e ruoli completamente diversi nella modulazione^{dell’ansia 26}^,⁵⁷. Se l’impianto è posizionato sopra l’amigdala per attivare i terminali assoni dalla regione IL, e durante la soluzione di virus di iniezione è stato anche inserito nella PrL a causa della canula di iniezione sbagliata, il rischio di attivare anche terminali assoni dalla PrL è molto alto.

Durante la preparazione del cranio per la fissazione dell’impianto, l’uso scarso di primer e legame è fondamentale per una fissazione affidabile e durevole. Se il sistema di adesione a 2 componenti non viene applicato sottilmente, il cemento dentale potrebbe staccarsi dal cranio dopo un paio di giorni o settimane. Inoltre, il cranio deve anche essere completamente asciugato prima di fissare l’impianto, altrimenti il cemento non si attacca correttamente al cranio.

Nella parte comportamentale di questo protocollo sono inoltre disponibili passaggi critici. In primo luogo, la costruzione del labirinto è molto importante. In ogni impostazione comportamentale, esistono diverse varianti nella letteratura per quanto riguarda le dimensioni e la forma, così come per la procedura stessa⁵⁸^,⁵⁹^,⁶⁰. È importante scegliere una variante che renda i dati comparabili e riproducibili. Inoltre, devono essere presi in considerazione i requisiti speciali per le linee del mouse utilizzate⁴³^,⁴⁸. Nei dati rappresentativi dell’EPM si può vedere che diversi topi Nex-Cre sono caduti dal labirinto o sono scivolati più volte (Figura 2b). Per questi topi, un labirinto con una piccola parete intorno alle braccia aperte sarebbe stata un’alternativa migliore.

In secondo luogo, è fondamentale mantenere costanti tutte le condizioni della^{stanza esterna 61}, altrimenti diversi gruppi di topi non sarebbero affatto comparabili. A questo proposito, è molto importante scegliere il tempo dell’esperimento come uno in cui l’installazione sperimentale è vacante e lo sperimentatore è sempre presente. Inoltre, gli eventi nell’edificio, come i lavori di costruzione, le prove di qualsiasi sistema (allarme antincendio) o il giorno di pulizia dell’impianto del topo, devono essere considerati al fine di evitare interferenze con i dati ottenuti.

Infine, le condizioni di movimentazione e alloggio sono fondamentali per gli esperimenti comportamentali. Quando viene eseguito un impianto, i topi devono essere alloggiati in modo singolo a causa del rischio di lesioni da altri topi. Per garantire una buona comparabilità tra i gruppi e un errore basso all’interno di un gruppo, ogni mouse deve avere le stesse dimensioni e arricchimento della gabbia. Per gli esperimenti legati all’ansia, singolo alloggiamento ha alcuni vantaggi come singe ospitato topi maschi mostrano un livello di ansia di base inferiore, meno variazione nel loro livello di ansia, e sintomi meno depressivi-come¹⁵^,¹⁶. I topi maschi alloggiati nel gruppo potrebbero differire fortemente nel loro livello di ansia a causa della gerarchia tra i topi. Oltre all’alloggiamento, è importante anche una gestione costante ed equa di tutti i topi e gruppi. Afferrare il mouse per collegare la fibra luminosa sull’impianto è molto stressante. Pertanto, questa procedura deve essere la stessa per ogni mouse, il che significa la stessa tecnica e lo stesso sperimentatore. Inoltre, il tempo di assuola nella gabbia di attesa, che ha lo scopo di calmare il mouse dalla procedura di collegamento stressante, deve anche avere condizioni uguali in durata, lettiera e posizione al labirinto. La gestione all’interno della struttura del mouse è fondamentale anche per prestazioni comportamentali successive. Gli animali sperimentali e di controllo non devono essere puliti in giorni diversi o da persone diverse, in quanto questo è anche stressante per i topi. Inoltre, il giorno di pulizia non dovrebbe essere il giorno sperimentale per evitare differenze di comportamento.

Risoluzione dei problemi relativi
Ci sono diversi problemi che potrebbero verificarsi durante il protocollo. Ad esempio, la perforazione di un intero nel cranio durante la chirurgia stereotassica potrebbe danneggiare i vasi sanguigni. Di solito, si verifica un forte sanguinamento, soprattutto sopra bregma e lambda. Se questo accade, non cercare di fermare l’emorragia con bastoncini di cotone in quanto tendono ad estendere ancora più sanguinamento fuori dal vaso a causa della loro assorbimento, invece, risciacquare direttamente con NaCl.

Può anche accadere che l’iniezione di pressione della soluzione di virus non funzioni. In questo caso, potrebbe essere che il parafilm, una crosta dal foro della bava o tessuto cerebrale, sta intasando la punta della canula. In questo caso, rimuovere la canula lentamente dal cervello senza cambiare l’asse x o y e utilizzare un tweezer per rimuovere 1-2 mm della parte anteriore della punta di canula. Prima di abbassare di nuovo la canula, testare la funzionalità applicando una piccola quantità di pressione per vedere se il virus esce dalla punta di canula. Per evitare la stitichezza, abbassare la canula con una velocità costante e non interrompere il movimento fino a raggiungere la profondità più profonda del lato di iniezione. Se troppo della punta di canula viene rimosso e il diametro è troppo grande, la canula danneggerà il tessuto e il rischio di applicare il virus tutto in una volta sarà aumentato. Quindi, assicurarsi che solo la parte intasata della punta venga accuratamente rimossa.

Durante l’esperimento comportamentale, la configurazione dell’esperimento nel software di tracciamento video (ad esempio, Ethovision XT) potrebbe causare problemi. Se, ad esempio, l’uscita della luce non funziona correttamente, ciò può essere dovuto a diversi motivi. Il Pulser deve essere aperto, programmato e avviato prima dell’apertura di Ethovision XT. L’hardware deve essere selezionato correttamente nella “Configurazione sperimentale” (passaggio 3.2.2.4). Se è selezionata la I/O-Box errata o qualcosa di diverso da “Costume Hardware”, il dispositivo Pulser non può essere controllato da Ethovision. Se il test dell’uscita luminosa ha esito positivo, ma il protocollo di luce programmato in “Impostazioni di controllo di prova” non funziona durante l’acquisizione, il riferimento della regola secondaria o della sotto-regola potrebbe essere posizionato in modo non corretto o le condizioni e le azioni non sono chiare. Ad esempio: il riferimento appartiene alla sottorete corretta? Il riferimento è programmato correttamente (ad esempio, con quale frequenza viene eseguita la sottorete)?

Inoltre, potrebbe accadere che durante le “impostazioni di rilevamento” l’animale sia adeguatamente monitorato, ma durante l’acquisizione ci sono campioni in cui il soggetto non viene trovato. In questo caso, verificare se l’illuminazione nella stanza sperimentale è stata modificata, o se qualcosa ha prodotto ombre indesiderate all’interno del labirinto. L’intero fondo del labirinto deve avere lo stesso colore, poiché l’impostazione funzionerà solo per una combinazione specifica. Se per qualsiasi motivo non è possibile evitare diversi colori o ombre inferiori, definire l’impostazione di rilevamento nella parte più scura del labirinto.

Per modificare le impostazioni dopo l’acquisizione dei primi animali, non applicare queste modifiche nelle impostazioni già utilizzate. Duplicarli per regolarli. Ciò significa anche che la versione di prova già registrata non è più valida per l’analisi dei dati. In tal caso, registrare tutti gli animali per questo gruppo sperimentale con le impostazioni originali, e creare un nuovo esperimento in seguito in cui i video registrati vengono analizzati invece di live tracking. In questo esperimento “da video”, diverse impostazioni possono essere utilizzate per l’analisi senza perdere la comparabilità tra gli animali o anche i dati.

Limitazioni e applicazioni future
Questo metodo di manipolazione del comportamento con l’optogenetica negli animali in movimento libero include anche limitazioni. Durante l’intervento chirurgico, la vicinanza dei due impianti è limitata. Per il doppio impianto, la distanza tra i due impianti deve essere minimamente la larghezza dell’apparecchio per contenere l’impianto. L’apparecchio deve abbassare il secondo impianto nel foro della bava, mentre i primi impianti sono già fissi. Una soluzione per questo potrebbe essere un impianto angolato, dove le punte della fibra di vetro possono essere molto vicine mentre i ferule ceramici sopra il cranio hanno una distanza^{maggiore 23}^,⁵⁵^,⁵⁶^,⁵⁷^,⁶²^,⁶³. Uno svantaggio di un impianto angolato è la diffusione della luce. Quando la punta della fibra è inclinata invece che dall’alto, l’area stimolata è diversa. Nel caso di due regioni bersaglio nelle immediate vicinanze, è necessario considerare la posizione modificata della stimolazione della luce.

Durante l’esperimento comportamentale, la costruzione del labirinto potrebbe interferire con il cavo ottico collegato all’animale. Alcuni test comportamentali, come la casella chiaro-scuro, contengono un’area interna⁶⁴^,⁶⁵e altri labirinti contengono scomparti che il mouse deve entrare. Tali esperimenti non possono essere eseguiti con questa configurazione. In alternativa, un sistema wireless potrebbe essere^{un’opzione 22}^,²⁶^,⁶⁶. Ma per fortuna alcuni labirinti, come il Labirinto barnes, possono essere disposti in modo tale, che i topi sono in grado di entrare nei relativi scomparti⁶⁷.

Oltre a quelli con zone chiuse, labirinti troppo larghi possono causare anche problemi. Più grande è l’area del labirinto, più lungo deve essere il cavo per consentire all’animale di andare in ogni posizione nel labirinto. Si deve fare attenzione che l’animale non sia in grado di intervenire sul cavo o afferrarlo e morderlo. Una soluzione potrebbe essere una costruzione che arrotono il cavo ridondante. Uno svantaggio è che la resistenza per srotolare il cavo è difficile per i topi. Questa soluzione sarebbe più adatto per i ratti. Un’altra opzione possibile potrebbe essere fare la stimolazione della luce in anticipo, invece che durante l’esperimento, naturalmente questo è fattibile solo se si verifica un effetto a lungo termine dovuto alla stimolazione^{della luce 23}.

Confronto con i metodi esistenti/alternativi
Metodi alternativi sarebbero stimolazione chimica o elettrica durante il^{comportamento 8}^,¹⁸. Agonisti chimici o antagonisti sono in grado di attivare o silenziare i neuroni tramite recettori specifici e possono anche manipolare singoli sistemi di neurotrasmettitore³⁸^,⁶⁸. Da un lato, la specificità del recettore è abbastanza alta per le sostanze chimiche, perché agonista specifico o antagonista attivano solo alcuni recettori³⁹. D’altra parte, la specificità per i sottotipi recettori dello stesso gruppo di neurotrasmettitori è spesso insufficiente. La maggior parte delle sostanze chimiche si legano ad almeno due sottotipi con probabilità^{diverse 69}. Inoltre, le sostanze chimiche non possono distinguere tra i tipi di cellule neuronali, purché possiedano gli stessi tipi di recettori. Al di là di questo, la risoluzione temporale e spaziale è scarsa per le manipolazioni chimiche rispetto all’optogenetica. Agonisti o antagonisti sono spesso somministrati per via orale³⁵ o tramite iniezioni sistemiche⁵⁷^,⁷⁰. Se l’infusione della sostanza chimica è fatta direttamente nel tessuto cerebrale, gli effetti appare più velocemente rispetto alle applicazioni orali, ma ancora su una scala temporale più lenta rispetto alla stimolazione della luce. Come le sostanze chimiche somministrate si diffondono nel cervello e non sono specifiche per i tipi neuronali o regioni del cervello, manipolazione di circuiti cerebrali specifici non è possibile.

La stimolazione elettrica ha una risoluzione temporale più elevata rispetto alla stimolazione^{chimica 9}^,¹⁴. La diffusione all’interno del tessuto neuronale è inferiore a quella della stimolazione chimica e la risoluzione spaziale è migliore rispetto alla stimolazione chimica. Tuttavia, la stimolazione elettrica manca la possibilità di affrontare specificamente diversi tipi di cellule neuronali o tipi di recettori, poiché ogni neurone in prossimità dell’elettrodo risponderà alla stimolazione elettrica.

Metodi alternativi al comportamento nei topi in movimento libero sono ad esempio registrazioni elettrofisiologiche in fette cerebrali, dove singoli neuroni o assoni possono essere modulati con optogenetica ed effetti suscitati possono essere misurati tramite la registrazione di elettrodi⁶^,⁷¹. Gli esperimenti in vitro offrono la possibilità di studiare la base molecolare e cellulare delle stimolazioni optogenetiche, ma hanno la limitazione che manca la connettività intrinseca e l’input da altre regioni del cervello. Un’altra opzione consiste nell’utilizzare optogenetica in combinazione con l’imaging^{multifoto 1}^,⁷². In questo caso, i topi hanno la testa fissa e possono essere anetitizzati o essere svegli per risolvere compiti semplici.

Per eseguire un esperimento optogenetico di successo, una vasta gamma di strumenti e applicazioni sono disponibili al giorno d’oggi. La selezione di strumenti optogenetici e l’impostazione comportamentale sono fondamentali per rispondere a domande di ricerca specifiche. Se viene scelta la giusta combinazione di strumenti ed esperimenti, l’optogenetica consente un’indagine senza precedenti e approfondita dei circuiti neuronali con alta risoluzione temporale e spaziale. Ciò contribuirà a comprendere e sviluppare nuove strategie terapeutiche per le malattie psichiatriche e la cognizione.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Grande grazie alla prof.ssa Klaus-Armin Narve e alla dott.ssa Sandra Goebbels (Max-Plank-Institute of Experimental Medicine, Goettingen, Germania) per aver gentilmente fornito topi Nex-Cre. Inoltre, ringraziamo il nostro team video Yunus Dikici e Ruben Wiesner per la registrazione e l’elaborazione del video JoVE per questo articolo. Inoltre, grazie a Kristin Claussen per la sua voce fuori campo e Kimberly Anne Go per la correzione delle bozze del manoscritto.

I risultati presentati sono stati ottenuti presso la Ruhr-University di Bochum e il video è stato registrato presso l’Università di Brema.

Questo lavoro è stato finanziato dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) – Projektnummer 122679504 – SFB 874 e DFG MA 4692/3-2.

Materials

Ketamin	Sigma-Aldrich	K2753-64	Anestasia
20 % Glucose	AlleMan Pharma		Injection s.c. for fast recovery
Behavioral mazes	Costum made		Measure anxiety
Bepanthen	Bayer		Ophthalmic oinment
Betaisodona	Monodipharma		Sterilant containing iodine
Betaisodona	Monodipharma		Iodine oinment
Binocular	Olympus	SZ52, 110AL0.62x WD160	Surgery
Ceramic ferrules	Thorlabs	CFLC230-10	Implant
Ceramic Fiber Scribe	Thorlabs	CSW12.5	Cutting of the glass fiber
Channelrhodopsin2-YFP virus	Penn Vector Core	Addgene 20298	Optogenetic tool
Compressed air	Kontakt Chemie	Druckluft 67	Drying of the skull
Coordinate system	Stoelting		Stereotactic coordinates for the surgery
Correl Draw			Graphical software version 13
Cryoslicer	MICROM	HM500OM	Production of brain slices for staining
Ethovision XT 14	Noldus		Software for behavioral tracking
Exel			Statistical Software
Ferrule Polishing Puck	Thorlabs	D50-F	Polishing implants round side
Fiber Patch Cord dual	Prizmatix	Optogenetics-Fiber 500, 1,20 m, Ferrule core 1,25 mm	Cables, which are connected with the two implants of a bilateral implantation
Fiber Patch Cord single	Prizmatix	Optogenetics-Fiber 500, 1,20 m, Ferrule core 1,25 mm	Cable, which is connected with the implant via a sleeve
Fiber Stripping Tool	Thorlabs	T06S13	Stripping glass fiber for implant
Filter paper	VWR European	516-0300	Cut into pieces for the Novelty-Suppressed Feeding test
Food pellets	Mühle Levers	Höveler Nagerfutter	Nutrition for the mice
Glass pipettes	Harvard Apparatus	GC150-10	Injection pipettes
Gradia direct-Flo	Henry Schein	103322	Fluid dental cementum
Heating lamp	efbe-Schott/Phillips	R95E	Prevent the mice from cooling after the surgery
Heating plate	Stoelting		Integrated into coordinate system
Injection canula	Braun	100 Sterican, 0,4 x 20 mm, Gr. 20	All injections and to bore hole into the skull
Litter		T 1350	Grounding for the Novelty-Supressed Feeding test
Mouse cages	Zoonlab	405 cm^2	Single housing for experiments
Optibond FL	Kerr	26684E	Preparation of the skull for implantation
Optical glass fiber	Thorlabs	FT200EMT	Light fiber for implant
Optogenetics-LED.STSI	Prizmatix		Optogenetic toolbox for light stimulation during behavioral experiments
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	16005-1KG-R	Perfusion of mice to remove the brains
Polishing sheet 0.02 µm grit	Thorlabs	LFCF	Polishing implants round side
Polishing sheet 1 µm grit	Thorlabs	LF1D	Polishing implants round side
Polishing sheet 30 µm grit	Thorlabs	LF30D	Polishing implants round side
Polishing sheet 6 µm grit	Thorlabs	LF6D	Polishing implants round side
Pulser Software	Prizmatix		Software for light device control
Rimadyl-Carprofen	Zoetis		Analgesia
Sigma Plot			Software for statistics
Sleeve	Thorlabs	FT200EMT	Connection of implant and light cable
SodiumCloride (NaCl)	Braun	3570410	Rinsing of the skull
Superglue	Pattex Henkel		To Fix the glass fiber in the ferrule
td-Tomato virus	Penn Vector Core	Addgene 51503	Optogenetic tool
UV light	KoQGHJ	wireless, 1200 mW/cm^2	Polymeration lamp for dental cementum
Xylavet-Xylazin	cp pharma		Anesthesia

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Berg, L., Gerdey, J., Masseck, O. A. Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity to Modulate Behavior in Freely Moving Mice. J. Vis. Exp. (164), e61023, doi:10.3791/61023 (2020).

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