Optogenetic التلاعب بالنشاط العصبي لتعديل السلوك في الفئران تتحرك بحرية
Summary
مع التلاعب optogenetic من مجموعات عصبية محددة أو مناطق الدماغ، يمكن تعديل السلوك مع ارتفاع دقة الزمان والمكانية في الحيوانات تتحرك بحرية. باستخدام أدوات optogenetic مختلفة في تركيبة مع الألياف البصرية المزروعة بشكل مزمن، يمكن تنفيذ مجموعة متنوعة من التشكيلات العصبية والاختبار السلوكي.
Abstract
يؤثر التعديل Optogenetic من الدوائر العصبية في الفئران تتحرك بحرية على السلوك الحاد والطويل الأجل. هذه الطريقة قادرة على أداء التلاعب من الخلايا العصبية واحدة والإفراج عن منطقة محددة الارسال، وتصل إلى الدوائر الخلايا العصبية بأكملها في الجهاز العصبي المركزي، ويسمح القياس المباشر للنتائج السلوكية. تُعبّر الخلايا العصبية عن أدوات optogenetic عن طريق حقن النواقل الفيروسية التي تحمل الحمض النووي المفضل، مثل Channelrhodopsin2 (ChR2). يتم إحضار الضوء إلى مناطق محددة في الدماغ عن طريق الغرسات البصرية المزمنة التي تنتهي مباشرة فوق المنطقة المستهدفة. بعد أسبوعين من الانتعاش والتعبير عن الأداة المناسبة ، يمكن استخدام الفئران بشكل متكرر للاختبارات السلوكية مع التحفيز البصري للخلايا العصبية ذات الاهتمام.
يحتوي التعديل Optogenetic على دقة زمنية ومكانية عالية يمكن إنجازها مع خصوصية الخلايا العالية ، مقارنة بالطرق الشائعة الاستخدام مثل التحفيز الكيميائي أو الكهربائي. الضوء لا يضر الأنسجة العصبية، وبالتالي يمكن استخدامها للتجارب على المدى الطويل، وكذلك للتجارب السلوكية متعددة في فأرة واحدة. إمكانيات أدوات optogenetic غير محدودة تقريبا وتمكين تفعيل أو إسكات الخلايا العصبية كاملة، أو حتى التلاعب من نوع مستقبلات محددة عن طريق الضوء.
نتائج هذه التجارب السلوكية مع التحفيز الاوبوجينتيك المتكاملة تصور مباشرة التغيرات في السلوك الناجم عن التلاعب. سلوك الحيوان نفسه دون تحفيز الضوء كخط أساس هو تحكم جيد للتغيرات المستحثة. وهذا يسمح لمحة مفصلة عن أنواع الخلايا العصبية أو أنظمة العصبية المشاركة في سلوكيات محددة, مثل القلق. يمكن أيضا أن يتم التحقيق في اللدونة من الشبكات العصبية بتفصيل كبير من خلال التحفيز على المدى الطويل أو الملاحظات السلوكية بعد التحفيز البصري. سوف تساعد Optogenetics على تنوير إشارات الخلايا العصبية في عدة أنواع من الأمراض العصبية.
Introduction
إن تعديل الدوائر العصبية في الجهاز العصبي المركزي ونتائجها السلوكية مهم لفهم كيفية عمل الدماغ، خاصة في الأمراض النفسية والمهام المعرفية مثل التعلم والذاكرة. مع optogenetics، يمكن تعديل الخلايا المفردة أو مجموعات الخلايا تصل إلى الدوائر بأكملها عن طريق الضوء. أدوات البصرية الشائعة مثل Channelrhodopsin2 (ChR2) أو Archaerhodopsin (القوس) قادرة على تنشيط أو إسكات الخلايا العصبية، أو زيادة أو تثبيط إطلاق الارسال في محطات محور عصبي إسقاط لمناطق الدماغ متميزة1،2،3،4. ومع ذلك، القوس يحتاج إلى أن تستخدم بعناية كما تبين أن تفعيلها في المحطات presynaptic يزيد من الإفراج عن مرسلعفوية 5. Arch هو مضخة بروتون تصحيحية خارجية تغير قيمة pH داخل الخلية. هذا الوسط القلوي يدفع تدفق الكالسيوم ويعزز الارسال الافراج5. لتعديل مسارات الإشارات داخل الخلايا على وجه التحديد ، يمكن إنشاء chimeras مستقبلات تتألف من أداة optogenetic قابلة للتفعيل الخفيفة ، مثل rhodopsin أو opsin المخروط ، بالتزامن مع مستقبلات G-protein مقرونة كافية ،6،7،8. وقد زاد مقدار وتنوع الأدوات البصرية المتاحة بشكل كبير خلال العقد الماضي9.
الغرض من علم البصريات هو التعامل مع الدوائر العصبية أثناء السلوك. تمكن Optogenetics ، على سبيل المثال ، قياس التغيرات السلوكية الحادة مثل التغيرات في سلوك القلق. يتم تسليم الأدوات البصرية في المناطق المستهدفة من الدماغ عن طريق ناقلات الفيروسية. مع مساعدة من المروجين الخاصة والمقويات، أو نظام كريس لوإكسب، يمكن ضمان نوع الخلية المحددة للتعبير عن أدوات optogenetic (الشكل 1A). هناك عدة خطوط الماوس المعدلة وراثيا التي تعبر عن انزيم Cre-Recombinase في أنواع خلايا محددة فقط. على سبيل المثال، Nex-Cre الفئران التعبير عن Cre-Recombinase في الخلايا العصبية الهرمية في القشرة والحصن تحت سيطرة Nex-promotor10. هذا الإنزيم هو قادر على عكس تسلسل الحمض النووي، والتي تحيط بها الجانبين loxP11. وبالتالي، فإن تسلسل الحمض النووي لأداة optogenetic المزدوجة، التي هي مقلوبة وتحيط بها الجانبين loxP، لا يمكن إلا أن تكون منقولة من قبل الخلايا العصبية التي تمتلك Cre-Recombinase، ولكن ليس من قبل أنواع الخلايا العصبية الأخرى12،13. في حالة الفئران Nex-Cre، سيتم التعبير عن الأداة البصرية فقط في الخلايا العصبية الهرمية. ثم يتم تحقيق التحفيز الضوئي لمناطق معينة في الدماغ عن طريق زرع مزمن للألياف البصرية مباشرة فوق المنطقة ذات الاهتمام. يمكن بعد ذلك أن تقترن الحيوانات بمصدر ضوء مناسب وتتصرف بحرية في جميع أنواع الاختبارات السلوكية تقريبًا.
الشكل 1: الحقن والزرع. أ) نظام Cre-loxP لـ ChR2-YFP. يتم حزم أداة optogenetic floxed مزدوج في فيروس أدينو المرتبطة (AAV) للحقن في أنسجة الدماغ. ب) عرض القوس لحقن الفيروس وزرع واجهة الخلايا العصبية البصرية داخل / فوق المنطقة IL من mPFC. تم الحقن والزرع من فوق. وتظهر جميع المناطق ذات الاهتمام، IL، وD BLA و DRN. ج) عرض مفصل للألياف البصرية المزروعة، والأكمام ومصدر الضوء. د) انتشار تحفيز الضوء الليزري الأزرق والأحمر في أنسجة المخ المادة الرمادية من 200 ميكرومتر من الألياف الضوئية (Yizhar وآخرون 2011). ينتشر الضوء الأزرق ، في الحد الأقصى ، 0.5 ملم في الأنسجة ، الضوء الأحمر حوالي 1 ملم. لون الترميز: أحمر 50٪، أصفر 10٪، أخضر 5٪، أزرق 1٪ إذا كان الضوء يصل إلى هذه المنطقة. E) منظر إكورال للزرع الأحادي مباشرة فوق IL الأيسر مع 200 ميكرومتر من الألياف الضوئية. منطقة IL لديها عرض 0.25 ملم في كل نصف وعمق 0.2 ملم. مصابيح زرقاء وحمراء هي المصابيح من 5٪ انتشار الضوء ويتم نقلها من Yizhar وآخرون إلى الحجم الصحيح. LoxP: موضع X-over P1؛ ChR2: Channelrhodopsin; YFP: البروتين الفلورسنت الأصفر؛ dflox: floxed مزدوجة; IL: القشرة اللافراعية; BLA: اللوزة البصينية; DRN: ناوية الظهرية رابي؛ PrL: منطقة prelimbic. تم تعديل هذا الرقم من Berg 201948. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
وتستخدم النُهج البصرية لأنها تتيح الدقة الزمنية والمكانية العالية14 ونوع الخلية المحددة. بالإضافة إلى ذلك، من الممكن استخدام الجهاز المزروع بشكل متكرر دون مزيد من العلاج. بعد جراحة مجسمة، حيث يتم تنفيذ حقن فيروس مرتبط بـ adeno يحمل الأداة البصرية وزراعة الألياف البصرية، يمكن للفئران التعافي لمدة أسبوعين. لقد اخترنا وقت الانتعاش من 2 أسابيع فقط، لأن هذا هو الوقت الكافي للتعافي من الجراحة وللفيروس للتعبير عن. كما يتبع التجارب السلوكية من قبل الكيمياء المناعية, علينا أن نضمن أن الفئران لا تحصل على القديم جدا خلال التجربة; وإلا فإن نوعية الأنسجة تنخفض. أنها تظهر أي عاهات سلوكية واضحة من زرع والانخراط في السلوك قفص نموذجي. بالطبع ، يرافق الزرع آفة جراحية كبيرة . لذلك، يتم رصد الفئران بشكل مكثف. بعد الجراحة ، الفئران تحتاج إلى أن تكون واحدة في مكان ، كما الفئران مجموعة يضم تميل إلى إصابة الجروح الطازجة بعضها البعض ويزرع. ومع ذلك ، فإن ظروف السكن لها تأثير كبير على مستوى القلق من الفئران الذكور ، حيث تظهر الفئران ذات المأوى الفردي مستويات قلق أقل15 وبشكل عام أعراض أقل اكتئابًاتشبه 16.
التلاعب الكيميائي أو الكهربائي من دوائر الدماغ تفتقر إلى نوع الخلية عالية خصوصية optogenetics ولها أقل دقة الزمان والمكانية14,17,18. اعتمادا على السؤال التجريبي، يمكن أن يكون التحفيز الكهربائي أو الكيميائي مزايا مختلفة. عند مرور محطات الألياف في منطقة معينة تحتاج أيضا إلى تحفيز، التحفيز الكهربائي هو أفضل طريقة. التحفيز الكيميائي هو خيار جيد عندما مستقبلات محددة الارسال في منطقة بأكملها ينبغي تفعيلها من قبل ناهضات. ميزة أخرى كبيرة من optogenetics بالمقارنة مع التحفيز الكيميائي أو الكهربائي هو أن الذاتية، والخلايا العصبية ليست حساسة للضوء، والذي يتجنب حدوث الآثار الجانبية19. في الواقع، قد يؤدي شدة الضوء العالي تأثيرات التدفئة8،20، ولكن بسبب مجموعات التحكم المناسبة ، يمكن القضاء على الآثار السلوكية بسبب التلاعب optogenetic.
التحقيق في سلوك القوارض، وخاصة فيما يتعلق بالأمراض النفسية، قد تحسنت كثيرا مع optogenetics في الحيوانات تتحرك بحرية، كما أنه يتيح التشكيل توجيه مستقبلات واحدة تصل إلى مجموعات الخلاياالمحددة 21 والدوائر22. إمكانية لقياس الآثار الحادة لمثل هذه التشكيلات، فضلا عن الآثار السلوكية على المدى الطويل بعد وقت محدد23 أو بعد التحفيز المزمن24،تمكن مرونة واسعة من التصاميم التجريبية ويوفر رؤى مفصلة جدا في دوائر الدماغ. يمكن استخدام تحفيز الضوء لتعديل الخلايا العصبية الموجودة في موقع الحقن من أداة optogenetic. عندما كل من الحقن والزرع عنوان نفس منطقة الدماغ, أجسام الخلايا والخلف إسقاط محاور عصبية من المبدأ و interneurons في هذه المنطقة يمكن أن تستهدف3,,6,,8. ومع ذلك، يمكن أيضا أن الألياف الخفيفة تزرع في منطقة مختلفة عن حقن واحد. في هذه الحالة، يمكن أن التحفيز الضوء تعدل إطلاق الارسال في محطات محور عصبي في مناطق الإسقاط من المنطقة المحقونة25،26،27.
في الدراسة هنا، يتم استخدام علم الوراثة البصرية في تركيبة مع التجارب لتحليل السلوك المرتبط بالقلق. الأمراض النفسية المرتبطة بالقلق تؤثر على أكثر من ثلث سكان العالم28,29,30 وتسبب عبئا اقتصاديا كبيرا31. المصابون يعانون من الشعور بالإثارة والتوتر والقلق متبوعاً بسلوك التجنب32,33. هذه المشاعر السلبية التي تحدث بشكل مزمن ، والتي تركز بشكل رئيسي على الأحداث المستقبلية34، تتداخل بقوة مع الحياة اليومية للمرضى. العلاجات الشائعة مثل البنزوديازيبينات أو مثبطات امتصاص السيروتونين الانتقائية (SSRIs) ناجحة فقط في بعض المرضى. وهناك كمية كبيرة من الناس لا تستجيب للعلاج في جميع35, تبين أن الآلية الكامنة في هذه الأمراض ليست مفهومة تماما حتى الآن. ومن المعروف أن القشرة قبل الجبهية الوسيطة (mPFC) تلعب دورا هاما في تطوير ومظهر القلق21,25,27,36,37,38. على وجه التحديد، قد يكون التّحَدُّم المفرط لمنطقة القشرة الـ(IL) في منطقة الـ mPFC جزءًا من الاضطرابات المرتبطة بالقلق39،40. يمكن أن تساعد التجربة المذكورة هنا في فهم كيفية تأثير التعديلات في منطقة IL في mPFC على سلوك القلق. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضاً دعم وضع استراتيجيات علاجية جديدة للأمراض النفسية المرتبطة بالقلق.
2-6 الشهر الذكور الفئران Nex-Cre القديمة تستخدم للتعبير عن ChR2 على وجه التحديد في الخلايا العصبية الهرمية داخل المنطقة IL من mPFC41. Nex-Cre الفئران لديها خلفية C57Bl/6 والتعبير عن إنزيم Cre-recombinase على وجه التحديد في الخلايا العصبية الهرمية. أثناء جراحة مجسمة، يتم حقن الحمض النووي ChR2-DNA المزدوج المخفق في منطقة IL عبر النواقل الفيروسية المرتبطة adeno. يتم وضع الزرع البصري مباشرة فوق المنطقة ذات الاهتمام(الشكل 1B)ويتم إصلاح الزرع مع أسمنت الأسنان. الحيوانات السيطرة تلقي حقنة من tdTomato-DNA floxed مزدوجة في نفس المنطقة لتقليد التعبير خلية محددة.
الحيوانات هي مجموعة يسكنها حتى يوم الجراحة وبعد ذلك هي واحدة يسكن لتجنب الإصابات من الفئران الأخرى. يتم إيواء الفئران في رفوف فردية في قفص تهوية (IVC) في أقفاص TypI-L للفئران المفردة. وتتبع دورة الضوء الداكن إيقاع 12:12 ساعة، وتبدأ مرحلة الضوء من الساعة 10 صباحًا. يتم تنفيذ جميع التجارب السلوكية في المرحلة المظلمة ، والتي تشبه المرحلة النشطة من القوارض. تتوفر حبيبات الماء والطعام القياسي إعلان libitum. بعد أسبوعين من الانتعاش، والذي يضمن تعبير كاف من ChR2 في الخلايا العصبية الهرمية، وتستخدم الفئران للتجارب السلوكية.
الحقل المفتوح (OF) هو متاهة 50 سم × 50 سم مربعة مع الجدران الرملية 40 سم. وتنقسم الأرض في 16 مربعات حيث الداخلية 4 تمثل المركز. السلوك المقاس هو: 1) الوقت الذي يقضيه في المركز، 2) عدد مداخل المركز، و 3) نقل المسافة الإجمالية. خلال هذه التجربة، هناك 4 تجارب مجموعها 20 دقيقة. في التجارب 1 و 3، لا يحدث أي تحفيز الضوء، وفي التجارب 2 و 4، يتم تنفيذ التحفيز 20 هرتز مع نبض ضوء 5 مللي ثانية وكثافة ضوء 1 مللي واط من 473 نانومتر (الشكل 2A). في التجارب اللاحقة ، تم أخذ التعود على منطقة الاختبار في الاعتبار ، ولكن استخدام التحكم المحقونة تشير إلى كيفية التعبير عن التعود.
متاهة بارنز هي تجربة للتعلم والذاكرة. وهو منصة دائرية يبلغ قطرها 92 سم وتحتوي على 20 حفرة متساوية البعد حول محيط المحيط. يتم إغلاق 19 من الثقوب وتحت حفرة واحدة يتم تقديم مربع الهروب. لمدة 4 أيام متتالية، والفئران لديها 4 تجارب التدريب لمعرفة موقع مربع الهروب. في يوم5، تتم إزالة مربع الهروب، ويتم اختبار الفئران على مقدار الوقت الذي يحتاجونه للعثور على الحفرة الصحيحة. السلوك المقاس هو: 1) الوقت حتى يتم العثور على مربع الهروب / ثقب الصحيح، 2) عدد الزيارات والأخطاء الهدف، و 3) المسافة انتقلت حتى في مربع الهروب. يتم تحفيز الضوء في مجموعات مختلفة إما أثناء الاستحواذ أو الدمج ، والتي تجري في أيام التدريب 1-4 ، أو أثناء الاسترجاع في يوم الاختبار ، وهو اليوم 5 (الشكل 2D).
الشكل 2: التجارب السلوكية مع بروتوكولات optogenetic. أ)الرسم التخطيطي لتجربة الحقل المفتوح مع بروتوكول تحفيز الضوء المقابل. C)الرسم التخطيطي لتجربة المتاهة المرتفعة مع بروتوكول تحفيز الضوء المقابل. D)الرسم التخطيطي للتجربة بارنز المتاهة مع بروتوكول التحفيز الضوئي المقابلة. EPM: متاهة مرتفعة زائد; من: حقل مفتوح; BM: بارنز متاهة اختبار. تم تعديل هذا الرقم من Berg 201948. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
للتحفيز optogenetic، شدة الضوء والتردد يجب أن تتكيف مع أداة optogenetic ونوع الخلايا العصبية التي هي قيد التحقيق. يجب استخدام أدنى كثافة ضوء ممكن من أجل تجنب تلف الأنسجة ، حيث أظهرت العديد من الدراسات أن هناك تأثيرات محتملة للتدفئة بسبب شدة الضوء القوي8،20. لChr2، 20 هرتز التحفيز مع نبض ضوء 5 مللي ثانية يستخدم عادة2. كما ChR2 هو خفيف جدا حساسة، 1 كيلوواط شدة الضوء كافية. يتناوب بروتوكول تحفيز الضوء بين الضوء والتجارب لقياس التغيرات السلوكية بشكل مباشر. يجب أن تظل ظروف الغرفة الخارجية للتجارب السلوكية مستقرة لمجموعة الحيوانات بأكملها. الشروط الهامة للنظر هي الضوضاء (نضع في اعتبارنا أن الأجهزة نفسها قد تجعل الضوضاء)، رائحة (دائما تنظيف الاجهزة السلوكية مع الإيثانول)، وكثافة الضوء، والمجرب. يجب أن يكون المجرب هو الشخص نفسه. بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن يكون الوقت من يوم التجارب هو نفسه لجميع الحيوانات في مجموعة واحدة ، بعد ساعات قليلة من بدء المرحلة المظلمة في المرفق المفضل.
والهدف من هذه التجربة هو زيادة نسبة الإثارة/التثبيط (E/I) في منطقة IL من خلال التنشيط القوي للخلايا العصبية الهرمية الإثارة. ومن المعروف أن نسبة E/ I المعززة في هذه المنطقة القشرة الخاصة لزيادة مستويات القلق في الفئران40،42،43،44.
Protocol
Representative Results
Discussion
استخدام الضوء للتلاعب إشارات الخلايا العصبية كان الأسلوب المفضل لما يقرب من عقد واحد الآن. منذ عام 2005، عدد المقالات المنشورة حول تطوير أدوات optogenetic جديدة4،,6،,8،,14،,49،,50،,51 والدراسات حيث تستخدم هذه الأدوات للتحقيق في دوائر الدماغ21،23،40،43،52، زيادة عالية. فمن ناحية، مع التنوع الهائل للأدوات البصرية القابلة للحقن، ومتغيرات الزرع، وخطوط الماوس المعدلة وراثيا، والتجارب السلوكية، فإن إمكانية إجراء التجارب متعددة وغير محدودة. من ناحية أخرى ، فإن إمكانية حدوث أخطاء في اختيار الظروف التجريبية عالية جدًا والتجارب محددة جدًا ، لدرجة أن إمكانية المقارنة مع الدراسات الأخرى غالبًا ما تكون صعبة.
خطوات هامة
إحدى الخطوات الهامة الهامة لهذا البروتوكول هي التخطيط السليم. اختيار أداة optogenetic ينبغي أن تتطابق مع المسألة العلمية. هل من الضروري فقط التلاعب بالنشاط العام للخلايا العصبية أو المشبك؟ ثم الأدوات المقدمة تجاريا مثل ChR221،25،27 و37 آرتش هي خيار جيد. ولكن بصرف النظر عن ذلك، إذا كان ينبغي التلاعب واحد نظام الناقل العصبي الخاص أو حتى مستقبل واحد، وchimra مستقبلات الفردية وغالبا ما يكون الخيار الأفضل3،6. العديد من الألحان مستقبلات مع GPCRs، ما يسمى Opto-XRs، والمبادئ التوجيهية لإنتاجها متاحة بالفعل4،50. بخلاف اختيار أدوات optogenetic ، خط الماوس في تركيبة مع التجربة السلوكية هو أيضا أمر بالغ الأهمية. سلالات خلفية مختلفة، مثل على سبيل المثال C57Bl/6 و BALB/cByJ، وعرض الأنماط الظاهرية السلوكية المختلفة في بعض النواحي53،54. C57Bl/6 الفئران لديها قلق خط الأساس منخفضة ويمكن استخدامها للتلاعب المزيل للمهينات، في حين أن BALB/cByJ تظهر مستويات أعلى من القلق وبالتالي فهي أكثر حساسية للأدوية المزيلة للقلق. بالإضافة إلى ذلك، قد تختلف المتغيرات المعدلة وراثيا من هذه السلالات الخلفية أيضا في النمط الظاهري48. مع مزيج مناسب من المروجين محددة جنبا إلى جنب مع أداة optogenetic وخط الماوس المعدلة وراثيا، تقريبا كل السكان الخلايا المطلوبة يمكن أن تستهدف.
هناك خطوة حاسمة أثناء الجراحة هي استهداف الموقع الصحيح. مع مساعدة من أطلس الدماغ الماوس، يمكن إنشاء إحداثيات مناسبة للمحور الأمامي الأمامي، والمحور الجانبي الوسيط، وعمق الهيكل45. في الواقع، كل جمجمة لها شكل وحجم مختلف قليلا. وهكذا، فإن عاملF-46 لضبط إحداثيات stereotactic مهم جدا، كما هو الصحيح الأنف والأذن التثبيت أثناء جراحة مجسمة. إذا كان رأس الماوس مائلة، فإن حقن canula تفشل في استهداف المنطقة المطلوبة من الفائدة.
بالإضافة إلى ذلك، قطر كانولا الحقن هو أيضا أمر بالغ الأهمية. إذا كان صغيرا جدا، لا يمكن إطلاق أي فيروس في الأنسجة، إذا كان واسع جدا، فإن ال canula تسرب حل الفيروس في طريقها إلى المنطقة ذات الاهتمام. إذا الألياف البصرية المزروعة ينتهي مباشرة فوق المنطقة المستهدفة، والتعبير عن الفيروس في المناطق القشرة أعلاه لا يهم. ولكن إذا تم وضع الغرسة فوق المناطق الأخرى لتحفيز محطات المحاور، سيتم تنشيط محاور عصبية مناطق القشرة العليا أيضًا عن طريق الضوء وتزوير البيانات التي تم الحصول عليها. على سبيل المثال: المنطقة IL ومنطقة prelimbic (PrL) على حد سواء المشروع إلى ال amygdala القاعدية55,56 ولكن لديها وظائف وأدوار مختلفة تماما في تعديل القلق26,57. إذا تم وضع الزرع فوق اللوزة لتنشيط محطات أكسون من منطقة IL، وخلال حقن الفيروس تم وضع حل أيضا في برل بسبب حقن القنبل خطأ، وخطر أيضا تفعيل محطات محور عصبي من برل مرتفع جدا.
أثناء إعداد الجمجمة لتثبيت الزرع ، فإن الاستخدام المتفرق للعميات والسندات أمر بالغ الأهمية لتثبيت موثوق ودائم. إذا لم يتم تطبيق نظام التصاق مكونين، فقد ينفصل أسمنت الأسنان عن الجمجمة بعد بضعة أيام أو أسابيع. بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن تجفف الجمجمة تمامًا قبل تحديد الزرع ، وإلا لن يعلق الأسمنت بشكل صحيح على الجمجمة.
توجد أيضاً خطوات هامة في الجزء السلوكي من هذا البروتوكول. أولاً، إن بناء المتاهة مهم جداً. في كل الإعداد السلوكي، توجد عدة أنواع في الأدب فيما يتعلق بالحجم والشكل، وكذلك للإجراء نفسه58،59،60. من المهم اختيار متغير يجعل البيانات قابلة للمقارنة وقابلة للتكرار. أيضا ، ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار الاحتياجات الخاصة لخطوط الماوس المستخدمة43،48. في البيانات التمثيلية لEPM يمكن أن ينظر إلى أن العديد من الفئران Nex-Cre سقطت من المتاهة أو انزلقت عدة مرات(الشكل 2b). بالنسبة لهذه الفئران، كانت متاهة ذات جدار صغير حول الذراعين المفتوحة ستكون بديلاً أفضل.
ثانيا، من المهم للحفاظ على جميع ظروف الغرفة الخارجية ثابتة61،وإلا مجموعات مختلفة من الفئران لن تكون قابلة للمقارنة على الإطلاق. في هذا الصدد ، من المهم جدا اختيار وقت التجربة باعتبارها واحدة حيث الإعداد التجريبي شاغرة والمجرب هو دائما. وعلاوة على ذلك، ينبغي النظر في الأحداث في المبنى، مثل أعمال البناء، أو اختبار أي أنظمة (إنذار الحريق) أو يوم تنظيف مرفق الماوس، وذلك لتجنب التداخل مع البيانات التي تم الحصول عليها.
وأخيراً، فإن ظروف التعامل والسكن أمران حاسمان بالنسبة للتجارب السلوكية. عند إجراء عملية زرع، يجب أن تكون الفئران وحيدة بسبب خطر الإصابة من الفئران الأخرى. لضمان قابلية جيدة للمقارنة بين المجموعات وخطأ منخفض داخل مجموعة واحدة، كل فأرة تحتاج إلى أن يكون لها نفس حجم القفص والإثراء. للتجارب المتعلقة بالقلق، السكن واحد لديه بعض المزايا كما singe الفئران الذكور يضم تظهر مستوى القلق خط الأساس أقل، وأقل تباين في مستوى القلق، وأقل أعراض الاكتئاب مثل15،16. مجموعة يضم الفئران الذكور قد تختلف بشدة في مستوى القلق بسبب التسلسل الهرمي بين الفئران. إلى جانب السكن ، والتعامل المستمر والمتساوي لجميع الفئران والمجموعات مهم أيضا. الاستيلاء على الماوس من أجل ربط الألياف الخفيفة على الزرع هو مرهقة للغاية. لذلك، يجب أن يكون هذا الإجراء نفسه لكل ماوس، بمعنى نفس الأسلوب ونفس المجرب. وعلاوة على ذلك، فإن الوقت المعتاد في قفص الانتظار، الذي يهدف إلى تهدئة الماوس من إجراء الاتصال المجهدة، يحتاج أيضا إلى ظروف متساوية في المدة والقمامة والموقف إلى المتاهة. معالجة داخل مرفق الماوس أيضاً أمر بالغ الأهمية للأداء السلوكي في وقت لاحق. لا ينبغي تنظيف الحيوانات التجريبية والتحكم فيها في أيام مختلفة أو من قبل أشخاص مختلفين ، لأن هذا أيضًا مرهق للفئران. بالإضافة إلى ذلك، لا ينبغي أن يكون يوم التنظيف يوم تجريبي لتجنب الاختلافات في السلوك.
استكشاف الاخطاء
هناك العديد من المشاكل التي قد تحدث أثناء البروتوكول. على سبيل المثال، يمكن أن يؤدي حفر كامل في الجمجمة أثناء الجراحة المجسمة إلى تلف الأوعية الدموية. عادة، يحدث نزيف قوي، وخاصة فوق البريغما و لامدا. إذا حدث هذا، لا تحاول وقف النزيف مع العصي القطن لأنها تميل إلى تمديد نزيف أكثر من وعاء بسبب امتصاصها، بدلا من ذلك، شطف مباشرة مع NaCl.
ويمكن أن يحدث أيضا أن حقن الضغط من حل الفيروس لا يعمل. في هذه الحالة، يمكن أن يكون أن البارا فيلم، وهو جرب من ثقب بور أو أنسجة الدماغ، انسداد غيض من المظلة. في هذه الحالة، قم بإزالة الـ canula ببطء من الدماغ دون تغيير محور س أو ص واستخدم ملاقط لإزالة 1-2 مم من الجزء الأمامي من طرف الـ canula. قبل خفض الـ canula مرة أخرى، اختبر الوظيفة عن طريق تطبيق كمية صغيرة من الضغط لمعرفة ما إذا كان الفيروس يخرج من طرف الـ canula. لتجنب الإمساك، قم بخفض الـ canula بسرعة ثابتة ولا تتوقف عن الحركة حتى يتم الوصول إلى أعمق عمق من جانب الحقن. إذا تم إزالة الكثير من طرف الـ canula وكان القطر كبيرًا جدًا ، فإن الـ canula سيتلف الأنسجة وسيزداد خطر تطبيق الفيروس في وقت واحد. وبالتالي، تأكد من أن يتم إزالة الجزء المسدود فقط من طرف بعناية.
أثناء التجربة السلوكية، قد يسبب إعداد التجربة في برنامج تتبع الفيديو (على سبيل المثال، Ethovision XT) مشاكل. إذا كان الناتج الضوئي لا يعمل بشكل صحيح، على سبيل المثال، يمكن أن يرجع ذلك إلى عدة أسباب. يجب فتح برنامج Pulser وبرمجته وبدء تشغيله قبل فتح Ethovision XT. يجب تحديد الجهاز بشكل صحيح في “الإعداد التجريبي” (الخطوة 3.2.2.4). إذا تم تحديد الخطأ IO-Box، أو أي شيء آخر غير “أجهزة الأزياء”، لا يمكن التحكم في جهاز Pulser بواسطة Ethovision. إذا كان اختبار إخراج الضوء ناجحاً، ولكن بروتوكول الضوء المبرمج في “إعدادات التحكم التجريبية” لا يعمل أثناء عملية الاكتساب، قد تكون القاعدة الفرعية أو مرجع القاعدة الفرعية موجود بشكل غير صحيح أو الشروط والإجراءات غير واضحة. على سبيل المثال: هل المرجع ينتمي إلى القاعدة الفرعية الصحيحة؟ هل تمت برمجة المرجع بشكل صحيح (مثلاً، كم مرة يتم تنفيذ القاعدة الفرعية)؟
بالإضافة إلى ذلك، قد يحدث أنه أثناء “إعدادات الكشف” يتم تتبع الحيوان بشكل كاف، ولكن أثناء الاستحواذ هناك عينات حيث لم يتم العثور على الموضوع. في هذه الحالة ، تحقق مما إذا كانت الإضاءة في الغرفة التجريبية قد تغيرت ، أو إذا كان أي شيء ينتج ظلالًا غير مرغوب فيها داخل المتاهة. الجزء السفلي بأكمله من المتاهة يجب أن يكون نفس اللون، كما الإعداد سوف تعمل فقط لمزيج واحد محدد. إذا كان لأي سبب من الأسباب ألوان أسفل مختلفة أو الظلال لا يمكن تجنبها، وتحديد الإعداد الكشف في الجزء أحلك من المتاهة.
لتغيير أية إعدادات بعد الحصول على الحيوانات الأولى، لا تقم بتطبيق هذه التغييرات في الإعدادات المستخدمة بالفعل. قم بتكرارها لضبطها. وهذا يعني أيضا أن التجربة المسجلة بالفعل غير صالحة بعد الآن لتحليل البيانات. في مثل هذه الحالة، تسجيل جميع الحيوانات لهذه المجموعة التجريبية مع الإعدادات الأصلية، وخلق تجربة جديدة بعد ذلك حيث يتم تحليل أشرطة الفيديو المسجلة بدلا من التتبع الحي. في هذه التجربة “من الفيديو”، يمكن استخدام العديد من الإعدادات للتحليل دون فقدان إمكانية المقارنة بين الحيوانات أو حتى البيانات.
القيود والتطبيقات المستقبلية
هذه الطريقة من التلاعب السلوك مع optogenetics في الحيوانات تتحرك بحرية ويشمل أيضا القيود. خلال الجراحة ، يتم تقييد القرب من الغرستين. لزرع مزدوج، يجب أن تكون المسافة بين يزرع اثنين الحد الأدنى من عرض الجهاز لعقد زرع. يحتاج الجهاز إلى خفض الزرع الثاني في حفرة البور ، في حين أن الغرسات الأولى ثابتة بالفعل. قد يكون الحل لهذا زرع الزاوية ، حيث يمكن أن تكون نصائح من الألياف الزجاجية قريبة جدا في حين أن خيوط السيراميك فوق الجمجمة لها مسافة أكبر23،55،56،57،62،63. عيب زرع الزاوية هو انتشار الضوء. عندما يتم مائلة تلميح الألياف بدلا من من مباشرة أعلاه، والناحية حفز مختلفة. في حالة وجود منطقتين مستهدفتين على مقربة، يجب النظر في تغيير موضع تحفيز الضوء.
خلال التجربة السلوكية، قد تتداخل عملية بناء المتاهة مع الكابل البصري المتصل بالحيوان. بعض الاختبارات السلوكية، مثل مربع فاتح الظلام، تحتوي على منطقة داخلية64و65، وغيرها من متاهات تحتوي على المقصورات التي يحتاج الماوس إلى الدخول. لا يمكن إجراء مثل هذه التجارب مع هذا الإعداد. بدلا من ذلك ، قد يكون نظام لاسلكي خيار22،26،66. ولكن لحسن الحظ بعض متاهات، مثل متاهة بارنز، يمكن ترتيب في مثل هذه الطريقة، أن الفئران قادرة على دخول المقصورات ذات الصلة67.
بالإضافة إلى تلك التي مع المناطق المغلقة، يمكن أن متاهات واسعة جداً يسبب مشاكل أيضا. كلما كانت مساحة المتاهة أكبر، كلما كان الكابل أطول للسماح للحيوان بالذهاب إلى كل موقع في المتاهة. يجب الحرص على أن الحيوان غير قادر على خطوة على الكابل أو الاستيلاء عليه وعضه. قد يكون الحل لذلك هو البناء الذي يلف الكابل الزائد. وهناك عيب هو أن السحب إلى إلغاء كابل من الصعب على الفئران. هذا الحل يناسب الجرذان بشكل أفضل. ويمكن أن يكون خيار آخر ممكن للقيام التحفيز الضوء مقدما، بدلا من خلال التجربة، وبطبيعة الحال هذا هو ممكن فقط إذا كان تأثير طويل الأجل بسبب تحفيز الضوء يحدث23.
مقارنة بالأساليب القائمة/البديلة
وسوف تكون الأساليب البديلة الكيميائية أو الكهربائية التحفيز خلال السلوك8,18. ناهضات الكيميائية أو الخصوم قادرون على تنشيط أو إسكات الخلايا العصبية عبر مستقبلات محددة ويمكن أيضا التلاعب نظم الناقل العصبي واحد38,68. من ناحية، وخصوصية مستقبلات عالية جدا للمواد الكيميائية، لأن ناهض معين أو خصم تنشيط فقط مستقبلات معينة39. من ناحية أخرى، فإن خصوصية الأنواع الفرعية مستقبلات من نفس المجموعة العصبية غالباً ما تكون غير كافية. معظم المواد الكيميائية ربط ما لا يقل عن نوعين فرعيين مع احتمالات مختلفة69. بالإضافة إلى ذلك، لا يمكن للمواد الكيميائية التمييز بين أنواع الخلايا العصبية طالما أنها تمتلك نفس أنواع المستقبلات. وعلاوة على ذلك، فإن الدقة الزمانية والمكانية ضعيفة بالنسبة للتلاعبات الكيميائية بالمقارنة مع علم الوراثة البصرية. غالبا ما تدار ناهضين أو الخصوم شفويا35 أو عن طريق الحقن الجهازية57,70. إذا تم ضخ المادة الكيميائية مباشرة في أنسجة الدماغ، تظهر التأثيرات أسرع من التطبيقات الفموية، ولكن لا يزال على مقياس زمني أبطأ من مع تحفيز الضوء. كما تنتشر المواد الكيميائية تدار في الدماغ وليست محددة لأنواع الخلايا العصبية أو مناطق الدماغ, التلاعب في دوائر الدماغ محددة أنه من غير الممكن.
التحفيز الكهربائي له دقة زمنية أعلى من التحفيز الكيميائي9،14. انتشار داخل في الأنسجة العصبية أقل من مع التحفيز الكيميائي والوضوح المكاني هو أفضل من مع التحفيز الكيميائي. ومع ذلك، التحفيز الكهربائي يفتقر إلى إمكانية معالجة أنواع الخلايا العصبية المختلفة أو أنواع مستقبلات على وجه التحديد، كما كل الخلايا العصبية في القرب من القطب سوف تستجيب للتحفيز الكهربائي.
طرق بديلة للسلوك في بحرية تتحرك الفئران هي على سبيل المثال التسجيلات الكهربائية الفيزيولوجية في شرائح الدماغ، حيث يمكن تعديل الخلايا العصبية أو المحاور واحد مع علم الوراثة البصرية والآثار التي أثارها يمكن قياسها عن طريق تسجيلالأقطاب الكهربائية 6،71. التجارب في المختبر توفر إمكانية التحقيق في الأساس الجزيئي والخلوي للتحفيزات البصرية ولكن لديها قيود على أن الاتصال الجوهري والمدخلات من مناطق الدماغ الأخرى مفقودة. خيار آخر هو استخدام optogenetic بالتزامن مع التصوير متعدد الصور1،72. في هذه الحالة ، يكون رأس الفئران ثابتًا ويمكن تخديره أو أن يكون مستيقظًا لحل المهام البسيطة.
لإجراء تجربة optogenetic ناجحة، مجموعة واسعة من الأدوات والتطبيقات المتاحة في الوقت الحاضر. اختيار أدوات optogenetic و الضبط السلوكي أمر بالغ الأهمية للإجابة على أسئلة بحثية محددة. إذا تم اختيار المزيج الصحيح من الأدوات والتجارب ، فإن optogenetics يسمح بتحقيق غير مسبوق ومتعمق في الدوائر العصبية ذات الدقة الزمنية والمكانية العالية. وهذا سيساعد على فهم وتطوير استراتيجيات علاجية جديدة للأمراض النفسية والإدراك.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
شكر كبير للبروفيسور كلاوس-أرمين نارف والدكتورة ساندرا غوبلز (ماكس بلانك-معهد الطب التجريبي، جويتينغن، ألمانيا) لتقديم فئران Nex-Cre. كما نشكر فريق الفيديو يونس ديكيتشي وروبن فيزنر لتسجيل ومعالجة فيديو JoVE لهذه المقالة. بالإضافة إلى ذلك، شكر كبير لكريستين كلاوسن على صوتها كيمبرلي آن الذهاب لتنقيح الكتابة في المخطوطة.
وتم الحصول على النتائج المقدمة في جامعة الرور في بوخوم، وتم تسجيل الفيديو في جامعة بريمن.
تم تمويل هذا العمل من قبل دويتشه Forschungsgemeinschaft (DFG، مؤسسة البحوث الألمانية) – Projektnummer 122679504 – SFB 874 وDFG MA 4692/3-2.
Materials
| Ketamin | Sigma-Aldrich | K2753-64 | Anestasia |
| 20 % Glucose | AlleMan Pharma | Injection s.c. for fast recovery | |
| Behavioral mazes | Costum made | Measure anxiety | |
| Bepanthen | Bayer | Ophthalmic oinment | |
| Betaisodona | Monodipharma | Sterilant containing iodine | |
| Betaisodona | Monodipharma | Iodine oinment | |
| Binocular | Olympus | SZ52, 110AL0.62x WD160 | Surgery |
| Ceramic ferrules | Thorlabs | CFLC230-10 | Implant |
| Ceramic Fiber Scribe | Thorlabs | CSW12.5 | Cutting of the glass fiber |
| Channelrhodopsin2-YFP virus | Penn Vector Core | Addgene 20298 | Optogenetic tool |
| Compressed air | Kontakt Chemie | Druckluft 67 | Drying of the skull |
| Coordinate system | Stoelting | Stereotactic coordinates for the surgery | |
| Correl Draw | Graphical software version 13 | ||
| Cryoslicer | MICROM | HM500OM | Production of brain slices for staining |
| Ethovision XT 14 | Noldus | Software for behavioral tracking | |
| Exel | Statistical Software | ||
| Ferrule Polishing Puck | Thorlabs | D50-F | Polishing implants round side |
| Fiber Patch Cord dual | Prizmatix | Optogenetics-Fiber 500, 1,20 m, Ferrule core 1,25 mm | Cables, which are connected with the two implants of a bilateral implantation |
| Fiber Patch Cord single | Prizmatix | Optogenetics-Fiber 500, 1,20 m, Ferrule core 1,25 mm | Cable, which is connected with the implant via a sleeve |
| Fiber Stripping Tool | Thorlabs | T06S13 | Stripping glass fiber for implant |
| Filter paper | VWR European | 516-0300 | Cut into pieces for the Novelty-Suppressed Feeding test |
| Food pellets | Mühle Levers | Höveler Nagerfutter | Nutrition for the mice |
| Glass pipettes | Harvard Apparatus | GC150-10 | Injection pipettes |
| Gradia direct-Flo | Henry Schein | 103322 | Fluid dental cementum |
| Heating lamp | efbe-Schott/Phillips | R95E | Prevent the mice from cooling after the surgery |
| Heating plate | Stoelting | Integrated into coordinate system | |
| Injection canula | Braun | 100 Sterican, 0,4 x 20 mm, Gr. 20 | All injections and to bore hole into the skull |
| Litter | T 1350 | Grounding for the Novelty-Supressed Feeding test | |
| Mouse cages | Zoonlab | 405 cm^2 | Single housing for experiments |
| Optibond FL | Kerr | 26684E | Preparation of the skull for implantation |
| Optical glass fiber | Thorlabs | FT200EMT | Light fiber for implant |
| Optogenetics-LED.STSI | Prizmatix | Optogenetic toolbox for light stimulation during behavioral experiments | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 16005-1KG-R | Perfusion of mice to remove the brains |
| Polishing sheet 0.02 µm grit | Thorlabs | LFCF | Polishing implants round side |
| Polishing sheet 1 µm grit | Thorlabs | LF1D | Polishing implants round side |
| Polishing sheet 30 µm grit | Thorlabs | LF30D | Polishing implants round side |
| Polishing sheet 6 µm grit | Thorlabs | LF6D | Polishing implants round side |
| Pulser Software | Prizmatix | Software for light device control | |
| Rimadyl-Carprofen | Zoetis | Analgesia | |
| Sigma Plot | Software for statistics | ||
| Sleeve | Thorlabs | FT200EMT | Connection of implant and light cable |
| SodiumCloride (NaCl) | Braun | 3570410 | Rinsing of the skull |
| Superglue | Pattex Henkel | To Fix the glass fiber in the ferrule | |
| td-Tomato virus | Penn Vector Core | Addgene 51503 | Optogenetic tool |
| UV light | KoQGHJ | wireless, 1200 mW/cm^2 | Polymeration lamp for dental cementum |
| Xylavet-Xylazin | cp pharma | Anesthesia |
References
- Chow, B. Y., et al. High-performance genetically targetable optical neural silencing by light-driven proton pumps. Nature Letters. 463, 98-102 (2010).
- Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8, 745-752 (2011).
- Spoida, K., Masseck, O. A., Deneris, E. S., Herlitze, S. Gq/5-HT2c receptor signals activate a local GABAergic inhibitory feedback circuit to modulate serotonergic firing and anxiety in mice. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 111, 6479-6484 (2014).
- Kleinlogel, S. Optogenetic user’s guide to Opto-GPCRs modified GPCRs. Frontiers in Bioscience. 21, 794-805 (2016).
- Mahn, M., Prigge, M., Ron, S., Levy, R., Yizhar, O. Biophysical constraints of optogenetic inhibition at presynaptic terminals. Nature Neuroscience. 19, 554-556 (2016).
- Masseck, O. A., et al. Vertebrate Cone Opsins Enable Sustained and Highly Sensitive Rapid Control of Gi/o Signaling in Anxiety Circuitry. Neuron. 81, 1263-1273 (2014).
- Oh, E., Maejima, T., Liu, C., Deneris, E., Herlitze, S. Substitution of 5-HT 1A Receptor signaling by a light-activated G protein-coupled receptor. Journal of Biological Chemistry. 285, 30825-30836 (2010).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in Neural Systems. Neuron Primer. 71, 9-34 (2011).
- Masseck, O. A., Manahan-Vaughan, D. A Guide to Optogenetic Applications, With special Focus on Behavioral and In Vivo Electrophysiological Experiments. HandboOk of In Vivo Neural Plasticity Techniques – A Systems Neuroscheince Approach to the Neural Basis of Memory and Cognition. , 557 (2019).
- Goebbels, S., et al. Genetic Targeting of Principal Neurons in Neocortex and Hippocampus of NEX-Cre Mice. Genesis. , 611-621 (2006).
- Yang, Y. S., Hughes, T. E. Cre Stoplight: A red/green fluorescent reporter of Cre recombinase expression in living cells. Biotechniques. 31, 1036-1041 (2001).
- Schnütgen, F., et al. A directional strategy for monitoring Cre-mediated recombination at the cellular level in the mouse. Nature Biotechnology. 21, 562-565 (2003).
- Taniguchi, H., et al. A Resource of Cre Driver Lines for Genetic Targeting of GABAergic Neurons in Cerebral Cortex. Neuron. 71, 995-1013 (2011).
- Deisseroth, K. Optogenetics. Nature Methods. 8, 268-273 (2011).
- Palanza, P., Gioiosa, L., Parmigiani, S. Social stress in mice: Gender differences and effects of estrous cycle and social dominance. Physiology and Behavior. 73, 411-420 (2001).
- Karolewicz, B., Paul, I. A. Group housing of mice increases immobility and antidepressant sensitivity in the forced swim and tail suspension tests. European Journal of Pharmacology. 415, 197-201 (2001).
- Masseck, O. A., Rubelowski, J. M., Spoida, K., Herlitze, S. Light- and drug-activated G-protein-coupled receptors to control intracellular signalling. Experimental Physiology. 96, 51-56 (2011).
- Aravanis, A. M., et al. An optical neural interface: in vivo control of rodent motor cortex with integrated fiberoptic and optogenetic technology. Journal of Neural Engineering. 4, (2007).
- Zhang, F., et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature Article. 446, 633-639 (2007).
- Owen, S. F., Liu, M. H., Kreitzer, A. C. Thermal constraints on in vivo optogenetic manipulations. Nature Neuroscience. 22, 1061-1065 (2019).
- Hare, B. D., et al. Optogenetic stimulation of medial prefrontal cortex Drd1 neurons produces rapid and long-lasting antidepressant effects. Nature Communication. 10, 1-12 (2019).
- Allsop, S. A., Vander Weele, C. M., Wichmann, R., Tye, K. M. Optogenetic insights on the relationship between anxiety-related behaviors and social deficits. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, 1-14 (2014).
- Fuchikami, M., et al. Optogenetic stimulation of infralimbic PFC reproduces ketamine’s rapid and sustained antidepressant actions. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112, 8106-8111 (2015).
- Correia, P. A., et al. Transient inhibition and long-term facilitation of locomotion by phasic optogenetic activation of serotonin neurons. Elife. 6, 1-26 (2017).
- Felix-Ortiz, A. C., Burgos-Robles, A., Bhagat, N. D., Leppla, C. A., Tye, K. M. Bidirectional modulation of anxiety-related and social behaviors by amygdala projections to the medial prefrontal cortex. Neuroscience. 321, 197-209 (2016).
- Marek, R., Xu, L., Sullivan, R. K. P., Sah, P. Excitatory connections between the prelimbic and infralimbic medial prefrontal cortex show a role for the prelimbic cortex in fear extinction. Nature Brief Communication. , (2018).
- Parfitt, G. M., et al. Bidirectional Control of Anxiety-Related Behaviors in Mice: Role of Inputs Arising from the Ventral Hippocampus to the Lateral Septum and Medial Prefrontal Cortex. Neuropsychopharmacology. 42, 1715-1728 (2017).
- Bandelow, B., Michaelis, S. Epidemiology of anxiety disorders in the 21st century. Dialogues in Clinical Neuroscience. 17, 327-335 (2015).
- Kessler, R. C., et al. Lifetime Prevalence and Age-of-Onset Distributions of DSM-IV Disorders in the National Comorbidity Survey Replication. Archives of General Psychiatry. 62, 593-602 (2005).
- Kessler, R. C., Petukhova, M., Sampson, N. A., Zaslavsky, A. M., Wittchen, H. U. Twelve-month and lifetime prevalence and lifetime morbid risk of anxiety and mood disorders in the United States. International Journal of Methods Psychiatric Research. 21, 169-184 (2014).
- Andlin-Sobocki, P., Wittchen, H. U. Cost of anxiety disorders in Europe. European Journal of Neurology. 12, 39-44 (2005).
- Forster, G. L., Novick, A. M., Scholl, J. L., Wall, M. J. The Role of the Amygdala in Anxiety Disorders. Intech. , 61-102 (2012).
- Liberzon, I. Neural circuits in anxiety and stress disorders a focused review. Therapeutics and Clinical Risk Management. 11, 115-126 (2015).
- Sylvers, P., Lilienfeld, S. O., LaPrairie, J. L. Differences between trait fear and trait anxiety: Implications for psychopathology. Clinical Psychology Review. 31, 122-137 (2011).
- Daws, L. C., Koek, W., Mitchell, N. C. Revisiting Serotonin Reuptake Inhibitors and the Therapeutic Potential of ‘Uptake-2’ in Psychiatric Disorders. ACS Chemical Neuroscience. 4, 16-21 (2013).
- Felix-Ortiz, A. C., et al. BLA to vHPC inputs modulate anxiety-related behaviors. Neuron Report. 79, 658-664 (2013).
- Padilla-Coreano, N., et al. Direct Ventral Hippocampal-Prefrontal Input Is Required for Anxiety-Related Neural Activity and Behavior. Neuron Article. 89, 857-866 (2016).
- Lisboa, S. F., Stecchini, M. F., Corrêa, F. M. A., Guimarães, F. S., Resstel, L. B. M. Different role of the ventral medial prefrontal cortex on modulation of innate and associative learned fear. Neuroscience. 171, 760-768 (2010).
- Bi, L. L., et al. Enhanced excitability in the infralimbic cortex produces anxiety-like behaviors. Neuropharmacology. 72, 148-156 (2013).
- Yizhar, O., et al. Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction. Nature Article. 477, 171-178 (2011).
- Goebbels, S., et al. Genetic Targeting of Principal Neurons in Neocortex and Hippocampus of NEX-Cre Mice. Genesis. 44, 611-621 (2006).
- Rubenstein, J. L. R., Merzenich, M. M. Model of autism: increased ratio of excitation/ inhibition in key neural systems. Genes, Brain and Behavior. 2, 255-267 (2003).
- Berg, L., Eckardt, J., A, M. O. Enhanced activity of pyramidal neurons in the infralimbic cortex drives anxiety behavior. PLoS One. 14, 1-19 (2019).
- Meunier, C. N. J., Amar, M., Lanfumey, L., Hamon, M., Fossier, P. 5-HT1A receptors direct the orientation of plasticity in layer 5 pyramidal neurons of the mouse prefrontal cortex. Neuropharmacology. 71, 37-45 (2013).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J., Paxinos, G., Franklin, K. B. J., Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. 2, (2004).
- Gore, B. B., Soden, M. E., Zweifel, L. S. Manipulating gene expression in projection-specific neuronal populations using combinatorial viral approaches. Current Protocols in Neuroscience. 435, 1-6 (2014).
- Stujenske, J. M., Spellman, T., Gordon, J. A. Modeling the Spatiotemporal Dynamics of Light and Heat Propagation for InVivo Optogenetics. Cell Report. 12, 525-534 (2015).
- Berg, L. Imbalance of excitation and inhibition within the prefrontal cortex supports anxiety behavior. Ruhr-University Bochum. , (2019).
- Boyden, E. S. A history of optogenetics: The development of tools for controlling brain circuits with light. F1000 Biology Reports. 3, 1-12 (2011).
- Airan, R. D., Thompson, K. R., Fenno, L. E., Bernstein, H., Deisseroth, K. Temporally precise in vivo control of intracellular signalling. Nature. 458, 1025-1029 (2009).
- Sparta, D. R., et al. Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits. Nature Protocol. 7, 12-23 (2012).
- Covington, H. E., et al. Antidepressant Effect of Optogenetic Stimulation of the Medial Prefrontal Cortex. Journal of Neuroscience. 30, 16082-16090 (2010).
- Lepicard, E. M., Joubert, C., Hagneau, I., Perez-Diaz, F., Chapouthier, G. Differences in anxiety-related behavior and response to diazepam in BALB/cByJ and C57BL/6J strains of mice. Pharmacology, Biochemistry and Behavior. 67, 739-748 (2000).
- Schmidt, M. V., Müller, M. B. Animal models of anxiety. Elsevier. 3, 369-374 (2006).
- Cho, J. H., Deisseroth, K., Bolshakov, V. Y. Synaptic Encoding of Fear Extinction in mPFC-amygdala Circuits. Neuron Article. 80, 1491-1507 (2013).
- Adhikari, A., et al. Basomedial amygdala mediates top-down control of anxiety and fear. Nature. 527, 179-185 (2015).
- Suzuki, S., et al. The infralimbic and prelimbic medial prefrontal cortices have differential functions in the expression of anxiety-like behaviors in mice. Behavioural Brain Research. 304, 120-124 (2016).
- Carola, V., D’Olimpio, F., Brunamonti, E., Mangia, F., Renzi, P. Evaluation of the elevated plus-maze and open-field tests for the assessment of anxiety-related behaviour in inbred mice. Behavioural Brain Research. 134, 49-57 (2002).
- Prut, L., Belzung, C. The open field as a paradigm to measure the effects of drugs on anxiety-like behaviors: A review. European Journal of Pharmacology. 463, 3-33 (2003).
- Tye, K. M., et al. Amygdala circuitry mediating reversible and bidirectional control of anxiety. Nature Letter. 471, 358-362 (2011).
- Bouwknecht, J. A., et al. Differential effects of exposure to low-light or high-light open-field on anxiety-related behaviors: Relationship to c-Fos expression in serotonergic and non-serotonergic neurons in the dorsal raphe nucleus. Brain Research Bulletin. 72, 32-43 (2007).
- Overstreet, D. H., Knapp, D. J., Angel, R. A., Navarro, M., Breese, G. R. Reduction in repeated ethanol-withdrawal-induced anxiety-like behavior by site-selective injections of 5-HT1A and 5-HT2C ligands. Psychopharmacology. 187, 1-12 (2006).
- Takahashi, A., et al. Glutamate Input in the Dorsal Raphe Nucleus As a Determinant of Escalated Aggression in Male Mice. Journal of Neuroscience. 35, 6452-6463 (2015).
- Klemenhagen, K. C., Gordon, J. A., David, D. J., Hen, R., Gross, C. T. Increased Fear Response to Contextual Cues in Mice Lacking the 5-HT1A Receptor. Neuropsychopharmacology. 31, 101-111 (2006).
- Ramos, A. Animal models of anxiety: do I need multiple tests. Trends in Pharmacological Science. 29, 493-498 (2008).
- Isosaka, T., et al. Htr2a-Expressing Cells in the Central Amygdala Control the Hierarchy between Innate and Learned Fear. Cell. 163, 1153-1164 (2015).
- Regev, L., Goshen, I. Employing Optogenetics in Memory Research. Optogenetics: A Roadmap. , 219-256 (2017).
- Shah, A. A., Sjovold, T., Treit, D. Inactivation of the medial prefrontal cortex with the GABA A receptor agonist muscimol increases open-arm activity in the elevated plus-maze and attenuates shock-probe burying in rats. Brain Research. 1028, 112-115 (2004).
- Knight, A. R., et al. Pharmacological characterisation of the agonist radioligand binding site of 5-HT2A, 5-HT2B and 5-HT2C receptors. Naunyn-Schmiedebergs Archiv of Pharmacology. 370, 114-123 (2004).
- Graeff, F. G., Viana, M. B., Mora, P. O. Dual Role of 5-HT in Defense and Anxiety. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 21, 791-799 (1997).
- Cheriyan, J., Sheets, P. L. Altered Excitability and Local Connectivity of mPFC-PAG Neurons in a Mouse Model of Neuropathic Pain. Journal of Neuroscience. 38, 4829-4839 (2018).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
