שימוש במחולל תרסיס נימי בייצור רציף של תרסיס מבוקר למחקרים לא קליניים
Summary
הפרוטוקול מתאר את ההגדרות והשימוש במחולל תרסיס נימי לייצור רציף של אירוסול מבוקר מתמיסה נוזלית רב-מינית, המתאימה למתן תרסיסים יציבים בנפח גדול (למשל, מחקרי שאיפה in vivo ).
Abstract
מחולל האירוסולים הנימיים (CAG) מופעל עם העיקרון של אידוי נוזלי תרמי באמצעות חימום של נוזל אלקטרוני בשלב הראשוני, ואחריו נוקלאציה ועיבוי המווסתים באמצעות תערובת של זרימת אוויר ליצירת אירוסולים, כגון בסיגריה אלקטרונית (EC). ה- CAG שימושי במיוחד ביצירת אירוסולים בנפחים גדולים באופן רציף, עבור מקרים כגון מחקרי טוקסיקולוגיה של שאיפת in vivo , שבהם השימוש ב- ECs אינו אפשרי. ההשפעות התרמיות של הפקת תרסיס מה- CAG דומות מבחינת הטמפרטורה המיושמת ב- EC, ובכך מאפשרות לחוקרים להעריך את האדים של נוזלים אלקטרוניים בקנה מידה ובשכפול. מכיוון שפעולת ה- CAG מאפשרת למשתמשים לשלוט בפרמטרים קריטיים כגון קצב הזרימה של נוזל אלקטרוני, טמפרטורות חימום וזרימות אוויר מדוללות, היא מאפשרת לחוקרים לבדוק ניסוחים שונים של נוזל אלקטרוני בהתקן מבוקר היטב. תכונות, כגון גודל חלקיקי אירוסול, הוכחו כמווסתות עם קצב זרימת האוויר ביחס לזרימת הנוזל האלקטרוני ולהרכב הנוזל האלקטרוני. ה- CAG, לעומת זאת, מוגבל בהערכת בעיות נפוצות הקשורות ל- EC, כגון התחממות יתר של מרכיביו. אנו מבקשים להוכיח כי ה- CAG יכול ליצור אירוסול הניתן לשחזור ורציף, על ידי הערכת המאפיינים הכימיים והפיזיקליים של האירוסולים באמצעות נוסחה נבחרת של נוזל אלקטרוני. הפרוטוקול מתאר את הפרמטרים התפעוליים של קצב זרימת נוזלים, קצבי זרימת אוויר בדילול ונהלי הפעלה הדרושים כדי לייעל את ריכוז האירוסולים ואת גודל החלקיקים הנדרשים למחקר טוקסיקולוגיה in vivo . אנו מציגים את התוצאות הייצוגיות מהפרוטוקול ודנים באתגרים וביישומים של עבודה עם CAG, אנו מראים כי ניתן להשתמש ב- CAG באופן הניתן לשחזור. הטכנולוגיה והפרוטוקול, שפותחו מעבודות קודמות, משמשים בסיס לחידושים עתידיים לחקירות ייצור אירוסולים מבוקרי מעבדה.
Introduction
נוזלים אלקטרוניים נפוצים מכילים תערובת של פרופילן גליקול, גליצרול, מים, ניקוטין וטעמים נבחרים. הרכב של תרסיס שנוצר ממכשיר EC תלוי לא רק בניסוח הנוזל, אלא גם בחומר, בעיצוב ובמאפיינים של המכשיר. כתוצאה מכך, התקני EC רבים עשויים להציג שונות גדולה ביציאת תרסיס1, כולל ייצור ספציפי למכשיר של רמות גבוהות של מרכיבים לא רצויים, שינוי בנפח הנפיחות, שינוי בזרימת האוויר עקב חורי אוורור חסומים, ו”נפיחות יבשה” (כאשר מיכל הנוזל כמעט ריק, מה שגורם להתחממות יתר של המכשיר מכיוון שחלק מהאנרגיה המועברת אינה משמשת לאידוי נוזלי)2 . בנוסף, טעינה, מילוי מחדש וניקוי של מכשירי EC במהלך מחקרי שאיפה ארוכי טווח יהפכו לאילוץ נוסף עצום במונחים של לוגיסטיקה3. מסיבות אלה, יש לשקול מחוללי אירוסולים אחרים לייצור בקנה מידה גדול של אירוסולים ולהערכה נכונה של פורמולציות נוזליות תוך הימנעות משינויים הקשורים למכשיר בהרכב האירוסולים והפחתת עומס העבודה 4,5. עם זאת, אירוסולים המופקים על ידי מכשירים צריכים להישאר חלק מאסטרטגיות הערכת סיכונים, מכיוון שרמות המרכיבים המסוימים במכשירי EC עשויות להיות גבוהות יותר מאלו של מחוללי אירוסולים סטנדרטיים הנשלטים במעבדה בשל ספציפיות החימום/קירור של המכשירים 6,7,8.
בשל המידע המוגבל על הדרישות הרגולטוריות הקיימות כיום, שיטות הערכה לרעילות הפוטנציאלית של אירוסולים הנוצרים על ידי סיגריות אלקטרוניות (EC) עדיין מתפתחות 9,10,11. עם זאת, הערכה מדויקת של in vitro ו- in vivo דורשת יצירת נפחים מאופיינים היטב וניתנים לשחזור של אירוסול לאורך זמן. הפקת אירוסול ממכשיר EC עם משטר נפיחות מבוקר תהיה ללא ספק התהליך הייצוגי ביותר מנקודת המבט של צריכת המשתמשים. עבור מחקרי רעילות רגולטורית, בהתחשב במגוון פורמולציות נוזליות אפשריות שמשתמשים עשויים להכין לעתים קרובות בעצמם, ובמקביל לשנות תכונות מסוימות של המכשיר (למשל, אנרגיה מסופקת), השימוש במכשירי EC לביצוע מחקרי טוקסיקולוגיה ארוכי טווח של חשיפה חוזרת ונשנית הוא לא רק מאתגר, אלא גם לא מספק.
מחולל האירוסולים הנימיים (CAG) שפותח על ידי פיליפ מוריס 12,13 ושוכלל עוד יותר על ידי אוניברסיטת וירג’יניה14– עובד על העיקרון של יצירת סילון של זרימת אדים חמה מנימי חימום חשמלית, אשר לאחר מכן מקורר עם אוויר הסביבה, מה שגורם להיווצרות גרעין חלקיקים ולעיבוי לאחר מכן, מה שמוביל להיווצרות אירוסול. מאחר שאותם תהליכים פיזיקליים מובילים להיווצרות אירוסולים ב-ECs (מלבד מסירת הנוזל לנימים על ידי משאבה ב-CAG, אשר, ב-EC, מוחלפת בדרך כלל בכוחות נימיים הפועלים על חומר הפתיל המושך את הנוזל מהמאגר ב-EC), המאפיינים של אירוסולים שנוצרו על ידי CAG דומים מאוד לאלה של אירוסולים EC14 (איור 14 ). ה- CAG מאפשר ייצור של כמויות גדולות של תרסיס, עם דרישות טיפול מעטות; לכן, הוא מתאים במיוחד למחקרי שאיפה in vivo.
CAG הוא מכשיר מעבדה המורכב מצינור נימי מחומם המחובר בפשטות לבקר טמפרטורה ולמאגר נוזלי באמצעות משאבה פריסטלטית (איור 2A). הנימים (160 מ”מ, 21 גרם, נירוסטה) מחוממים על ידי ארבעה גופי חימום, כולם מוטבעים בגוש אלומיניום (איור 2B). הטמפרטורה נקבעת בדרך כלל על 250-275 מעלות צלזיוס כדי לחקות את תנאי חימום הסלילים של מכשיר EC15. הנוזל הנשאב דרך הנימים מחומם והופך לאדים חמים היוצאים מקצה הנימים. מכלול CAG (איור 2C) דורש אלמנטים נוספים לערבוב האדים הנוצרים עם אוויר קר וליצירת תרסיס. הערבוב הפתאומי של האדים העל-רוויים החמים עם זרם אוויר קר גורם לנוקלאציה ולעיבוי לאחר מכן, מה שמוביל להיווצרות תרסיס (איור 2C). בתכנון ה-CAG שלנו (איור 3), זרימת אוויר מחוממת נוספת מקררת תחילה את הגוף החיצוני ולאחר מכן זורמת לאורך גושי החימום כדי לחמם את זרימת האוויר, ובכך מונעת, בו-זמנית, עיבוי של הזרימה האחורית הנוזלית בקצה הנימים וייצוב פרץ סילון האדים. בנוסף, הוא יוצר סיכוך לא רצוי של אדים חמים, ובכך משפיע על תהליך הגרעין. מסיבה זו, קצב הזרימה החל על זרימת אוויר זו צריך להיות מינימלי ולהתאים למטרת היישום. זרימת אוויר זו תיקרא “זרימת אוויר מחוממת” לאורך כל כתב היד הזה, אם כי יש להבין כי זרם זה מחומם באופן פסיבי על ידי בלוקי החימום ולא בכוונה על ידי המשתמש.
לקצב זרימת האוויר המתקרר יש השפעה חזקה על גודל חלקיקי האירוסול הנוצרים. בייצור אירוסולים עבור מחקרי שאיפה in vivo , זרימת האוויר בדילול תקבע את מינון החשיפה וייתכן שיהיה צורך לדלל אותה עוד יותר לפני שתגיע לתא החשיפה. מלבד ההרכב הכימי של אירוסולים, חיוני לאפיין את התפלגות גודל חלקיקי האירוסול (PSD) כדי להבטיח שהארוסול שנוצר יהיה דומה לזה שנוצר על ידי ECs ובתוך טווח גודל חלקיקי השאיפה המומלצים על ידי הנחיות ה-OECD (לעתים קרובות בפרמטרים של ההנחה של לוג-נורמליות של PSD עם קוטר אווירודינמי חציוני מסה [MMAD] וסטיית תקן גיאומטרית [GSD]).
ה-MMAD של האירוסולים הנוצרים יכול להשתנות במידה רבה בהתאם לתכנון המכשיר, לתכונות הנוזל הפיסיקוכימיות של הפורמולציה (למשל, צפיפות, צמיגות ומתח פני השטח), קצב זרימת האוויר והטמפרטורה המכתיבה תנאים תרמודינמיים 14,16,17. עבור ניסויי חשיפה in vivo, זרימת האוויר מורכבת בדרך כלל מאוויר ממוזג ומסונן ב-22 ±-2 מעלות צלזיוס ו-60% ± לחות יחסית של 5%. לאחר מכן ניתן לדלל את התרסיס שנוצר עוד יותר בהתאם לדרישות המחקר, כדי להשיג ריכוזי מטרה באטמוספרת הבדיקה. לאחר מכן הוא מועבר באמצעות צנרת זכוכית לתא החשיפה על מנת להפחית את אובדן הסינון. בתוצאות שהוצגו כאן, הגדרות הטמפרטורה וזרימת האוויר נקבעות כדי להראות כי ניתן להשתמש ב- CAG לייצור רציף של תרסיס מבוקר עם PSD עקבי ובלתי ניתן לשאיפה וריכוזים מוגדרים למחקרי שאיפה in vivo.
בפרוטוקול נתאר כיצד: 1) להרכיב את ה- CAG, 2) לקבוע פרמטרים הנדרשים להפקת אירוסול מה- CAG, 3) לבצע ייצור תרסיס, ו- 4) לנתח מרכיבים פיזיקליים וכימיים בעלי עניין בתרסיס. עבור ריצות ראשוניות אלה, אנו שוקלים תמיסה נוזלית המבוססת על תערובת של רכיבים יוצרי אירוסול: פרופילן גליקול (PG), גליצרול (VG), מים וניקוטין בשברי מסה שנקבעו. לבסוף, נשתף נתונים לדוגמה להערכת תערובת רב-מינית מורכבת שנוצרה בניסויים שלנו (הכוללת את המרכיבים הנ”ל מעורבבים עם מרכיבי טעם נוספים). נדון בתוצאות ובאתגרים הכוללים יחד עם תחולתה של גישה ניסיונית זו להערכת תערובות כאלה.
Protocol
Representative Results
Discussion
יצירת אירוסולים עם CAG מסייעת להפחית את השונות של תהליכי אירוסוליזציה ספציפיים למכשירי EC, ומאפשרת הערכה אובייקטיבית וניתנת לשליטה של נוסחת הנוזל האלקטרוני האירוסולי עצמה. אירוסולים שנוצרו על ידי CAG הוכחו כמייצגים את האירוסולים שנוצרו על ידי ECs7. הם יכולים להיווצר באופן משוחזר עם אותם הרכבים ומאפיינים ולכן הם מתאימים במיוחד למחקרי חשיפה ארוכי טווח in vivo הדורשים כמויות גדולות של תרסיס לאורך תקופה ארוכה8.
הגדרת ה- CAG פשוטה יחסית להרכבה וקלה לתחזוקה. עם זאת, הפרמטרים התפעוליים, כגון קצב זרימת נוזלים וקצבי זרימת אוויר בהתאמה, נשארים קריטיים לייצור תרסיס מבוקר, הדורש אופטימיזציה של השיטה בהתאם למטרת היישום של האירוסול שנוצר על ידי CAG.
התוצאות המוצגות במחקר הנוכחי מראות כי לקצב זרימת האוויר בקירור יש השפעה ברורה על התפלגות גודל חלקיקי האירוסול. לזרימת האוויר המתקררת יש השפעה ישירה לא רק על נוקלאציה של האדים הנוצרים אלא גם על עיבוי, בגלל קירור הצינורות הפנימיים שבהם זורם האירוסול שנוצר. בנוסף, האירוסול הצפוף נוטה להשפעות קרישה משמעותיות. יחד, תהליכים אלה מורכבים והאינטראקציה והשפעתם על היווצרות אירוסולים קשים למדי להכללה עבור הנוזלים האלקטרוניים הספציפיים, הטמפרטורות והזרימות. הרכב זרימת אוויר משלים (יבש או לח עם אחוז קבוע של לחות יחסית) – בפרט, תכולת המים – ישפיע על חום וחילופי מסות, מה שיוביל לא רק לצמיחת עיבוי מווסתת של חלקיקי אירוסול אלא גם עיבוי דופן. לפיכך, שינויים בפרמטרים של שיטה זו נחשבים לצורך שימוש במונחים של שליטה ב- PSD17,19.
נוכחות של כימיקלים עם מסיסות נמוכה או נקודות רתיחה גבוהות עלולה להגביל את היעילות של תרסיס שנוצר על ידי CAG עקב משקעים בתוך הנימים וסתימת הנימים לאורך זמן. בהתאם לכימיקלים הקיימים בתרסיס, יש להתאים את הטמפרטורה להפעלת ה- CAG כדי ליצור את האדים. בנוסף, יש להעריך באופן קבוע את יציבות הפורמולה הנוזלית. הוספת מרכיבים, כולל טעמים, עם נקודות רתיחה שונות תשפיע על הרכב האירוסול הסופי14 ועל חלוקת גז-נוזל. ייתכן שיהיה צורך להתאים את הטמפרטורה הנימית ואת זרימת האוויר המחממת כדי למנוע זרימה חוזרת ושקיעה נוזלית ליד הנימים החמים, מה שעלול לגרום ליצירת מוצרים בלתי מבוקרים של פירוק תרמי (כגון קרבונילים) בגלל משך הזמן הארוך של שימור הנוזל בטמפרטורה גבוהה. בנוסף, לשליטה בטמפרטורה המשמשת ליצירת האדים בנימי יש השפעה על המקום שבו האדים מתחילים להיווצר בנימיות – ככל שהטמפרטורה גבוהה יותר, כך האדים נוצרים מוקדם יותר. עם טמפרטורת נימי גבוהה יותר, לאדים היוצאים מהנימי ייקח זמן רב יותר להתקרר על ידי זרימת האוויר המתקררת, ולכן יתחילו לגרום ולהתעבות לתוך תרסיס רחוק יותר מקצה הנימים, מה שיעזור למנוע אפקט זרימה אחורית19.
מחקרי הטוקסיקולוגיה הנוכחיים של e-liquid in vivo מוגבלים בשחזור אירוסולים של סיגריות אלקטרוניות בשל המורכבות הלוגיסטית כדי לעמוד בקנה המידה של האירוסול הנדרש, כגון במחקר של OECD TG 41320. הפרוטוקול המוצג במחקר זה נותן סקירה כללית על הרכבה CAG והגדרות המשמשות בפיליפ מוריס אינטרנשיונל לייצור אירוסולים במחקרי חשיפה ארוכי טווח in vivo 18. נתונים אלה יכולים לשמש כנקודת התחלה טובה לכוונון עדין נוסף בסביבת מעבדה אחרת (למשל, מערכות אספקת תרופות21) או להתאמה לדרישות ספציפיות של מחקר מסוים.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Aluminium front cap | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | Purpose built, 1 x |
| Aluminium heating block, groove diameter 0.4mm | Phil Gunn Machine Co., Inc, VA, USA | B-505432 | 2 x |
| Aluminium rear cap | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | 1 x |
| Cambridge glass filter pads | GE Healthcare UK Limited | 9703-9654 | 44 mm diameter |
| Capillary 21 G SS, 160 mm | Phil Gunn Machine Co., Inc, VA, USA | 304H21RW | 1 x |
| Dry wipes | Contec Inc. , SC, USA | Prosat Wipes saturated with isopropyl alcohol | cleaning material |
| Flowmeter | TSI, Shoreview, MI, USA | 4100 Series, 0-20 L/min | or equivalent |
| Gilibrator-2 calibrator | Sensidyne, St-Petersburg FL, USA | Gilian Gilibrator-2 | Air flow calibrator |
| Glass Couplings | Labo Service, Kontich, Belgium | QVF | |
| Glass piping | Labo Service, Kontich, Belgium | QVF | Pipe 25 and 40 mm |
| Heating elements | Phil Gunn Machine Co., Inc, VA, USA | LDC01864 | 4 x |
| High heat grease | Lubriplate Lubricant Company, NJ, USA | High temperature multipurpose grease | CAG maintenance |
| Inner PEEK tube | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | 1 x |
| Magnetic stirrer | IKA-Werke GmbH & Co. KG, Staufen, Germany | C-MAG HS 4 | or equivalent |
| Micro impingers | Labo Service, Kontich, Belgium | Custom Built | |
| Outer SS tube | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | 1 x |
| PEEK adaptor | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | Purpose built, 1 x |
| Peristaltic pump | Watson-Marlow Fluid Technology Group, Falmouth, UK | Watson-Marlow 530 U | or equivalent |
| Push-in fitting | Festo Pte Ltd | NPQM-DK-M5-Q4-P10 | 1 x |
| Sample Column Extrelut NT3 cartridge | Merk Sigma-Aldrich | 115095 | |
| SS 25 mm assembly cap | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | Purpose built, 1 x |
| SS M8 lead screw | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | 3 x |
| SS M8 nut | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | 3 x |
| SS rear backing | Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, Switzerland | Custom Built | Purpose built, 1 x |
| Temperature controller | Cole Parmer GmbH, Wertheim, Germany | Digi-Sense TC 9600 | or equivalent |
| Thermocouple type K | RS Components GmbH, Wädenswil, Switzerland | 814-0147 | 1 x |
References
- Williams, M., Talbot, P. Variability among electronic cigarettes in the pressure drop, airflow rate, and aerosol production. Nicotine and Tobacco Research. 13 (12), 1276-1283 (2011).
- Farsalinos, K. E., Voudris, V., Poulas, K. E-cigarettes generate high levels of aldehydes only in ‘dry puff’ conditions. Addiction. 110 (8), 1352-1356 (2015).
- Werley, M. S., et al. Toxicological assessment of a prototype e-cigaret device and three flavor formulations: a 90-day inhalation study in rats. Inhalation Toxicology. 28 (1), 22-38 (2015).
- Werley, M. S., et al. Non-clinical safety and pharmacokinetic evaluations of propylene glycol aerosol in Sprague-Dawley rats and Beagle dogs. Toxicology. 287 (1-3), 76-90 (2011).
- Werley, M. S., et al. Prototype e-cigarette and the capillary aerosol generator (CAG) comparison and qualification for use in subchronic inhalation exposure testing. Aerosol Science and Technology. 50 (12), 1284-1293 (2016).
- Williams, M., Villarreal, A., Bozhilov, K., Lin, S., Talbot, P. Metal and silicate particles including nanoparticles are present in electronic cigarette cartomizer fluid and aerosol. PLoS One. 8 (3), 57987 (2013).
- Bekki, K., Uchiyama, S., Ohta, K., Inaba, Y., Kunugita, N. Carbonyl compounds generated from electronic cigarettes. International Journal of Environmental Research and Public Health. 11 (11), 11192-11200 (2014).
- Flora, J. W., et al. Characterization of potential impurities and degradation products in electronic cigarette formulations and aerosols. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 74, 1-11 (2016).
- Tobacco Products Directive. Directive 2014/40/EU of the European Parliament and of the Council on 3 April 2014 Available from: https://ec.europa.eu/health/sites/health/files/tobacco/docs/dir_201440_en.pdf (2014)
- Farsalinos, K. E., Le Houezec, J. Regulation in the face of uncertainty: the evidence on electronic nicotine delivery systems (e-cigarettes). Risk Management and Healthcare Policy. 8, 157-167 (2015).
- McNeill, A., Brose, L., Calder, R., Bauld, L., Robson, D. Evidence review of e-cigarettes and heated tobacco products 2018. A report commissioned by Public Health England. Public Health England. , (2018).
- Howell, T. M., Sweeney, W. R. Aerosol and a method and apparatus for generating an aerosol. US Patent. , (1998).
- Dutra, L. M., Grana, R., Glantz, S. A. Philip Morris research on precursors to the modern e-cigarette since 1990. Tobacco Control. 26, 97-105 (2017).
- Gupta, R., Hindle, M., Byron, P. R., Cox, K. A., McRae, D. D. Investigation of a novel Condensation Aerosol Generator: solute and solvent effects. Aerosol Science and Technology. 37 (8), 672-681 (2003).
- Geiss, O., Bianchi, I., Barrero-Moreno, J. Correlation of volatile carbonyl yields emitted by e-cigarettes with the temperature of the heating coil and the perceived sensorial quality of the generated vapours. International Journal of Hygiene and Environmental Health. 219 (3), 268-277 (2016).
- Hong, J. N., Hindle, M., Byron, P. R. Control of particle size by coagulation of novel condensation aerosols in reservoir chambers. Journal of Aerosol Medicine. 15 (4), 359-368 (2002).
- Taylor, G., Warren, S., McRae, D., Venitz, J. Human deposition and exposure studies with propylene glycol aerosols produced using the CAG technology platform. Respiratory Drug Delivery. 1, 183-190 (2006).
- Wong, E. T., et al. A 6-month inhalation toxicology study in Apoe -/- mice demonstrates substantially lower effects of e-vapor aerosol compared with cigarette smoke in the respiratory tract. Archive of Toxicology. 95 (5), 1805-1829 (2021).
- Shen, X., Hindle, M., Byron, P. R. Effect of energy on propylene glycol aerosols using the capillary aerosol generator. International Journal of Pharmaceutics. 275 (1-2), 249-258 (2004).
- Phillips, B., et al. Toxicity of the main electronic cigarette components, propylene glycol, glycerin, and nicotine, in Sprague-Dawley rats in a 90-day OECD inhalation study complemented by molecular endpoints. Food and Chemical Toxicology. 109, 315-332 (2017).
- Hindle, M., Cox, K. A., Gupta, R. Adding pharmaceutical flexibility to the capillary aerosol generator. Proceedings of Respiratory Drug Delivery IX. (Volume III). , 247-253 (2004).
