Acyl-PEGyl Обмен Гель Сдвиг Анализ для количественного определения Palmitoylation мозга Membrane белков
Summary
Palmitoylation влечет за собой включение 16-углеродного пальмитата moiety к цистеину остатков целевых белков в обратимым образом. Здесь мы описываем биохимический подход, ацил-PEGyl обмен ный гель сдвиг (APEGS) анализ, чтобы исследовать состояние пальмитоилации любого белка, интересующее в мышиных лизатах мозга.
Abstract
Считается, что изменения, зависящие от активности в уровнях синаптических рецепторов АМРА (АМРАР) в течение постсинаптической плотности (PSD), представляют собой клеточный механизм обучения и памяти. Palmitoylation регулирует локализацию и функцию многих синаптических белков, включая АМРА-Rs, вспомогательные факторы и синаптические леса в активности-зависимым образом. Мы определили синапсовую дифференциацию индуцированного гена (SynDIG) семейства из четырех генов (SynDIG1-4), кодирующих трансмембранные белки, которые ассоциируются с АМРАРами и регулируют силу синапсов. SynDIG1 является palmitoylated на двух остатков цистеина, расположенных на позициях 191 и 192 в регионе juxta-transmembrane важно для деятельности-зависимых возбуждания синапсов развития. Здесь мы описываем инновационный биохимический подход, ацил-PEGyl обменный гель сдвиг (APEGS) анализ, чтобы исследовать состояние пальмитоилации любого белка интерес и продемонстрировать свою полезность с семейством SynDIG белков в мышиных мозговых лизатах.
Introduction
S-palmitoylation является обратимой пост-трансляционной модификации целевых белков, которая регулирует стабильную мембранную ассоциацию, торговлю белками и белково-белковые взаимодействия1. Она включает в себя добавление 16-углеродного пальмитата moiety к остаткам цистеина через тиостер связи катализировали palmitoyl acyltransferase (PAT) ферментов. Многие синаптические белки в головном мозге palmitoylated, в том числе АМРА-Rs и PSD-95, в активности-зависимым образом для регулирования стабильности, локализации, и функции2,3,4. Изменения в уровнях синаптической АМРАРов в PSD через взаимодействие вспомогательных факторов с синаптической эшафот, таких как PSD-95 лежит в основе синаптической пластичности; Таким образом, методы определения состояния пальмитоилации синаптических белков дают важное представление о механизмах синаптической пластичности.
Ранее мы определили семейство SynDIG из четырех генов (SynDIG1-4), кодирующих трансмембранные белки, которые ассоциируются с АМРАРами5. Переэкспрессия или нокдаун SynDIG1 в диссоциированных крысиных гиппокампальных нейронов увеличивается или уменьшается, соответственно, ampA-R размер синапса и число на 50%, как обнаружено с помощью иммуноцитохимии и электрофизиологии5. Мы использовали ацил-биотин обмена (ABE) анализ, чтобы продемонстрировать, что SynDIG1 palmitoylated на двух консервированных juxta-transmembrane Cys остатков (найдено во всех белках SynDIG) в деятельности зависимых образом для регулирования стабильности, локализации и функции6. ABE ассси опирается на обмен биотина на цистеины защищены модификации и последующей очистки сродства7. Здесь мы описываем инновационный биохимический подход, ацил-PEGyl обмен ный гель сдвиг (APEGS) анализ8,9,10,11,12, который не требует очистки сродства и вместо этого использует изменения в подвижности геля, чтобы определить количество изменений для белка интерес. Протокол описан для исследования эндогенных мембранных белков из мозга мыши, для которых доступны подходящие антитела.
Protocol
Representative Results
Discussion
В нашей предыдущей работе, мы использовали анализ ABE, чтобы продемонстрировать, что SynDIG1 является palmitoylated на двух консервированных juxta-transmembrane Cys остатков (найдено во всех белках SynDIG) в деятельности-зависимым образом для регулирования стабильности, локализации и функции6. Огр…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят К. Вулфри за советы и вклад в aPEGS. Эти исследования финансировались за счет научно-исследовательских грантов E.D. от Фонда Уайтхолла и NIH-NIMH (1R01MH19347).
Materials
| Hydroxylamine (HAM) | ThermoFisher | 26103 | |
| Methoxy-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG) | NOF | ME-050MA | MW ~5000 kDa |
| Microfuge | Eppendorf | 5415R | or equivalent equipment |
| N-ethylmalemide (NEM) | Calbiochem | 34115 | Highly toxic. |
| Optical imager for densitometry | Azure Biosystems | Sapphire Biomolecular Imager | or equivalent equipment |
| Polypropylene tubes with cap | Fisher Scientific | 14-956-1D | |
| Serological pipets (glass) | Fisher Scientific | 13-678-27D | |
| Table top centrifuge | Beckman | Allegra X-15R | or equivalent equipment |
| Tris(2-carboxyethyl) phosphine-hydrochloride (TCEP) | EMD Millipore | 580560 |
References
- Blaskovic, S., Blanc, M., van der Goot, F. G. What does S-palmitoylation do to membrane proteins?. FEBS Journal. 280, 2766-2774 (2013).
- Fukata, Y., Fukata, M. Protein palmitoylation in neuronal development and synaptic plasticity. Nature Reviews Neuroscience. 11, 161-175 (2010).
- Globa, A. K., Bamji, S. X. Protein palmitoylation in the development and plasticity of neuronal connections. Current Opinion in Neurobiology. 45, 210-220 (2017).
- Thomas, G. M., Huganir, R. L. Palmitoylation-dependent regulation of glutamate receptors and their PDZ domain-containing partners. Biochemical Society Transactions. 41, 72-78 (2013).
- Kalashnikova, E., et al. SynDIG1: an activity-regulated, AMPA- receptor-interacting transmembrane protein that regulates excitatory synapse development. Neuron. 65, 80-93 (2010).
- Kaur, I., et al. Activity-Dependent Palmitoylation Controls SynDIG1 Stability, Localization, and Function. Journal of Neuroscience. 36, 7562-7568 (2016).
- Wan, J., Roth, A. F., Bailey, A. O., Davis, N. G. Palmitoylated proteins: purification and identification. Nature Protocols. 2, 1573-1584 (2007).
- Howie, J., et al. Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 17534-17539 (2014).
- Kanadome, T., Yokoi, N., Fukata, Y., Fukata, M. Systematic Screening of Depalmitoylating Enzymes and Evaluation of Their Activities by the Acyl-PEGyl Exchange Gel-Shift (APEGS) Assay. Methods in Molecular Biology. 2009, 83-98 (2019).
- Percher, A., et al. Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 4302-4307 (2016).
- Percher, A., Thinon, E., Hang, H. Mass-Tag Labeling Using Acyl-PEG Exchange for the Determination of Endogenous Protein S-Fatty Acylation. Current Protocols in Protein Science. 89, 14.17.1-14.17.11 (2017).
- Yokoi, N., et al. Identification of PSD-95 Depalmitoylating Enzymes. Journal of Neuroscience. 36, 6431-6444 (2016).
- . JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2019).
- . Science Education Database. The Western Blot. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2019).
- Chenaux, G., et al. Loss of SynDIG1 Reduces Excitatory Synapse Maturation But Not Formation In Vivo. eNeuro. 3 (5), (2016).
- Matt, L., et al. SynDIG4/Prrt1 Is Required for Excitatory Synapse Development and Plasticity Underlying Cognitive Function. Cell Reports. 22, 2246-2253 (2018).
- Purkey, A. M., et al. AKAP150 Palmitoylation Regulates Synaptic Incorporation of Ca(2+)-Permeable AMPA Receptors to Control LTP. Cell Reports. 25, 974-987 (2018).
- Woolfrey, K. M., Sanderson, J. L., Dell’Acqua, M. L. The palmitoyl acyltransferase DHHC2 regulates recycling endosome exocytosis and synaptic potentiation through palmitoylation of AKAP79/150. Journal of Neuroscience. 35, 442-456 (2015).
