Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay pour détermination quantitative de la palmitoylation des protéines de membrane cérébrale
Summary
La palmitoylation implique l’incorporation d’une noisette palmitate de 16 carbone aux résidus de cystéine des protéines cibles d’une manière réversible. Ici, nous décrivons une approche biochimique, l’essai de gel d’échange d’acyl-PEGyl (APEGS), pour étudier l’état de palmitoylation de toute protéine d’intérêt pour les lysates de cerveau de souris.
Abstract
Les altérations dépendantes de l’activité dans les niveaux des récepteurs synaptiques d’AMPA (AMPA) dans la densité postsynaptique (PSD) sont pensés pour représenter un mécanisme cellulaire pour l’apprentissage et la mémoire. La palmitoylation régule la localisation et la fonction de nombreuses protéines synaptiques, y compris les AMPA-R, les facteurs auxiliaires et les échafaudages synaptiques d’une manière dépendante de l’activité. Nous avons identifié la famille induite par la différenciation synapse (SynDIG) de quatre gènes (SynDIG1-4) codant des protéines transmémbranées spécifiques au cerveau qui s’associent aux AMPARs et régulent la force synapse. SynDIG1 est palmitoylated à deux résidus de cystéine situés aux positions 191 et 192 dans la région de juxta-transmembrane importante pour le développement de synapse excitatrice activité-dépendante. Ici, nous décrivons une approche biochimique innovante, l’essai de changement de gel d’échange d’acyl-PEGyl (APEGS), pour étudier l’état de palmitoylation de toute protéine d’intérêt et démontrer son utilité avec la famille SynDIG des protéines dans les lysates de cerveau de souris.
Introduction
S-palmitoylation est une modification post-translationnelle réversible des protéines cibles qui régule l’association stable de membrane, le trafic de protéine, et les interactions protéine-protéine1. Il s’agit de l’ajout d’une meety palmitate de 16 carbone aux résidus de cystéine via le lien thioester catalysé par les enzymes palmitoyl acyltransferase (PAT). Beaucoup de protéines synaptiques dans le cerveau sont palmitoylated, y compris AMPA-Rs et PSD-95, d’une manière dépendante de l’activité pour réguler la stabilité, la localisation, et la fonction2,3,4. Les modifications dans les niveaux des AMPARs synaptiques dans le PSD par l’interaction des facteurs auxiliaires avec des échafaudages synaptiques tels que PSD-95 sous-tend la plasticité synaptique ; ainsi, les méthodes pour déterminer l’état de palmitoylation des protéines synaptiques fournit un aperçu important des mécanismes de plasticité synaptique.
Auparavant, nous avons identifié la famille SynDIG de quatre gènes (SynDIG1-4) codant des protéines transmémbranes spécifiques au cerveau qui s’associent à DES AMPAR5. La surexpression ou la chute de SynDIG1 dans les neurones hippocampal de rat dissociés augmente ou diminue, respectivement, la taille et le nombre de synapse d’AMPA-R de 50 % détectés à l’aide de l’immunocytochimie et de l’électrophysiologie5. Nous avons utilisé l’essai d’échange d’acyl-biotine (ABE) pour démontrer que SynDIG1 est palmitoylated à deux résidus conservés juxta-transmembrane Cys (trouvés dans toutes les protéines SynDIG) d’une manière dépendante de l’activité pour réguler la stabilité, la localisation, et la fonction6. L’essai ABE repose sur l’échange de biotine sur les cystéines protégées par la modification et la purification d’affinité ultérieure7. Ici, nous décrivons une approche biochimique innovante, le changement de gel d’échange d’acyl-PEGyl (APEGS) assay8,9,10,11,12, qui ne nécessite pas de purification d’affinité et utilise plutôt des changements dans la mobilité de gel pour déterminer le nombre de modifications pour une protéine d’intérêt. Le protocole est décrit pour l’étude des protéines endogènes de membrane du cerveau de souris pour lesquelles des anticorps appropriés sont disponibles.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans nos travaux précédents, nous avons utilisé l’essai ABE pour démontrer que SynDIG1 est palmitoylated à deux résidus conservés juxta-transmembrane Cys (trouvés dans toutes les protéines SynDIG) d’une manière dépendante de l’activité pour réguler la stabilité, la localisation, et la fonction6. Une limitation est que l’essai ABE nécessite la purification d’affinité avec des résines agarose conjuguées à des moieties avides comme dernière étape dans la procédure, aya…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient K. Woolfrey pour ses conseils et leurs commentaires sur l’analyse APEGS. Ces études ont été financées par des subventions de recherche à E.D. de la Whitehall Foundation et du NIH-NIMH (1R01MH119347).
Materials
| Hydroxylamine (HAM) | ThermoFisher | 26103 | |
| Methoxy-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG) | NOF | ME-050MA | MW ~5000 kDa |
| Microfuge | Eppendorf | 5415R | or equivalent equipment |
| N-ethylmalemide (NEM) | Calbiochem | 34115 | Highly toxic. |
| Optical imager for densitometry | Azure Biosystems | Sapphire Biomolecular Imager | or equivalent equipment |
| Polypropylene tubes with cap | Fisher Scientific | 14-956-1D | |
| Serological pipets (glass) | Fisher Scientific | 13-678-27D | |
| Table top centrifuge | Beckman | Allegra X-15R | or equivalent equipment |
| Tris(2-carboxyethyl) phosphine-hydrochloride (TCEP) | EMD Millipore | 580560 |
References
- Blaskovic, S., Blanc, M., van der Goot, F. G. What does S-palmitoylation do to membrane proteins?. FEBS Journal. 280, 2766-2774 (2013).
- Fukata, Y., Fukata, M. Protein palmitoylation in neuronal development and synaptic plasticity. Nature Reviews Neuroscience. 11, 161-175 (2010).
- Globa, A. K., Bamji, S. X. Protein palmitoylation in the development and plasticity of neuronal connections. Current Opinion in Neurobiology. 45, 210-220 (2017).
- Thomas, G. M., Huganir, R. L. Palmitoylation-dependent regulation of glutamate receptors and their PDZ domain-containing partners. Biochemical Society Transactions. 41, 72-78 (2013).
- Kalashnikova, E., et al. SynDIG1: an activity-regulated, AMPA- receptor-interacting transmembrane protein that regulates excitatory synapse development. Neuron. 65, 80-93 (2010).
- Kaur, I., et al. Activity-Dependent Palmitoylation Controls SynDIG1 Stability, Localization, and Function. Journal of Neuroscience. 36, 7562-7568 (2016).
- Wan, J., Roth, A. F., Bailey, A. O., Davis, N. G. Palmitoylated proteins: purification and identification. Nature Protocols. 2, 1573-1584 (2007).
- Howie, J., et al. Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 17534-17539 (2014).
- Kanadome, T., Yokoi, N., Fukata, Y., Fukata, M. Systematic Screening of Depalmitoylating Enzymes and Evaluation of Their Activities by the Acyl-PEGyl Exchange Gel-Shift (APEGS) Assay. Methods in Molecular Biology. 2009, 83-98 (2019).
- Percher, A., et al. Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 4302-4307 (2016).
- Percher, A., Thinon, E., Hang, H. Mass-Tag Labeling Using Acyl-PEG Exchange for the Determination of Endogenous Protein S-Fatty Acylation. Current Protocols in Protein Science. 89, 14.17.1-14.17.11 (2017).
- Yokoi, N., et al. Identification of PSD-95 Depalmitoylating Enzymes. Journal of Neuroscience. 36, 6431-6444 (2016).
- . JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2019).
- . Science Education Database. The Western Blot. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2019).
- Chenaux, G., et al. Loss of SynDIG1 Reduces Excitatory Synapse Maturation But Not Formation In Vivo. eNeuro. 3 (5), (2016).
- Matt, L., et al. SynDIG4/Prrt1 Is Required for Excitatory Synapse Development and Plasticity Underlying Cognitive Function. Cell Reports. 22, 2246-2253 (2018).
- Purkey, A. M., et al. AKAP150 Palmitoylation Regulates Synaptic Incorporation of Ca(2+)-Permeable AMPA Receptors to Control LTP. Cell Reports. 25, 974-987 (2018).
- Woolfrey, K. M., Sanderson, J. L., Dell’Acqua, M. L. The palmitoyl acyltransferase DHHC2 regulates recycling endosome exocytosis and synaptic potentiation through palmitoylation of AKAP79/150. Journal of Neuroscience. 35, 442-456 (2015).
