Acyl-PEGyl تبادل جل تحويلة القول لتحديد كمي من البالميتويشن من بروتينات غشاء الدماغ
Summary
البالميتويلية ينطوي على دمج البالميتات 16 الكربون moiety لمخلفات السيستين من البروتينات المستهدفة بطريقة قابلة للعكس. هنا، ونحن نصف نهج بيوكيميائية، وacyl-PEGyl تحويل هلام تبادل (APEGS) فحص، للتحقيق في حالة palmitoylation من أي بروتين من الفائدة في تحلل الدماغ الماوس.
Abstract
ويعتقد أن التعديلات التي تعتمد على النشاط في مستويات مستقبلات AMPA متشابك (AMPARs) داخل كثافة postynaptic (PSD) تمثل آلية خلوية للتعلم والذاكرة. البمنية ينظم توطين وظيفة العديد من البروتينات متشابك بما في ذلك AMPA-Rs, العوامل المساعدة وسقالات متشابك بطريقة تعتمد على النشاط. حددنا التمايز المتسبب في المشبك (SynDIG) الأسرة من أربعة جينات (SynDIG1-4) ترميز البروتينات عبر الغشاء الدماغ محددة التي ترتبط مع AMPARs وتنظيم قوة المشبك. SynDIG1 هو palmitoylated في اثنين من بقايا السيستين تقع في موقفين 191 و 192 في منطقة التجاور عبر الغشاء المهم لتطوير المشبك مثير يعتمد على النشاط. هنا، ونحن نصف نهج بيوكيميائية مبتكرة، وacyl-PEGyl تحويل هلام تبادل (APEGS) فحص، للتحقيق في حالة palmitoylation من أي بروتين الفائدة وإظهار فائدتها مع عائلة SynDIG من البروتينات في تحلل الدماغ الماوس.
Introduction
S-palmitoylation هو تعديل عكسها بعد الترجمة من البروتينات المستهدفة التي تنظم الارتباط غشاء مستقر، والاتجار البروتين، والتفاعلات البروتين والبروتين1. وهو ينطوي على إضافة البالميتات 16 الكربون moiety إلى بقايا السيستين عبر ربط ثيويستر حفز هاميسمنس البالميتوسيل acyltransferase (بات) الإنزيمات. العديد من البروتينات متشابك في الدماغ هي palmitoylated، بما في ذلك AMPA-Rs و PSD-95، بطريقة تعتمد على النشاط لتنظيم الاستقرار، والتعريب، وظيفة2،3،4. التعديلات في مستويات AMPARs متشابك في PSD عن طريق التفاعل بين العوامل المساعدة مع السقالات متشابك مثل PSD-95 يكمن اللدونة متشابك; وبالتالي ، فإن طرق تحديد حالة palmitoylation من البروتينات متشابك يوفر نظرة ثاقبة هامة في آليات اللدونة متشابك.
في السابق ، حددنا عائلة SynDIG من أربعة جينات (SynDIG1-4) ترميز البروتينات عبر الغشاء الدماغي المحددة التي ترتبط مع AMPARs5. الإفراط في التعبير أو ضرب أسفل SynDIG1 في الخلايا العصبية فرس النهر الفئران المنفصلة يزيد أو يقلل، على التوالي، AMPA-R حجم الاشتباك العصبي وعدد من قبل ~ 50٪ كما تم الكشف عنها باستخدام الكيمياء المناعية والفيزيولوجيا الكهربائية5. لقد استعينا في تبادل acyl-biotin (ABE) للتثبت من أن SynDIG1 هو palmitoylated في اثنين من بقايا Cys التجاور يُحفظ (الموجودة في جميع بروتينات SynDIG) بطريقة تعتمد على النشاط لتنظيم الاستقرار والتوطين والوظيفة6. يعتمد ازى ABE على تبادل البيوتين على السيستين اتى محمية بالتعديل وتنقية التقارب اللاحقة7. هنا، ونحن نصف نهج البيوكيميائية مبتكرة، وacyl-PEGyl تحويلهلام تبادل (APEGS) كمية88،9،,10،,11،,12،والتي لا تتطلب تنقية تقارب وبدلا من ذلك يستخدم التغييرات في التنقل هلام لتحديد عدد من التعديلات لبروتين الفائدة. يوصف البروتوكول للتحقيق في بروتينات الأغشية الذاتية من دماغ الماوس التي تتوفر لها أجسام مضادة مناسبة.
Protocol
Representative Results
Discussion
في عملنا السابق، استعملنا في ABE للتثبت من أن SynDIG1 هو palmitoylated في اثنين من المخلفات السّيّز ة التجاور المُحافظ عليها (الموجودة في جميع بروتينات SynDIG) بطريقة تعتمد على النشاط لتنظيم الاستقرار، التوطين، والوظيفة6. وهناك قيد هو أن مقافي ABE يتطلب تنقية تقارب مع راتنجات agarose مترافقة مع ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤلفين أشكر ك. Woolfrey للحصول على المشورة والمدخلات على APEGS اقولها. تم تمويل هذه الدراسات من خلال منح بحثية لـ E.D. من مؤسسة وايتهول وNIH-NIMH (1R01MH119347).
Materials
| Hydroxylamine (HAM) | ThermoFisher | 26103 | |
| Methoxy-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG) | NOF | ME-050MA | MW ~5000 kDa |
| Microfuge | Eppendorf | 5415R | or equivalent equipment |
| N-ethylmalemide (NEM) | Calbiochem | 34115 | Highly toxic. |
| Optical imager for densitometry | Azure Biosystems | Sapphire Biomolecular Imager | or equivalent equipment |
| Polypropylene tubes with cap | Fisher Scientific | 14-956-1D | |
| Serological pipets (glass) | Fisher Scientific | 13-678-27D | |
| Table top centrifuge | Beckman | Allegra X-15R | or equivalent equipment |
| Tris(2-carboxyethyl) phosphine-hydrochloride (TCEP) | EMD Millipore | 580560 |
References
- Blaskovic, S., Blanc, M., van der Goot, F. G. What does S-palmitoylation do to membrane proteins?. FEBS Journal. 280, 2766-2774 (2013).
- Fukata, Y., Fukata, M. Protein palmitoylation in neuronal development and synaptic plasticity. Nature Reviews Neuroscience. 11, 161-175 (2010).
- Globa, A. K., Bamji, S. X. Protein palmitoylation in the development and plasticity of neuronal connections. Current Opinion in Neurobiology. 45, 210-220 (2017).
- Thomas, G. M., Huganir, R. L. Palmitoylation-dependent regulation of glutamate receptors and their PDZ domain-containing partners. Biochemical Society Transactions. 41, 72-78 (2013).
- Kalashnikova, E., et al. SynDIG1: an activity-regulated, AMPA- receptor-interacting transmembrane protein that regulates excitatory synapse development. Neuron. 65, 80-93 (2010).
- Kaur, I., et al. Activity-Dependent Palmitoylation Controls SynDIG1 Stability, Localization, and Function. Journal of Neuroscience. 36, 7562-7568 (2016).
- Wan, J., Roth, A. F., Bailey, A. O., Davis, N. G. Palmitoylated proteins: purification and identification. Nature Protocols. 2, 1573-1584 (2007).
- Howie, J., et al. Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 17534-17539 (2014).
- Kanadome, T., Yokoi, N., Fukata, Y., Fukata, M. Systematic Screening of Depalmitoylating Enzymes and Evaluation of Their Activities by the Acyl-PEGyl Exchange Gel-Shift (APEGS) Assay. Methods in Molecular Biology. 2009, 83-98 (2019).
- Percher, A., et al. Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 4302-4307 (2016).
- Percher, A., Thinon, E., Hang, H. Mass-Tag Labeling Using Acyl-PEG Exchange for the Determination of Endogenous Protein S-Fatty Acylation. Current Protocols in Protein Science. 89, 14.17.1-14.17.11 (2017).
- Yokoi, N., et al. Identification of PSD-95 Depalmitoylating Enzymes. Journal of Neuroscience. 36, 6431-6444 (2016).
- . JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2019).
- . Science Education Database. The Western Blot. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2019).
- Chenaux, G., et al. Loss of SynDIG1 Reduces Excitatory Synapse Maturation But Not Formation In Vivo. eNeuro. 3 (5), (2016).
- Matt, L., et al. SynDIG4/Prrt1 Is Required for Excitatory Synapse Development and Plasticity Underlying Cognitive Function. Cell Reports. 22, 2246-2253 (2018).
- Purkey, A. M., et al. AKAP150 Palmitoylation Regulates Synaptic Incorporation of Ca(2+)-Permeable AMPA Receptors to Control LTP. Cell Reports. 25, 974-987 (2018).
- Woolfrey, K. M., Sanderson, J. L., Dell’Acqua, M. L. The palmitoyl acyltransferase DHHC2 regulates recycling endosome exocytosis and synaptic potentiation through palmitoylation of AKAP79/150. Journal of Neuroscience. 35, 442-456 (2015).
