JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

Высокая пропускная способность Дрожжи Штамм Фенотипирование с капли на основе РНК секвенирования

Published: May 21, 2020
doi:
10.3791/61014
, , , ,
1Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences,University of California San Francisco, 2University of California Berkeley-UCSF Graduate Program in Bioengineering,University of California San Francisco, 3Department of Pharmaceutical Chemistry,University of California San Francisco, 4California Institute for Quantitative Biosciences,University of California San Francisco, 5Chan Zuckerberg Biohub

Summary

Узким местом в цикле микробной инженерии «дизайн-сборка» является скорость, с которой мы можем выполнять функциональные экраны штаммов. Мы описываем метод высокой пропускной способности для скрининга штамма применяется к сотням тысяч дрожжевых клеток в эксперименте, который использует капли на основе РНК секвенирования.

Abstract

Мощные инструменты, доступные для редактирования геномов дрожжей, сделали этот микроб ценной платформой для инженерии. Хотя в настоящее время можно построить библиотеки миллионов генетически различных штаммов, скрининг на желаемый фенотип остается значительным препятствием. С существующими методами скрининга существует компромисс между выходом информации и пропускной мощностью, при этом скрининг с высокой пропускной мощностью обычно проводится на одном интересуемом продукте. Поэтому мы представляем подход к ускорению скрининга деформации путем адаптации одноклеточной РНК секвенирования к изогенным пиколитерным колониям генетически модифицированных штаммов дрожжей. Для решения уникальных проблем, связанных с выполнением секвенирования РНК на дрожжевых клетках, мы культивируя изогенные дрожжевые колонии в гидрогелях и сферопластах до выполнения секвенирования РНК. Данные секвенирования РНК могут быть использованы для выводов дрожжевых фенотипов и сортировки инженерных путей. Масштабируемость нашего метода направлена на устранение критической препятствий в микробной инженерии.

Introduction

Основная цель микробной инженерии заключается в том, чтобы изменить микробов, чтобы побудить их производить ценные соединения1,2. S. cerevisiae был основным организмом для микробной инженерии из-за его простоты культуры и широты инструментов, доступных для разработки егогенома 3,4,5. Тем не менее, препятствие остается в выполнении функциональных экранов на модифицированных дрожжей: скрининг пропускной способность отстает от генома инженерии на порядок. Скрининг обычно включает в себя изоляцию штаммов в микроколодцпластинных пластинах и фенотипирование их путем измерения производства конкретного соединения6,7. Пропускная часть этого процесса ограничена большим количеством реагента, необходимого для асспогения отдельных штаммов в сотнях микролитровых реакций. Капли microfluidics обеспечивает привлекательное решение для увеличения пропускной силы дрожжей скрининга на порядок величины путем снижения реакций, как правило, выполняется в хорошо пластин8. Однако, как и хорошо пластины экраны, капли экраны обычно обнаруживают отдельные соединения продукта, который обеспечивает ограниченную информацию в глобальной функции инженерии пути9,10,11.

Секвенирование РНК (РНК-сек) может позволить более полную характеристику операции пути, позволяя уровни экспрессии всех соответствующих генов, которые будут оцениваться одновременно12,13. Кроме того, методы капель позволяют профилировать тысячи ячеек за эксперимент, обеспечивая пропускную связь, необходимую для проверки библиотек инженерных вариантов14,,15. Тем не менее, методы РНК-сек оптимизированы для клеток млекопитающих; дрожжи, для сравнения, имеют меньше мРНК на клетку и клеточной стенки, что трудно удалить16, исключая их последовательности существующими методами. Если бы можно было разработать метод высокой пропускной записи капель для включения дрожжевой РНК-сек, это обеспечило бы масштабируемую, экономичную и богатую информацией фенотипионную платформу для дрожжевой инженерии.

Мы представляем подробный протокол нашего недавно разработанного метода секвенирования дрожжевых клеток с использованием высокой пропускной способности капли microfluidics17. Чтобы преодолеть проблему ограниченной РНК, мы инкапсулируем и культивируем одиночные дрожжевые клетки в picoliter гидрогелевных сферах. Культура дублирует клетки, принося сотни копий, разделяющих один и тот же инженерный путь; это уменьшает изменение из-за экспрессии гена одной клетки пока значительно увеличивая количество RNA имеющегося для sequencing. После культурного усиления мы сферопластами клетки, удаляя клеточную стенку с помощью оптового ферментативного пищеварения. Клеточные мембраны остаются нетронутыми, так что каждая изогенная колония и связанная с ней мРНК остаются инкапсулированными в своих гидрогелевых сферах. Это позволяет нам спаривать отдельные колонии с реагентами мРНК и буфером лисиса, а мРНК захватывать, кодировать штрих-кодив и секвенировать после рабочего процесса Drop-Seq14. Наш метод позволяет процнизм всей скрининг тысяч изогенных дрожжевых колоний в эксперименте.

Protocol

1. Изготовление микрожидкости устройства Су-8 мастер-изготовление Дизайн отрицательной маски для микрофлюидных каналов для устройства A и B(Дополнительный файл 1 и 2)с помощью программного обеспечения с помощью компьютера дизайн и их напечатаны на пленке печатной платы с разрешением не менее 10 мкм. Поместите чистую 75-мм кремниевую пластину на спин-шерсть и вылейте около 1 мл СУ-8 на его центр. Включите вакуум, чтобы обеспечить для патрона. Для устройства А, спин-шерсть SU-8 2150 при 500 об/мин на 30 с, затем 30 с при 2750 об/мин. Для устройства B, спин-шерсть SU-8 2100 при 500 об/мин на 30 с, а затем 30 с при 2500 об/мин. Это даст СУ-8 слоев толщиной 200 мкм и 120 мкм, соответственно. Снимите вафу со спин-пальто и поместите на горячую панель при температуре 95 градусов по Цельсию в течение 60 минут, чтобы софтовать. Снимите вафу с плиты и дайте ей остыть до комнатной температуры. Поместите маску на верхней части пластины, и подвергать под коллиматором 190 мВт, 365 Нм УФ-светодиод в течение 2 мин. Поместите на hotplate набор на 95 градусов по Цельсию в течение 5 минут для послеэкспозиции выпечки. Снимите вафу и дайте ей остыть до комнатной температуры. Поместите вафу в ванну пропилена гликол монометил эфира ацетата (PGMEA) в течение 20 минут. Промыть с PGMEA следуют изопропанол. Если какой-либо непрозрачный остаток виден во время этого процесса, повторите промывки с PGMEA и изопропанола. Воздух высушить вафельу. Поместите вафельу на горячую плиту при 95 градусах по Цельсию в течение 3 мин. Снимите и поместите вафу в 90 мм диаметром Петри блюдо. Полидиметилсилоксан (PDMS) литья на Су-8 мастера Смешайте 10:1 массовое соотношение силиконовой базы к лечебного агента. Дега PDMS после смешивания около 30 мин. Налейте дегазированные PDMS на вершине СУ-8 мастер, по крайней мере 5 мм толщиной слой формируется на вершине пластины. Дега PDMS на вершине около 30 минут. Поместите вафельу в духовку 65 градусов по Цельсию, по крайней мере 80 минут, чтобы вылечить PDMS. Вырежьте вылеченную плиту PDMS из. Поместите плиту PDMS с микрофлюидными функциями, обращенными вверх, и пробить отверстия вдавлиии и розетки с 0,75 мм биопсии удар. Очистите 50 мм х 75 мм стеклянную горку с изопропанол и удалить всю пыль с микрофлюидных особенностей стороны плиты PDMS с лентой. Вынаньте очищенную стеклянную горку и плиту PDMS с микрофлюидными свойствами лицом до 100 Па (1 мбар O2)плазмы в течение 1 мин. Поместите плиту PDMS с функциями лицом вниз на стеклянную горку, чтобы обеспечить склеивание. Поместите слайд в духовке 65 градусов по Цельсию, по крайней мере 30 минут, чтобы завершить склеивание. Лечить все микрофлюидные каналы путем промывки с фторированной поверхностной жидкости для лечения. Выпекать устройство в духовке 65 градусов по Цельсию, по крайней мере 10 минут, чтобы испарять жидкость. 2. Инкапсуляция дрожжей в гидрогелях с помощью устройства А Возьмите дрожжи, растущие в культуре подвески и рассчитывайте на гемоситометр. Приостановить действие клеток в фосфатном буферном сольнике (PBS) до концентрации около 750 к/мл. Это гарантирует, что 30% гидрогелей будет иметь одну дрожжевую клетку в них. Только около половины дрожжевых клеток вырастают в колонии, что приводит к 15% гидрогелей, содержащих дрожжевые колонии. Смешайте ультраплохидную точку плавления агарозы на 2% ж / V в PBS и тепла при 90 градусов по Цельсию, пока не растаял. Это занимает 10 минут. Загрузите смесь агарозы в шприц с прикрепленным фильтром 0,22 мкм в шприц-насос перед космическим нагревателем, установленным до 80 градусов по Цельсию. Загрузите шприц, наполненный дрожжевой подвеской, и шприц, содержащий фторированное масло, с 2% ж/v ионным фторсурфактантом18 в шприц-насосы. Возьмите сплиттер капли копотока устройство, сделанное в разделе 1 и подключить трубки из шприцев в устройство. Руководство трубки из розетки в 15 мл конической трубки в ведро со льдом для сбора капель. Поток в трех решениях в устройство со следующими темпами потока: Поток дрожжевой подвески с скоростью потока 3 мл / ч. Поток агарозной смеси при скорости потока 3 мл/ч. Поток фторированного масла при скорости потока 15 мл/ч. Соберите около 1 мл эмульсии. Подождите еще 5 минут, чтобы агароуз полностью установить. 3. Ломать и мыть гель для культуры Добавить равный объем 20% перфтороктанола (PFO) в фторированном масле в эмульсию. Перевернуть коническую трубку несколько раз, чтобы обеспечить смешивание. Спин вниз сломанной эмульсии на 2000 х г в течение 2 мин. Гели будут гранулы над маслом и PFO фаз. Удалите фазу масла и добавьте 2 мл буфера TE-TW (10 мм Tris pH 8,0, 1 мМ EDTA, 0,01% Tween-20), чтобы повторно приостановить работу гелей. Перенесите подвеску в новую коническую трубку 15 мл. Пеллет вниз гели, как в шаге 3.2 и мыть еще раз в TE-TW в общей сложности два моет. Удалите супернатант и повторно ели в 2 мл носителей. Трансфер на культурную трубку 5 мл. Инкубировать при 30 градусах Цельсия всю ночь под тряской.ПРИМЕЧАНИЕ: После ночной инкубации, дрожжевые гидрогели могут храниться при 4 градусах Цельсия в течение нескольких дней. 4. Дрожжи колонии лиза Перенесите гели в коническую трубку 15 мл и гранулы гидрогели при 2000 х г в течение 2 мин. Вымойте гидрогели в PBS 2x. Вымойте в 1x сферопорный буфер 1x. Выполните 2-50x разбавления сфероперационного фермента в сферопентерный буфер и добавить 1 мл в гидрогели. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию на 1 ч. Обработанные дрожжи будут выглядеть более прозрачными(рисунок 3A). Возьмите дно 0,8 мл гидрогеля подвески и передачи в 1 мл uncapped шприц. Поместите шприц в держатель 3D печатного шприца(Дополнительный файл 3)и вращайтесь при 2000 х г в течение 2 мин. Это приведет к тому, что гидрогели закроют упаковку в головке шприца. 5. мРНК захват из лисизированных дрожжевых колоний с помощью устройства B Возьмите 240000 Drop-Seq бисера и передачи в 15 мл конической трубки. Пеллет Drop-Seq бусы, вращаясь вниз на 1000 х г в течение 1 мин. Удалите супернатант и resuspend бусинки в 2 мл 0,9x дрожжевой лисис буфер атакжем 500 мМ хлорид натрия для концентрации суспензии шарика 120000 шариков / мл. Перенесите подвеску из биса на 3 мл шприца с вставленной вареной. Приготовьте шприц, содержащий несколько миллилитров 2% w/v перфторополиететер-полиэтиленгликоль (PFPE-PEG) сурфактант в фторированном масле. Эвакуируйте всю ваковую головку шприца, содержащую плотную упаковку гидрогелей и крышку шприца. Вставьте гидрогель, подвеску бисины и масляные шприцы в шприц-насосы и подключитесь через трубку в инкапсуляционное устройство, выполненное в разделе 1. Соедините от розетки трубки в коническую трубку 50 мл на льду. Поток в трех решениях в устройство со следующими темпами потока: Поток гидрогелей на 0,4 мл/ч. Поток бисовой подвески на 0,4 мл / ч. Поток фторированного масла на 1,6 м/ч. Соберите 1 мл эмульсии или запустите устройство до тех пор, пока не останется гидрогелей. 6. генерация кДНК, секвенирование библиотечной подготовки и секвенирование Добавьте 30 мл 6x буфера SSC и 1 мл PFO к собранной эмульсии, как указано в протоколе Drop-Seq14. Продолжайте следовать протоколу Drop-Seq для генерации кДНК из мРНК, захваченной на бисере, последовательности подготовки библиотеки и анализа данных по секвенированию.

Representative Results

Мы адаптировали ранее опубликованный рабочий процесс Drop-Seq14 для секвенирования изогенной колонии (ICO-seq) для выполнения профилирования экспрессии генов изогенных дрожжевых колоний. Мы выделили одиночные дрожжевые клетки и инкапсулировали их в микрогели агарозы(рисунок 1A). После ночной инкубации микрогелей эти инкапсулированные дрожжевые клетки превратились в изогенные колонии. Перед загрузкой гелей во второе микрофлюидное устройство для улавливания мРНК, мы переварили стенку дрожжевых клеток, чтобы сделать мРНК более доступной(рисунок 1B,слева). Мы закрыли эти микрогели и объединили бисер мРНК и буфер лисиса. Некоторые капли содержали ровно одну бусовку в паре с лисиной дрожжевой колонией. Все шарики в эмульсии были собраны и cDNA синтезированы и секвенированы после протокола Drop-Seq. Мы создали изогенные дрожжевые колонии через однодрожжье клеток инкапсуляции в агарозе микрогели с помощью коэнкапсуляции микрофлюидного устройства с восемью падение сплиттер прилагается(Рисунок 2A). Мы разбавили входную дрожжевую подвеску до концентрации в 750 000 евро/мл, так что 30% микрогелей имеют ровно один дрожж. Перед вставкой ультранизкой температуры плавления агарозы в устройство, мы растворили его при повышенной температуре и поддерживали шприц при такой температуре, чтобы предотвратить преждевременное гелевание. На стыке с капельного поколения(рисунок 2B),дрожжевые клетки были первоначально инкапсулированы в 160 мкм капель. После сброса поколения соединения восемь раз сплиттер разделить эти капли на восемь 80 мкм капель(рисунок 2C). Шприц фильтр был прикреплен к расплавленной агарозы, чтобы предотвратить засорение от формирования в каналах, которые могут быть узкими, как 37 мкм во время падения расщепления. Мы собрали эмульсию на льду, которая сразу же начала процесс гелирования агарозы. Мы подсчитали, polydispersity типичной эмульсии, чтобы быть 6%(Дополнительный рисунок 1), хотя значения полидисперсности до 10% являются приемлемыми. После того, как агарозные гели набор, мы сломали эмульсии и удалить фазу масла. Гели были вымыты в водином буфере перед погружением в средствароста. Ночная инкубация микрогелей привела к тому, что изогенные колонии росли в пределах некоторых микрогелей(рисунок 2D). Процент гидрогелей, содержащих колонии не менее 20 клеток, зависит от культурных условий, включая время инкубации и состав средств массовой информации. В нашей демонстрации с использованием C. Albicans, мы определили, что около 15% гидрогелей содержали колонии после 20 ч культуры подвески. Второе устройство коэнкапсуляции извлекли мРНК из изогенных колоний(рисунок 3A). Перед загрузкой дрожжевых микрогелей в микрофлюидное устройство мы промыли и погрузили гели в раствор для переваривания стенок дрожжевых клеток. Правильное пищеварение дрожжевых клеток было проверено микроскопией, при этом обработанные дрожжи имели более отражающую морфологию(рисунок 3B). Мы закрыли-упакованные микрогели в шприц и настроены гель ввода потока так, что один гель был в каждой капле. Поток мРНК захвата бисера в буфере излияза смешивается с близко упакованы гель поток до падения решений соединения(рисунок 3C). Мы собрали полученную эмульсию из 160 капель мкм, и колонии начали лизировать и выпускать их клеточного содержимого. Мы загрузили бусины на ограничение разбавления, чтобы свести к минимуму количество капель, содержащих несколько бусин, но близко-упаковка гелей во время выпадения решений привело к около 10% собранных капель, содержащих один шарик с лисиной колонии (Рисунок 3D). Мы проанализировали экспрессию генов C. albicans, вида дрожжей, присутствующих в микрофлоре кишечника человека, используя рабочий процесс ICO-seq. C. Albicans известен своей способностью переключаться между двумя различными состояниями клеток, называется белым и непрозрачным19. Мы используем сконструированный штамм C альбиканов, штамм R’Y122, который заменяет одну копию гена WH11, только активный в белых клетках с YFP20. Мы получили набор профилей экспрессии генов, используя рабочий процесс, и использовали их для анализа колоний, выражающих не менее 300 уникальных генов. В качестве справочного набора данных мы использовали данные экспрессии C. Albicans, полученные в ходе ранее опубликованного исследования17, и отфильтровали колонии, выражающие менее 600 уникальных генов. После выполнения основного компонента (PC) анализа и t-stochastic соседвик встраивания (tSNE) снижение размерности21, мы обнаружили общее соответствие между нашим набором данных образца и ссылки (Рисунок 4A). Анализ ПК показал, что YFP и WH11 внесли значительный вклад в первые два ПК. Кроме того, анализ tSNE выявил три кластера(рисунок 4B). В то время как кластер 2 состоял преимущественно из ячеек из набора выборочных данных, кластеры 0 и 1 состояли из ячеек из обоих образцов. Накладывая выражение WH11 на tSNE(Рисунок 4C, верхняя панель), мы определили, что кластер 1, вероятно, содержал белые колонии. Мы также обнаружили, что выражение STF2 увеличилось в кластере 1(Рисунок 4C, нижняя панель), в соответствии с ранее полученными данными17. В кластерах 0 и 2, WH11 и STF2 были значительно downregulated по сравнению с кластером 1(рисунок 4D). Гены, участвующие в брожении, такие как ADH1, были upregulated в кластере 0, в соответствии с предыдущими исследованиями непрозрачных клеток22. Мы обнаружили, что в колониях в кластере 2 уменьшилась рибосомная РНК по сравнению с колониями в кластерах 0 и 1. Хотя образцы и наборы справочных данных были получены с использованием того же запаса клеток, этот результат позволяет предположить, что даже тонкие различия в экспериментальной обработке могут повлиять на экспрессию генов. Рисунок 1: Обзор рабочего процесса ICO-seq. (A) Дрожжи, растущие в культуре подвески, были разбавлены в буфере и сокапсулированы с расплавленной агарозой в устройстве генератора капельного потока, чтобы обеспечить загрузку Пуассона микрогелей агарозы с одноъюсными дрожжевыми клетками. Гели устанавливаются, когда агарозохлажда охлаждается, масляная/водная подвеска была сломана, и масло было удалено, что привело к подвешиванию гелевого шарика в воде. После ночной культуры, дрожжевые клетки выросли в изогенные колонии в микрогели. (B) Колонии были подвергнуты буферу деградации стены клетки, после чего они были close-packed и coencapsulated с шариками захвата mRNA в втором microfluidic приспособлении. Близкая упаковка микрогелей обеспечила каждую каплю по одному гелю, в то время как загрузка пуассонов бисером уменьшила вероятность нескольких бусин в течение одной капли. Собранные капли обрабатывались для синтеза кДНК и генерации библиотеки секвенирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 2: Поколение изогенных дрожжевых колоний в микрогелях агарозы с помощью устройства А. (A) Схема микрофлюидного устройства, показывающая расположение трех входных и выходных портов. Соединение, выделяемый на выпадение, выделено красным цветом. (B) Крупный размер сброса соединения во время нормальной работы устройства. (C) Микрограф собранных капель, с крупным планом капли, содержащей инкапсулированные ячейки (всет). (D) Микрограф изогенных колоний дрожжей в микрогелях агарозы после 24-часовой инкубации, с крупным планом двух колоний (всет). Все бары масштаба 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 3: Лисис и мРНК захват из изогенных колоний с помощью устройства B. (A) Схема микрофлюидного устройства, показывающая расположение трех входных и выходных портов. Соединение, выделяемый на выпадение, выделено красным цветом. (B) Микрограф дрожжевых колоний после пищеварения клеточной стенки, с крупным планом одной колонии (всет). (C) Крупный сбой сброса соединения во время нормальной работы устройства. (D) Микрограф собранных эмульсий после спаривания микрогеля и биса, с крупным планом, показывающим каплю с бисом и лисированной колонией (вставкой). Все бары масштаба 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 4: Анализ бело-непрозрачной реакции переключения в C. albicans. (A) tSNE участок набора выборок данных в сочетании с набором справочных данных от Лю17. (B) Кластеризация транскриптомов показывает три кластера, визуализированные на участке tSNE. (C) Ключевые гены, участвующие в бело-непрозрачной реакции коммутации способствовали изменению, как это определено с помощью анализа основных компонентов. (D) Скрипичные сюжеты нормализованных уровней выражения YFP и WH11 кластерами, отмеченными на участке tSNE. Указывает на p lt; lt; 0.05 и q указывает на p lt; 0.05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Дополнительные цифры 1 и 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эти filgures. Дополнительные файлы 1-3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эти файлы.

Discussion

Наш метод для изогенной дрожжевой колонии РНК секвенирования (ICO-seq) адаптирует опубликованную одноклеточную платформу секвенирования РНК, Drop-Seq, для высокой пропускной способности скрининга инженерных штаммов дрожжей. Дрожжевые клетки содержат менее 10% копий мРНК типичной клетки млекопитающих и имеют клеточную стенку, которая должна быть деградирована до улавливания мРНК16. Эти два фактора исключают прямое применение дрожжей к Drop-Seq или другим платформам на основе капель на основе scRNA-seq. Для решения этих проблем, мы инкапсулировать одиночные клетки в гидрогелях и вырастить их в колонии, чтобы обеспечить достаточное количество входных материалов для секвенирования РНК и перевариваем стенку дрожжевых клеток для генерации сферопластов до лизиса и мРНК захвата. Эти изменения добавляют дополнительную сложность в рабочий процесс ICO-seq по сравнению с исходным рабочим процессом Drop-Seq и являются критическими шагами, которые пользователи должны обеспечить бесперебойную работу.

Правильная работа устройства А необходима для инкапсуляции одиночных дрожжевых клеток в гидрогелях агарозы. Правильный подсчет входных дрожжей суспензии должны следовать, чтобы свести к минимуму количество гидрогелей с более чем одной дрожжевой клетки, обеспечивая при этом, что достаточно гидрогелей содержат одну ячейку, чтобы обеспечить разумную эффективность захвата клеток во время улавливания мРНК. Во время работы микрофлюидного устройства смесь агарозного геля должна быть хорошо растворена и проходить через фильтр шприца, чтобы свести к минимуму вероятность засорения устройства. Смесь геля агарозы вязкая и область, в которой один канал распадается на восемь, особенно подвержена засорению. Центрируя высокоскоростную камеру для визуализации работы устройства в этой области устройства, пользователи могут контролировать единообразие капель, возникающих из каждого из восьми каналов, и быстро реагировать, если единообразие меняется из-за засорителей в любом из каналов. Осмотр небольшого количества собранной эмульсии под микроскопом обеспечивает вторичный метод подтверждения качественной эмульсии.

После роста дрожжевых колоний в гидрогелях, для обеспечения качественной добычи мРНК на уровне одной колонии необходимы некоторые меры предосторожности. Важно оптимизировать время дрожжей в культуре гидрогеля, потому что если дрожжи остаются в культуре слишком долго, многие избегут пределов гидрогелей, что приводит к более высокому фоновому сигналу во время секвенирования РНК и более низкой чувствительности при дискриминации между типами клеток. Правильное генерирующее сферопласты с использованием зимолязы гарантирует, что мРНК будет выпущена после воздействия клеточного буфера на лисис. Визуальный осмотр дрожжевых колоний после зимолязы должен дать блестящие дрожжевые клетки. Неправильное пищеварение клеточной стенки приведет к снижению эффективности захвата РНК. Наконец, гидрогели должны быть плотно упакованы, поскольку они вводятся в устройство B. Мониторинг ввода гидрогеля с помощью высокоскоростной камеры позволит прекратить сбор эмульсии, как только гидрогели больше не будут упакованы при входе в устройство, в противном случае эффективность захвата будет затронута.

Потенциальная проблема с нашим методом является то, что микрогель культуры дрожжей может значительно изменить экспрессию генов. Предыдущая работа исследования экспрессии дрожжей в микрогелях и на агаре демонстрируют различия в средних показателях экспрессии генов, но в целом положительная корреляция17, хотя дальнейшее исследование этого утверждения о различных штаммов дрожжей является разумным. Метод также имеет ограниченную эффективность захвата ячейки из-за стохастической загрузки мРНК захвата бисера после статистики Пуассон14. В настоящее время около 10% капель содержат бусинку и колонию, а скорость двойной инкапсуляции, как ожидается, будет ниже 1%. Двойные инкапсуляции приводят к путанице элементов во время анализа данных РНК-сек и их фильтрации остается сложной23; коэффициент улавливания 25% приведет к соответствующему увеличению двойных инкапсуляций до 5%(Дополнительная цифра 2). Хотя мы демонстрируем ICO-seq с помощью платформы Drop-Seq, есть и другие платформы RNA-seq, которые вводят шарики захвата мРНК детерминированно, а не статистически, такие как коммерчески доступная платформа 10x Genomics Chromium15,24. Интеграция этих платформ с ICO-seq может повысить эффективность сбора сверх того, что позволяет статистика Пуассона. Наконец, основным ограничением капли РНК-сек является неспособность восстановить клетки интереса после секвенирования. Это ограничение следует принимать во внимание при рассмотрении типов дрожжевых библиотек для анализа с помощью этого метода.

Неоднородность клеток к клетке была продемонстрирована на клональном уровне для микробов, таких как E. coli25 и S. cerevisiae26 выявление новых клеток утверждает, что анализ навалом уровня в противном случае маскировки. Массовые анализы РНК-сек, выполненные на C. albicans, как правило, либо смотреть на населения всей транскриптом изменения, или белые и непрозрачные клетки, как две отдельные популяции27,28. Применение ICO-seq может привести к открытию дополнительных подсостоянии и обеспечить аналитическую основу для открытия новых клеточных состояний в других видах дрожжей. Тем не менее, рост клеток в гидрогелях не ограничивается дрожжами: другие типы клеток, такие как млекопитающие, бактериальные и другие грибковые клетки также могут быть культивированы в гидрогелях29,30. Секвенирование изогенных колоний по сравнению с одиночными клетками приводит к усреднению биологического шума из-за изменения клеток в клетки, улучшая дискриминацию между типами клеток. Это может помочь при анализе клеток, где генетическое разнообразие центров на конкретных путей синтеза. Расширенные возможности ввода типа клеток в ICO-seq и его потенциальная интеграция с коммерчески доступными платформами RNA-seq позиционируют ICO-seq как перспективную платформу для вскрытия клеточной неоднородности на генетическом уровне.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Этот проект был поддержан Национальным научным фондом Карьера премии DBI-1253293, Национальные институты здравоохранения Новый новатор премии DP2AR068129 и грант R01HG008978, Национальный научный фонд Технологический центр грант DBI-1548297, и UCSF Центр сотовая конструкция. ARA и «JG являются Чан-Цукерберг Biohub следователей.

Materials

0.22 um syringe filter Milipore Sigma SLGP033RS
0.5M EDTA, pH 8.0 Thermo-Fisher 15575020 Used to make TE-TW buffer
0.75 mm biopsy punch World Precision Instruments 504529
1 mL syringes BD 309628
1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO) Sigma-Aldrich 370533
1M Tris-HCI, pH 8.0 Thermo-Fisher 15568025 Used to make TE-TW buffer
27 gauge needles BD 305109
3 mL syringes BD 309657
3" silicon wafers, P type, virgin test grade University Wafers 447
3D-printed centrifuge syringe holder (custom) (custom) See Supplemental Files for 3D print file
Agarose, low gelling temperature Sigma-Aldrich a9414
Aquapel (hydrophobic glass treatment) Pittsburgh Glass Works 47100
Drop-Seq Beads ChemGenes MACOSKO-2011-10
Glass microscope slides (75 mm x 50 mm) Corning 294775X50
Ionic Krytox Surfactant Synthesis instructions in ref 14. Can substitute with PEG-PFPE surfactant.
Isopropanol Sigma-Aldrich 109827
NaCl Sigma-Aldrich S9888
Novec 7500 3M 98-0212-2928-5 Commonly knowns as HFE 7500
PBS Fisher Scientific BP243820
PE-2 polyethylene tubing Scientific Commodities B31695-PE/2
PEG-PFPE surfactant Ran Biotechnologies 008-FluoroSurfactant
PGMEA developer Sigma-Aldrich 484431
Photomasks CadArt Servcies (custom) See Supplemental Files for mask designs
Spin coater Specialty Coating Systems G3P-8
SSC Buffer Sigma-Aldrich S6639
SU-8 2100 MicroChem Y111075
SU-8 2150 MicroChem Y111077
Sylgard 184 silicone elastomer kit Krayden 4019862
Tween-20 Sigma-Aldrich P1379 Used to make TE-TW buffer
YR Digestion buffer Zymo Research R1001-1 Spheroplasting buffer
YR Lysis Buffer Zymo Research R1001-2
Zymolyase Zymo Research E1005 Spheroplasting enzyme mixture
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Peralta-Yahya, P. P., Zhang, F., Del Cardayre, S. B., Keasling, J. D. Microbial engineering for the production of advanced biofuels. Nature. 488 (7411), 320-328 (2012).
  2. Curran, K. A., Alper, H. S. Expanding the chemical palate of cells by combining systems biology and metabolic engineering. Metabolic Engineering. 14 (4), 289-297 (2012).
  3. Botstein, D., Chervitz, S. A., Cherry, J. M. Yeast as a model organism. Science. 277 (5330), 1259-1260 (1997).
  4. Mager, W. H., Winderickx, J. Yeast as a model for medical and medicinal research. Trends in Pharmacological Sciences. 26 (5), 265-273 (2005).
  5. Krivoruchko, A., Siewers, V., Nielsen, J. Opportunities for yeast metabolic engineering: Lessons from synthetic biology. Biotechnology Journal. 6 (3), 262-276 (2011).
  6. Vanella, R., et al. Yeast-based assays for screening 11β-HSD1 inhibitors. Microbial Cell Factories. 15 (1), (2016).
  7. Zhuang, X., Chappell, J. Building terpene production platforms in yeast. Biotechnology and Bioengineering. 112 (9), 1854-1864 (2015).
  8. Agresti, J. J., et al. Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (9), 4004-4009 (2010).
  9. Wang, G., et al. RNAi expression tuning, microfluidic screening, and genome recombineering for improved protein production in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (19), 9324-9332 (2019).
  10. Beneyton, T., et al. Droplet-based microfluidic high-throughput screening of heterologous enzymes secreted by the yeast Yarrowia lipolytica. Microbial Cell Factories. 16 (1), 18 (2017).
  11. Sjostrom, S. L., et al. High-throughput screening for industrial enzyme production hosts by droplet microfluidics. Lab on a Chip. 14 (4), 806-813 (2014).
  12. Nadal-Ribelles, M., et al. Sensitive high-throughput single-cell RNA-seq reveals within-clonal transcript correlations in yeast populations. Nature Microbiology. 4 (4), 683-692 (2019).
  13. Gasch, A. P., et al. Single-cell RNA sequencing reveals intrinsic and extrinsic regulatory heterogeneity in yeast responding to stress. PLoS Biology. 15 (12), 2004050 (2017).
  14. Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  15. Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
  16. von der Haar, T. A quantitative estimation of the global translational activity in logarithmically growing yeast cells. BMC Systems Biology. 2, 87 (2008).
  17. Liu, L., Dalal, C. K., Heineike, B. M., Abate, A. R. High throughput gene expression profiling of yeast colonies with microgel-culture Drop-seq. Lab on a Chip. 19 (10), 1838-1849 (2019).
  18. Fallah-Araghi, A., Baret, J. C., Ryckelynck, M., Griffiths, A. D. A completely in vitro ultrahigh-throughput droplet-based microfluidic screening system for protein engineering and directed evolution. Lab on a Chip. 12 (5), 882-891 (2012).
  19. Berman, J., Sudbery, P. E. Candida albicans: A molecular revolution built on lessons from budding yeast. Nature Reviews Genetics. 3 (12), 918-930 (2002).
  20. Srikantha, T., Soll, D. R. A white-specific gene in the white-opaque switching system of Candida albicans. Gene. 131 (1), 53-60 (1993).
  21. van der Maaten, L., Hinton, G. Visualizing data using t-SNE. Journal of Machine Learning Research. 9, 2579-2605 (2008).
  22. Sun, Y., et al. Deletion of a yci1 domain protein of Candida albicans allows homothallic mating in MTL heterozygous cells. mBio. 7 (2), 00465-00516 (2016).
  23. McGinnis, C. S., Murrow, L. M., Gartner, Z. J. DoubletFinder: Doublet Detection in Single-Cell RNA Sequencing Data Using Artificial Nearest Neighbors. Cell Systems. 8 (4), 329-337 (2019).
  24. Baran-Gale, J., Chandra, T., Kirschner, K. Experimental design for single-cell RNA sequencing. Briefings in Functional Genomics. 17 (4), 233-239 (2018).
  25. Silander, O. K., et al. A Genome-Wide Analysis of Promoter-Mediated Phenotypic Noise in Escherichia coli. PLoS Genetics. 8 (1), 1002443 (2012).
  26. Newman, J. R. S., et al. Single-cell proteomic analysis of S. cerevisiae reveals the architecture of biological noise. Nature. 441 (7095), 840-846 (2006).
  27. Tuch, B. B., et al. The Transcriptomes of Two Heritable Cell Types Illuminate the Circuit Governing Their Differentiation. PLoS Genetics. 6 (8), 1001070 (2010).
  28. Romo, J. A., et al. Global Transcriptomic Analysis of the Candida albicans Response to Treatment with a Novel Inhibitor of Filamentation. mSphere. 4 (5), 00620 (2019).
  29. Huang, H., et al. Generation and manipulation of hydrogel microcapsules by droplet-based microfluidics for mammalian cell culture. Lab on a Chip. 17 (11), 1913-1932 (2017).
  30. Lin, X., Nishio, K., Konno, T., Ishihara, K. The effect of the encapsulation of bacteria in redox phospholipid polymer hydrogels on electron transfer efficiency in living cell-based devices. Biomaterials. 33 (33), 8221-8227 (2012).

Tags

High ThroughputYeast StrainPhenotypingDroplet-based RNA SequencingICO-seqMicrobesGenome-wideEngineered MicrobesAgarosePBSSyringe PumpFluorinated OilFluorosurfactantEmulsionPerfluoro-octanolTet(W) BufferYeast Culture MediumHydrogelsSpheroplasting

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Zhang, J. Q., Chang, K., Liu, L., Gartner, Z. J., Abate, A. R. High Throughput Yeast Strain Phenotyping with Droplet-Based RNA Sequencing. J. Vis. Exp. (159), e61014, doi:10.3791/61014 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image