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Bioengineering

Hefestamm-Phänotypisierung mit Droplet-basierter RNA-Sequenzierung mit hohem Durchsatz

Published: May 21, 2020
doi:
10.3791/61014
, , , ,
1Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences,University of California San Francisco, 2University of California Berkeley-UCSF Graduate Program in Bioengineering,University of California San Francisco, 3Department of Pharmaceutical Chemistry,University of California San Francisco, 4California Institute for Quantitative Biosciences,University of California San Francisco, 5Chan Zuckerberg Biohub

Summary

Ein Engpass im “Design-Build-Test”-Zyklus der mikrobiellen Technik ist die Geschwindigkeit, mit der wir funktionale Bildschirme von Stämmen durchführen können. Wir beschreiben eine Methode mit hohem Durchsatz für das Dehnungsscreening, die auf Hunderte bis Tausende von Hefezellen pro Experiment angewendet wird, die tropfenbasierte RNA-Sequenzierung verwendet.

Abstract

Die leistungsstarken Werkzeuge, die zur Bearbeitung von Hefegenomen zur Verfügung stehen, haben diese Mikrobe zu einer wertvollen Plattform für die Technik gemacht. Während es nun möglich ist, Bibliotheken von Millionen genetisch unterschiedlicher Stämme zu konstruieren, bleibt das Screening auf einen gewünschten Phänotyp ein erhebliches Hindernis. Bei bestehenden Screening-Techniken gibt es einen Kompromiss zwischen Informationsausgabe und Durchsatz, wobei ein Screening mit hohem Durchsatz in der Regel für ein Produkt von Interesse durchgeführt wird. Daher stellen wir einen Ansatz zur Beschleunigung des Dehnungsscreenings vor, indem wir die sequenziumierende sequenziierende rna-Sequenzierung einzelner Zellen an isogene Picoliter-Kolonien gentechnisch veränderter Hefestämme anpassen. Um die einzigartigen Herausforderungen der RNA-Sequenzierung an Hefezellen anzugehen, kultiieren wir isogene Hefekolonien innerhalb von Hydrogelen und Spheroplasten, bevor wir die RNA-Sequenzierung durchführen. Die RNA-Sequenzierungsdaten können verwendet werden, um Hefe-Phänotypen abzuleiten und technische Pfade zu sortieren. Die Skalierbarkeit unserer Methode behebt ein kritisches Hindernis in der mikrobiellen Technik.

Introduction

Ein primäres Ziel der mikrobiellen Technik ist es, Mikroben zu modifizieren, um sie zu induzieren, wertvolle Verbindungen zu produzieren1,2. S. cerevisiae war der primäre Organismus für mikrobielle Technik aufgrund seiner Leichtigkeit der Kultur und die Breite der Werkzeuge für die Entwicklung seines Genoms3,4,5. Eine Hürde bleibt jedoch bei der Durchführung funktionaler Bildschirme auf der modifizierten Hefe: Der Screening-Durchsatz hinkt der Genom-Engineering um Größenordnungen hinterher. Beim Screening werden in der Regel Stämme in Mikrobrunnenplatten isoliert und durch Messung der Produktion einer bestimmten Verbindung6,7. Der Durchsatz dieses Prozesses wird durch die großen Mengen an Reagenz begrenzt, die für die Assaying einzelner Stämme in hundert Mikroliter-Reaktionen benötigt werden. Tröpfchen-Mikrofluidik bietet eine attraktive Lösung, um den Durchsatz des Hefe-Screenings um Größenordnungen zu erhöhen, indem Reaktionen, die normalerweise in Wellplatten durchgeführt werden, herunterskaliert werden8. Wie bei Well-Platten-Bildschirmen erkennen Tröpfchensiebe jedoch in der Regel einzelne Produktverbindungen, was begrenzte Informationen über die globale Funktion des technischen Weges9,,10,11liefert.

Die RNA-Sequenzierung (RNA-seq) kann eine umfassendere Charakterisierung der Signalwegoperation ermöglichen, indem expressionsniveaus aller relevanten Gene gleichzeitig bewertet werden können12,13. Darüber hinaus ermöglichen Tröpfchenmethoden das Profilieren von Tausenden von Zellen pro Experiment, wodurch der für das Screenieren von Bibliotheken der entwickelten Varianten14,15erforderliche Durchsatz erforderlich ist. RNA-Seq-Methoden sind jedoch für Säugetierzellen optimiert; Im Vergleich dazu haben Hefe weniger mRNA pro Zelle und eine Zellwand, die schwer zu entfernen ist16, was ihre Sequenzierung durch bestehende Methoden ausschließt. Wenn eine Tröpfchenmethode mit hohem Durchsatz entwickelt werden könnte, um Hefe-RNA-seq zu aktivieren, würde sie eine skalierbare, kostengünstige und informationsreiche Phänotypisierungsplattform für Hefe-Engineering bieten.

Wir präsentieren ein detailliertes Protokoll unserer kürzlich entwickelten Methode zur Sequenzierung von Hefezellen mit Hochdurchsatz-Tröpfchen-Mikrofluidik17. Um die Herausforderung der begrenzten RNA zu meistern, kapseln und kultikulieren wir einzelne Hefezellen in Pikoliter-Hydrogelkugeln. Kultur dupliziert die Zellen und ergibt Hunderte von Kopien, die denselben technischen Pfad gemeinsam nutzen; Dies reduziert die Variation aufgrund der einzelzelligen Genexpression und erhöht gleichzeitig die für die Sequenzierung verfügbare RNA-Menge signifikant. Nach der kulturbasierten Verstärkung sphärieren wir die Zellen und entfernen die Zellwand mittels massenhafter enzymatischer Verdauung. Zellmembranen bleiben intakt, so dass jede isogene Kolonie und die zugehörige mRNA in ihren Hydrogelkugeln verkapselt bleiben. Dies ermöglicht es uns, die einzelnen Kolonien mit mRNA-Capture-Reagenzien und Lysepuffer zu koppeln, und die mRNA wird nach dem Drop-Seq-Workflow14erfasst, mit Barcodes und Sequenziert. Unsere Methode ermöglicht transkriptom-weites Screening von Tausenden von isogenen Hefekolonien pro Experiment.

Protocol

1. Mikrofluidische Gerätefertigung SU-8 Master Fertigung Entwerfen Sie die Negativmaske für die mikrofluidischen Kanäle für Gerät A und B (Zusatzdatei 1 und 2) mit computerunterstützter Designsoftware und lassen Sie sie auf Leiterplattenfolie mit mindestens 10 m Auflösung drucken. Legen Sie einen sauberen 75 mm Siliziumwafer auf einen Spincoater und gießen Sie ca. 1 ml SU-8 auf die Mitte. Schalten Sie das Vakuum ein, um den Wafer am Spannfutter zu befestigung. Für Gerät A, Spin Coat SU-8 2150 bei 500 U/min für 30 s, gefolgt von 30 s bei 2.750 U/min. Für Gerät B, Spin-Coat SU-8 2100 bei 500 U/min für 30 s, gefolgt von 30 s bei 2.500 U/min. Dies ergibt SU-8-Schichten mit einer Dicke von 200 m bzw. 120 m. Den Wafer aus dem Spincoater nehmen und bei 95 °C 60 min auf eine Kochplatte legen, um weich zu backen. Entfernen Sie den Wafer von der Kochplatte und lassen Sie ihn auf Raumtemperatur abkühlen. Legen Sie die Maske auf den Wafer, und setzen Sie unter einem Kollimator 190 mW, 365 nm UV-LED für 2 min. Legen Sie den Wafer auf eine Kochplatte bei 95 °C für 5 min für postexposure Backen. Entfernen Sie den Wafer und lassen Sie ihn auf Raumtemperatur abkühlen. Legen Sie den Wafer 20 min lang in ein Bad aus Propylenglykolmonomethyletheracetat (PGMEA). Spülen Sie den Wafer mit PGMEA gefolgt von Isopropanol. Wenn während dieses Vorgangs undurchsichtige Rückstände sichtbar sind, wiederholen Sie die Spülung mit PGMEA und Isopropanol. Den Wafer an der Luft trocknen. Legen Sie den Wafer bei 95 °C für 3 min auf eine Kochplatte. Entfernen und legen Sie den Wafer in eine Petrischale mit 90 mm Durchmesser. Polydimethylsiloxan (PDMS) Guss auf SU-8 Master Mischen Sie ein 10:1-Massenverhältnis von Silikonbasis zu Härtungsmittel. Entgasen Sie das PDMS nach etwa 30 min Mischen. Gießen Sie entgastes PDMS auf die Oberseite des SU-8 Masters, bis sich mindestens eine 5 mm dicke Schicht auf dem Wafer bildet. Entgasen Sie das PDMS auf dem Wafer für ca. 30 min. Legen Sie den Wafer mindestens 80 min in einen 65 °C-Ofen, um das PDMS auszuhärten. Schneiden Sie die ausgehärtete PDMS-Platte aus dem Wafer aus. Platzieren Sie die PDMS-Platte mit den mikrofluidischen Merkmalen nach oben und Stanzlöcher mit einem 0,75 mm Biopsie-Punch. Reinigen Sie einen 50 mm x 75 mm Glasschlitten mit Isopropanol und entfernen Sie den staubischen Staub von der mikrofluidischen Seitenseite der PDMS-Platte mit Klebeband. Setzen Sie den gereinigten Glasschlitten und die PDMS-Platte mit den mikrofluidischen Merkmalen 1min. bis zu 100 Pa (1 mbar O2) Plasma aus. Legen Sie die PDMS-Platte mit den Features nach unten auf die Glasrutsche, um eine Verklebung zu ermöglichen. Legen Sie die Rutsche mindestens 30 min in einen 65 °C-Ofen, um die Verklebung abzuschließen. Behandeln Sie alle mikrofluidischen Kanäle durch Spülen mit einer fluorierten Oberflächenbehandlungsflüssigkeit. Backen Sie das Gerät in einem 65 °C-Ofen für mindestens 10 min, um die Flüssigkeit zu verdampfen. 2. Hefeverkapselung in Hydrogelen mit Gerät A Nehmen Sie Hefe in einer Suspensionskultur und zählen Sie auf ein Hämozytometer. Setzen Sie die Zellen in phosphatgepufferter Saline (PBS) auf eine Konzentration von etwa 750 k/ml aus. Dadurch wird sichergestellt, dass 30% der Hydrogele eine Hefezelle in sich haben. Nur etwa die Hälfte der Hefezellen wachsen zu Kolonien, was zu 15 % der Hydrogele führt, die Hefekolonien enthalten. Ultralow Schmelzpunkt Agarose bei 2% w/v in PBS mischen und bei 90 °C erhitzen, bis es geschmolzen ist. Dies dauert ca. 10 min. Die Agarose-Mischung in eine Spritze mit angeschlossenem 0,22-mm-Filter in eine Spritzenpumpe vor der auf 80 °C eingestellten Raumheizung geben. Laden Sie eine mit der Hefesuspension gefüllte Spritze und eine Spritze mit fluoriertem Öl mit 2% w/v ionischem Fluorsursidan18 in Spritzenpumpen. Nehmen Sie das Coflow-Tropfen-Splittergerät aus Abschnitt 1 und schließen Sie die Schläuche von den Spritzen an das Gerät an. Führen Sie die Schläuche aus dem Auslass in ein 15 ml kegelförmiges Rohr in einem Eiskübel für die Tropfensammlung. Fließen Sie in den drei Lösungen in das Gerät mit den folgenden Durchflussraten: Durchfließen Sie die Hefesuspension mit der Durchflussrate von 3 ml/h. Durchfluss des Agarose-Gemisches bei einer Durchflussrate von 3 ml/h. Das fluorierte Öl mit einer Durchflussrate von 15 ml/h durchfließen. Sammeln Sie ca. 1 ml Emulsion. Warten Sie weitere 5 min, damit die Agarose vollständig eingestellt werden kann. 3. Breaking und Waschgel für Kultur Fügen Sie der Emulsion ein gleiches Volumen von 20 % Perfluoroctanol (PFO) in fluoriertem Öl hinzu. Invertieren Sie das konische Rohr ein paar Mal, um die Mischung zu ermöglichen. Drehen Sie die gebrochene Emulsion bei 2.000 x g für 2 min. Die Gele werden über die Öl- und PFO-Phasen pellet. Entfernen Sie die Ölphase und fügen Sie 2 ml TE-TW-Puffer (10 mM Tris pH = 8,0, 1 mM EDTA, 0,01% Tween-20) hinzu, um die Gele wieder auszusetzen. Übertragen Sie die Suspension in ein neues 15 ml konisches Rohr. Pellet die Gele wie in Schritt 3.2 und waschen Sie ein anderes Mal in TE-TW für insgesamt zwei Wäschen. Überstand entfernen und Gele in 2 ml Medien resuspendieren. Transfer in eine 5 ml Kulturröhre. Bei 30 °C über Nacht unter Schütteln inkubieren.HINWEIS: Nach der nächtlichen Inkubation können Hefehydrogele mehrere Tage bei 4 °C gehalten werden. 4. Hefekolonie Lyse Übertragen Sie Gele auf ein 15 ml konisches Rohr und Pellethydrogele bei 2.000 x g für 2 min. Hydrogele in PBS 2x waschen. 1x spheroplasting Puffer 1x waschen. Führen Sie eine 2-50-fache Verdünnung des spheroplasting Enzyms im spheroplasting Puffer durch und fügen Sie den Hydrogelen 1 ml hinzu. Bei 37 °C für 1 h inkubieren. Die behandelte Hefe sieht transparenter aus (Abbildung 3A). Nehmen Sie die untere 0,8 ml Hydrogelsuspension und geben Sie sie in eine 1 ml ungekapselte Spritze. Legen Sie die Spritze in den 3D-gedruckten Spritzenhalter(Ergänzungsdatei 3) und drehen Sie 2 min bei 2.000 x g. Dies führt dazu, dass die Hydrogele die Packung im Spritzenkopf schließen. 5. mRNA-Erfassung aus lysierten Hefekolonien mit Gerät B Nehmen Sie 240.000 Drop-Seq Perlen und transferieren Sie in eine 15 ml konische Röhre. Pellet Drop-Seq Perlen durch Spinnen bei 1.000 x g für 1 min. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie Perlen in 2 ml 0,9x Hefelysepuffer mit 500 mM Natriumchlorid für eine Perlensuspensionskonzentration von 120.000 Perlen/ml. Übertragen Sie die Perlensuspension in eine 3 ml Spritze mit eingelegtem Rührstab. Bereiten Sie eine Spritze mit mehreren Millilitern von 2% w/v Perfluoropolyether-Polyethylenglycol (PFPE-PEG) Tensid in fluoriertem Öl vor. Evakuieren Sie den gesamten wässrigen Kopf der Spritze, der eng gepackte Hydrogele enthält, und verschließen Sie die Spritze. Hydrogel, Perlensuspension und Ölspritzen in Spritzenpumpen einlegen und über Schläuche in die Verkapselungsvorrichtung aus Abschnitt 1 anschließen. Verbinden Sie sich vom Auslassschlauch in ein 50 ml kegelförmiges Rohr auf Eis. Fließen Sie in den drei Lösungen in das Gerät mit den folgenden Durchflussraten: Durchfließen Der Hydrogel mit 0,4 ml/h. Durchfluss der Perlenaufhängung bei 0,4 ml/h. Das fluorierte Öl mit 1,6 ml/h fließen. Sammeln Sie 1 ml Emulsion oder führen Sie das Gerät aus, bis keine Hydrogele mehr vorhanden sind. 6. cDNA-Generierung, Sequenzierung der Bibliothek und Sequenzierung Fügen Sie der gesammelten Emulsion 30 ml 6x SSC-Puffer und 1 ml PFO hinzu, wie im Drop-Seq-Protokoll14angegeben. Folgen Sie weiterhin dem Drop-Seq-Protokoll, um cDNA aus mRNA zu generieren, die auf Perlen erfasst wurde, die Vorbereitung der Bibliothek sequenzieren und die Datenanalyse sequenzieren.

Representative Results

Wir haben den zuvor veröffentlichten Drop-Seq-Workflow14 für die isogene Koloniesequenzierung (ICO-seq) angepasst, um Genexpressionsprofile von isogenen Hefekolonien durchzuführen. Wir isolierten einzelne Hefezellen und kapselten sie in Agarose-Mikrogele (Abbildung 1A). Nach der nächtlichen Inkubation von Mikrogelen wuchsen diese verkapselten Hefezellen zu isogenen Kolonien heran. Bevor wir Gele in ein zweites mikrofluidisches Gerät für die mRNA-Aufnahme luden, verdauten wir die Hefezellwand, um die mRNA zugänglicher zu machen(Abbildung 1B, links). Wir haben diese Mikrogele dicht gepackt und die mRNA-Capture-Perlen und lysepuffer zusammengeführt. Einige Tröpfchen enthielten genau eine Perle, gepaart mit einer lysierten Hefekolonie. Alle Perlen in der Emulsion wurden gesammelt und die cDNA nach dem Drop-Seq-Protokoll synthetisiert und sequenziert. Wir erzeugten isogene Hefekolonien durch einzelne Hefezellverkapselung in Agarose-Mikrogels mit einem Coencapsulationsmikrofluid-Gerät mit einem acht Tropfen-Splitter (Abbildung 2A). Wir haben die Eingangshefesuspension auf eine Konzentration von 750.000 USD/ml verdünnt, so dass 30 % der Mikrogele genau eine Hefe in sich haben. Bevor wir die ultraniedrige Schmelztemperatur Agarose in das Gerät einfügten, lösten wir sie bei einer erhöhten Temperatur auf und hielten die Spritze bei dieser Temperatur, um eine vorzeitige Gelation zu verhindern. An der Tropfengenerierungskreuzung (Abbildung 2B)wurden Hefezellen zunächst in Tröpfchen von 160 m eingekapselt. Nach der Drop-Generation-Kreuzung teilte ein achtfacher Splitter diese Tröpfchen in acht 80-m-Tröpfchen(Abbildung 2C). An der geschmolzenen Agarose wurde ein Spritzenfilter angebracht, um zu verhindern, dass sich in den Kanälen Clogs bilden, die während der Tropfenspaltung bis zu 37 m schmal sein können. Wir sammelten die Emulsion auf Eis, was sofort den Agarose-Gelationsprozess einleitete. Wir berechneten die Polydispersität einer typischen Emulsion auf 6 %(Ergänzungsabbildung 1), obwohl Polydispersitätswerte bis zu 10 % akzeptabel sind. Sobald die Agarose-Gelgesetzten gesetzt sind, brechen wir die Emulsion und entfernten die Ölphase. Die Gele wurden in wässrigem Puffer gewaschen, bevor sie in Wachstumsmedien eintauchten. Die nächtliche Inkubation der Mikrogele führte dazu, dass isogene Kolonien in einigen der Mikrogele wuchsen (Abbildung 2D). Der Prozentsatz der Hydrogele, die Kolonien von mindestens 20 Zellen enthielten, hing von den Kulturbedingungen ab, einschließlich der Inkubationszeit und der Medienzusammensetzung. In unserer Demonstration mit C. albicansstellten wir fest, dass etwa 15% der Hydrogele eine Kolonie nach 20 h Suspensionskultur enthielten. Ein zweites Koverkapselungsgerät extrahierte die mRNA aus isogenen Kolonien (Abbildung 3A). Bevor wir die Hefemikrogele in das mikrofluidische Gerät einluden, haben wir die Gele gewaschen und in eine Lösung getaucht, um die Hefezellwände zu verdauen. Die richtige Verdauung der Hefezellen wurde durch Mikroskopie überprüft, wobei behandelte Hefe eine reflektierendere Morphologie hatte (Abbildung 3B). Wir haben die Mikrogele in einer Spritze geschlossen und den Gel-Eingangsstrom so abgestimmt, dass sich in jedem Tropfen ein Gel befand. Ein Strom von mRNA-Capture-Perlen im Lysepuffer gemischt mit dem dicht gepackten Gelstrom vor der Drop-Making-Kreuzung (Abbildung 3C). Wir sammelten eine daraus resultierende Emulsion von 160 m Tröpfchen, und Kolonien begannen, ihren Zellinhalt zu lysieren und freizusetzen. Wir luden Perlen an einer begrenzenden Verdünnung, um die Anzahl der Tropfen zu minimieren, die mehrere Perlen enthielten, aber das Schließen der Gele während der Tropfenherstellung führte zu etwa 10% der gesammelten Tropfen, die eine Perle mit einer lysierten Kolonie enthielten(Abbildung 3D). Wir analysierten die Genexpression von C. albicans, einer Hefeart, die im menschlichen Darmmikrobiom vorhanden ist, mit dem ICO-seq-Workflow. C. albicans ist bekannt für seine Fähigkeit, zwischen zwei verschiedenen Zellzuständen zu wechseln, die als weiß und undurchsichtig19bezeichnet werden. Wir verwenden einen technischen C-Albican-Stamm, den Stamm RZY122, der eine Kopie des WH11-Gens ersetzt, der nur in weißen Zellen mit YFP20aktiv ist. Wir haben eine Reihe von Genexpressionsprofilen unter Verwendung des Workflows erhalten und sie für die Analyse von Kolonien verwendet, die mindestens 300 einzigartige Gene exdrücken. Als Referenzdatensatz verwendeten wir C. Albicans-Expressionsdaten aus einer zuvor veröffentlichten Studie17 und filterten Kolonien heraus, die weniger als 600 einzigartige Gene ausdrückten. Nach der Durchführung der Hauptkomponentenanalyse (PC) und einer t-stochastischen Benachbarten-Einbettung (tSNE) bei der Dimensionsreduktion21fanden wir eine allgemeine Übereinstimmung zwischen unserem Beispiel-Dataset und der Referenz (Abbildung 4A). PC-Analysen ergaben, dass YFP und WH11 wesentlich zu den ersten beiden PCs beigetragen haben. Darüber hinaus ergab die tSNE-Analyse drei Cluster (Abbildung 4B). Während Cluster 2 überwiegend aus Zellen aus dem Beispiel-Dataset bestand, bestanden die Cluster 0 und 1 aus Zellen aus beiden Stichproben. Durch Überlagern des WH11-Ausdrucks auf dem tSNE (Abbildung 4C, Oberteil) haben wir festgestellt, dass Cluster 1 wahrscheinlich weiße Kolonien enthält. Wir stellten außerdem fest, dass die STF2-Expression in Cluster 1(Abbildung 4C, untere Gruppe) zunahm, im Einklang mit den zuvor erhaltenen Daten17. In den Clustern 0 und 2 waren WH11 und STF2 im Vergleich zu Cluster 1 (Abbildung 4D) deutlich nach unten reguliert. Gene, die an der Fermentation beteiligt waren, wie ADH1,wurden in Cluster 0 hochreguliert, im Einklang mit früheren Studien mit undurchsichtigen Zellen22. Wir fanden heraus, dass Kolonien in Cluster 2 die ribosomale RNA im Vergleich zu Kolonien in den Clustern 0 und 1 verringert hatten. Obwohl die Proben- und Referenzdatensätze mit demselben Zellbestand erhalten wurden, deutet dieses Ergebnis darauf hin, dass selbst subtile Unterschiede in der experimentellen Handhabung die Genexpression beeinflussen können. Abbildung 1: Übersicht über den ICO-Seq-Workflow. (A) Hefe, die in einer Suspensionskultur wächst, wurden puffert und mit geschmolzener Agarose in einem strömungsfokussierenden Tröpfchengenerator verkapselt, um die Poisson-Belastung von Agarose-Mikrogelen mit einzelnen Hefezellen zu ermöglichen. Die Gele setzten, wenn die Agarose abkühlte, die Öl-Wasser-Suspension gebrochen wurde, und das Öl wurde entfernt, was zu einer Suspension von Gelperlen in Wasser führte. Nach der Übernachtkultur wuchsen Hefezellen zu isogenen Kolonien innerhalb der Mikrogele heran. (B) Kolonien wurden einem Zellwandabbaupuffer unterzogen, danach wurden sie eng verpackt und mit mRNA-Capture-Perlen in einem zweiten mikrofluidischen Gerät kokapselt. Die enge Verpackung der Mikrogele sorgte dafür, dass jeder Tropfen ein Gel hatte, während Poisson das Laden der Perlen die Wahrscheinlichkeit von mehreren Perlen innerhalb eines Tropfens verringerte. Gesammelte Tropfen wurden für die cDNA-Synthese und die Generierung einer Sequenzierungsbibliothek verarbeitet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 2: Erzeugung isogener Hefekolonien innerhalb von Agarose-Mikrogelen unter Verwendung von Gerät A. (A) Schematisches mikrofluidisches Gerät, das die Positionen der drei Ein- und Ausgangsanschlüsse anzeigt. Die Dropmaking-Kreuzung ist rot hervorgehoben. (B) Nahaufnahme der Drop-Making-Kreuzung während des normalen Gerätebetriebs. (C) Mikrograph der gesammelten Tröpfchen, mit einer Nahaufnahme eines Tröpfchens, das eine gekapselte Zelle (Einset) enthält. (D) Mikrograph der isogenen Hefekolonien in Agarose-Mikrogelen nach einer 24-stündigen Inkubation mit einer Nahaufnahme von zwei Kolonien (Einbau). Alle Skalenbalken = 100 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 3: Lyse- und mRNA-Erfassung aus isogenen Kolonien mit Gerät B. (A) Schematisches mikrofluidisches Gerät, das die Positionen der drei Ein- und Ausgangsanschlüsse anzeigt. Die Dropmaking-Kreuzung ist rot hervorgehoben. (B) Mikrograph der Hefekolonien nach der Zellwandverdauung, mit einer Nahaufnahme einer Kolonie (Einbau). (C) Nahaufnahme der Drop-Making-Kreuzung während des normalen Gerätebetriebs. (D) Mikrograph der gesammelten Emulsionen nach Mikrogel- und Perlenpaarung, wobei eine Nahaufnahme einen Tropfen mit einer Perle und einer lysierten Kolonie (Einset) zeigt. Alle Skalenbalken = 100 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 4: Analyse des weiß-undurchsichtigen Schaltverhaltens in C. albicans. (A) tSNE-Diagramm eines Beispiel-Datasets in Kombination mit einem Referenz-Dataset aus Liu17. (B) Das Clustering von Transkriptomen zeigt drei Cluster, die auf einem tSNE-Plot visualisiert sind. (C) Schlüsselgene, die an der weiß-undurchsichtigen Schaltreaktion beteiligt waren, trugen zur Variation bei, die durch die Hauptkomponentenanalyse bestimmt wurde. (D) Geigenplots normalisierter Expressionsstufen von YFP und WH11 durch Cluster, die auf tSNE-Diagramm markiert sind. **gibt p <<< 0.05 und * p << 0.05 an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Zusatzfiguren 1 und 2. Bitte klicken Sie hier, um diese Filgures herunterzuladen. Ergänzende Dateien 1-3. Bitte klicken Sie hier, um diese Dateien herunterzuladen.

Discussion

Unsere Methode zur isogenen Hefekolonie RNA-Sequenzierung (ICO-seq) passt eine veröffentlichte einzellige RNA-Sequenzierungsplattform, Drop-Seq, für das Hochdurchsatz-Screening von technischen Hefestämmen an. Hefezellen enthalten weniger als 10% der Kopien von mRNA einer typischen Säugetierzelle und haben eine Zellwand, die vor der mRNA-Erfassung16abgebaut werden muss. Diese beiden Faktoren schließen die direkte Anwendung von Hefe auf Drop-Seq oder andere tröpfchenbasierte scRNA-seq-Plattformen aus. Um diese Probleme anzugehen, kapseln wir einzelne Zellen in Hydrogelen ein und wachsen sie zu Kolonien, um genügend Inputmaterial für die RNA-Sequenzierung bereitzustellen, und wir verdauen die Hefezellwand, um Spheroplasten vor der Lyse und mRNA-Aufnahme zu erzeugen. Diese Änderungen erhöhen den ICO-Seq-Workflow im Vergleich zum ursprünglichen Drop-Seq-Workflow zusätzlich und sind wichtige Schritte, die Benutzer sicherstellen müssen, dass reibungslos vorgefahren wird.

Der ordnungsgemäße Betrieb von Gerät A ist notwendig, um einzelne Hefezellen in Agarose-Hydrogelen zu verkapseln. Die richtige Zählung der Eingangshefesuspension muss eingehalten werden, um die Anzahl der Hydrogele mit mehr als einer Hefezelle zu minimieren und gleichzeitig sicherzustellen, dass genügend Hydrogele eine einzelne Zelle enthalten, um eine angemessene Zellaufnahmeeffizienz während der mRNA-Erfassung zu gewährleisten. Während des Betriebes eines mikrofluidischen Gerätes muss das Agarose-Gel-Gemisch gut gelöst und durch einen Spritzenfilter geleitet werden, um die Wahrscheinlichkeit einer Verstopfung des Geräts zu minimieren. Die Agarose-Gel-Mischung ist zähflüssig und die Region, in der sich ein einzelner Kanal in acht teilt, ist besonders anfällig für Verstopfung. Durch zentrieren Sie eine Hochgeschwindigkeitskamera, um den Gerätebetrieb in diesem Bereich des Geräts zu visualisieren, können Benutzer die Gleichmäßigkeit der Tröpfchen überwachen, die aus jedem der acht Kanäle entstehen, und schnell reagieren, wenn sich die Gleichmäßigkeit aufgrund von Verstopfungen in einem der Kanäle ändert. Die Inspektion einer kleinen Menge gesammelter Emulsionen unter dem Mikroskop bietet ein sekundäres Verfahren zur Bestätigung einer hochwertigen Emulsion.

Nach dem Wachstum von Hefekolonien innerhalb von Hydrogelen sind mehrere Vorsichtsmaßnahmen erforderlich, um eine qualitativ hochwertige mRNA-Extraktion auf der Ebene der einzelnen Kolonien zu gewährleisten. Es ist wichtig, die Zeit zu optimieren, in der Hefe in der Hydrogelkultur sind, denn wenn die Hefe zu lange in der Kultur gelassen wird, werden viele den Grenzen der Hydrogele entkommen, was zu einem höheren Hintergrundsignal während der RNA-Sequenzierung und einer geringeren Empfindlichkeit bei der Unterscheidung zwischen Zelltypen führt. Die richtige Erzeugung von Spheroplasten mit Zymolyase stellt sicher, dass mRNA nach der Zellexposition gegenüber dem Lysepuffer freigesetzt wird. Die sichtliche Untersuchung von Hefekolonien nach Zymolyase sollte zu glänzenderen Hefezellen führen. Unsachgemäße Zellwandverdauung führt zu einer geringeren EFFIZIENZ der RNA-Erfassung. Schließlich sollten die Hydrogele bei der Einspritzung in Gerät B eng verpackt sein. Die Überwachung des Hydrogel-Eingangs mit einer Hochgeschwindigkeitskamera ermöglicht den Abschluss der Emulsionssammlung, sobald die Hydrogele beim Einlass in das Gerät nicht mehr dicht verpackt sind, da sonst die Erfassungseffizienz beeinträchtigt wird.

Ein potenzielles Problem mit unserer Methode ist, dass die Mikrogelkultur von Hefe die Genexpression signifikant verändern kann. Frühere Arbeiten zur Untersuchung der Hefegenexpression in Mikrogelen und an Agar zeigen Unterschiede in den Genexpressionsdurchschnitten, aber insgesamt eine positive Korrelation17, obwohl eine weitere Untersuchung dieser Behauptung an einer Vielzahl von Hefestämmen vorsichtig ist. Die Methode hat auch begrenzte ZellerfassungEffizienz aufgrund der stochastischen Belastung von mRNA-Capture-Perlen nach Poisson-Statistik14. Derzeit enthalten etwa 10% der Tropfen eine Perle und eine Kolonie, und die Rate der doppelten Verkapselungen wird voraussichtlich unter 1% liegen. Doppelte Verkapselungen führen zu verwirrenden Elementen während der RNA-Seq-Datenanalyse und ihre Filterung bleibt herausfordernd23; eine Erfassungsrate von 25 % würde zu einer entsprechenden Erhöhung der Doppelverkapselungen auf 5 % führen (Zusatzabbildung 2). Obwohl wir ICO-seq mit der Drop-Seq-Plattform demonstrieren, gibt es andere Droplet-RNA-Seq-Plattformen, die mRNA-Capture-Perlen deterministisch anstatt statistisch einführen, wie die kommerziell erhältliche 10x Genomics Chromium Plattform15,24. Die Integration dieser Plattformen mit ICO-seq könnte die Erfassungseffizienz über das hinaus steigern, was Poisson-Statistiken erlauben. Schließlich ist eine grundlegende Einschränkung des Tröpfchens RNA-seq die Unfähigkeit, Zellen von Interesse nach der Sequenzierung wiederherzustellen. Diese Einschränkung sollte berücksichtigt werden, wenn die Arten von Hefebibliotheken betrachtet werden, die mit dieser Methode analysiert werden sollen.

Die Zell-zu-Zell-Heterogenität wurde auf klonaler Ebene für Mikroben wie E. coli25 und Snachgewiesen. cerevisiae26 enthüllt neue Zellzustände, die eine Massenanalyse sonst maskieren würde. Massen-RNA-Seq-Analysen, die an C. Albicans durchgeführt werden, neigen dazu, entweder populationsweite Transkriptom-Veränderungen oder weiße und undurchsichtige Zellen als zwei getrennte Populationen zu betrachten27,28. Die Anwendung von ICO-seq könnte zur Entdeckung zusätzlicher Unterzustände führen und einen analytischen Rahmen für die Entdeckung neuer Zellzustände innerhalb anderer Hefearten bieten. Das Wachstum von Zellen innerhalb von Hydrogelen ist jedoch nicht auf Hefe beschränkt: andere Zelltypen, wie Säugetier-, Bakterien- und andere Pilzzellen, können auch innerhalb von Hydrogelen29,30kultiviert werden. Die Sequenzierung von isogenen Kolonien im Vergleich zu Einzelzellen führt zur Mittelung des biologischen Rauschens aufgrund von Zell-zu-Zell-Variationen, wodurch die Diskriminierung zwischen Zelltypen verbessert wird. Dies kann bei der Analyse von Zellen helfen, bei denen die genetische Vielfalt auf bestimmte Synthesewege konzentriert. Die erweiterten Möglichkeiten der Zelltypeingabe in ICO-seq und ihre mögliche Integration in kommerziell erhältliche Tröpfchen-RNA-Seq-Plattformen positioniert ICO-seq als vielversprechende Plattform zur Zerlegung der zellulären Heterogenität auf genetischer Ebene.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dieses Projekt wurde unterstützt durch den National Science Foundation Career Award DBI-1253293, den National Institutes of Health New Innovator Award DP2AR068129 und das Stipendium R01HG008978, das National Science Foundation Technology Center Grant DBI-1548297 und das UCSF Center for Cellular Construction. ARA und ZJG sind Chan-Zuckerberg Biohub Investigators.

Materials

0.22 um syringe filter Milipore Sigma SLGP033RS
0.5M EDTA, pH 8.0 Thermo-Fisher 15575020 Used to make TE-TW buffer
0.75 mm biopsy punch World Precision Instruments 504529
1 mL syringes BD 309628
1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO) Sigma-Aldrich 370533
1M Tris-HCI, pH 8.0 Thermo-Fisher 15568025 Used to make TE-TW buffer
27 gauge needles BD 305109
3 mL syringes BD 309657
3" silicon wafers, P type, virgin test grade University Wafers 447
3D-printed centrifuge syringe holder (custom) (custom) See Supplemental Files for 3D print file
Agarose, low gelling temperature Sigma-Aldrich a9414
Aquapel (hydrophobic glass treatment) Pittsburgh Glass Works 47100
Drop-Seq Beads ChemGenes MACOSKO-2011-10
Glass microscope slides (75 mm x 50 mm) Corning 294775X50
Ionic Krytox Surfactant Synthesis instructions in ref 14. Can substitute with PEG-PFPE surfactant.
Isopropanol Sigma-Aldrich 109827
NaCl Sigma-Aldrich S9888
Novec 7500 3M 98-0212-2928-5 Commonly knowns as HFE 7500
PBS Fisher Scientific BP243820
PE-2 polyethylene tubing Scientific Commodities B31695-PE/2
PEG-PFPE surfactant Ran Biotechnologies 008-FluoroSurfactant
PGMEA developer Sigma-Aldrich 484431
Photomasks CadArt Servcies (custom) See Supplemental Files for mask designs
Spin coater Specialty Coating Systems G3P-8
SSC Buffer Sigma-Aldrich S6639
SU-8 2100 MicroChem Y111075
SU-8 2150 MicroChem Y111077
Sylgard 184 silicone elastomer kit Krayden 4019862
Tween-20 Sigma-Aldrich P1379 Used to make TE-TW buffer
YR Digestion buffer Zymo Research R1001-1 Spheroplasting buffer
YR Lysis Buffer Zymo Research R1001-2
Zymolyase Zymo Research E1005 Spheroplasting enzyme mixture
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References

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Zhang, J. Q., Chang, K., Liu, L., Gartner, Z. J., Abate, A. R. High Throughput Yeast Strain Phenotyping with Droplet-Based RNA Sequencing. J. Vis. Exp. (159), e61014, doi:10.3791/61014 (2020).
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