מעקב אוטומטי לחלוטין ברגל באופן חופשי חרקים נעים באמצעות לימוד הרגל למידה פילוח ומעקב (FLLIT)
Summary
אנו מתארים פרוטוקולים מפורטים לשימוש ב-FLLIT, שיטת למידה מלאה אוטומטית של מכונה למעקב אחר תנועות של הרגליים באמצעות הזזת דרוסופילה מלאנוגסטר וחרקים אחרים. ניתן להשתמש בפרוטוקולים אלה כדי לכמת את המהלכים הליכה עדינים בהליכה בתנועות מסוג פראי זבובים, מוטציה זבובים ומודלים לטוס של ניוון נוירוסטיות.
Abstract
דגם Drosophila ילה היה רב ערך לחקר התפקוד הנוירולוגי ולהבנת המנגנונים המולקולריים והסלולאריים הטמונים בחוסר ניוון נוירולוגי. בעוד טכניקות לטוס לטיפול ולימוד של קבוצות מערכות נוירואליות גדלו יותר ויותר מתוחכמים, העושר של פנוטיפים התנהגותיים כתוצאה לא נתפסו בפרט דומה. כדי להיות מסוגל ללמוד תנועות הרגל עדין לטוס להשוואה בין מוטציות דורש את היכולת למדוד באופן אוטומטי ולכמת תנועות הרגל במהירות גבוהה ומהירה. מכאן, פיתחנו אלגוריתם לימוד מכונה עבור מעקב ציפורניים אוטומטי של הרגל ב זבובים הליכה בחופשיות, תכונות למידה מבוססי פילוח הגפיים מעקב (FLLIT). בניגוד לשיטות הלמידה העמוקות ביותר, FLLIT היא אוטומטית לחלוטין ויוצרת ערכות הדרכה משלו ללא צורך ביאור משתמש, באמצעות פרמטרים מורפולוגיים המובנה באלגוריתם הלמידה. מאמר זה מתאר פרוטוקול עומק לביצוע ניתוח הילוך באמצעות FLLIT. זה מפרט את ההליכים עבור הגדרת המצלמה, בניית ארנה, הקלטת וידאו, פילוח רגל ומעקב ציפורניים הרגל. זה גם נותן סקירה של הנתונים המיוצרים על ידי FLLIT, אשר כולל מיקומים גולמיים מסומנים הגוף והרגל בכל מסגרת וידאו, 20 הילוך, פרמטרים 5 מגרשים וידאו מסומנים. כדי להדגים את השימוש FLLIT, אנו לכמת פרמטרים רלוונטיים הילוך החולה במודל זבוב של האטקסיה של Spino, בלבלר שלוש.
Introduction
בעשורים האחרונים, מחלות ניווניות והפרעות תנועה גדלו שכיחה יותר באוכלוסיות ההזדקנות שלנו. למרות ההבנה שלנו של מחלות ניווניות רבות התקדמה ברמה המולקולרית והתאית, התכונות הבסיסיות של מחלת המעגלים העצביים המושפעים מושפעים להישאר מובנים בצורה גרועה. לאחרונה פיתח כלי מעקב התנהגותי1,2,3,4 כעת לאפשר לנו ללמוד חריגות תנועה במודלים למחלות בעלי חיים על מנת לזהות מולקולרית, הסלולר והמעגל הבסיסי המחלה הבסיסית.
מסלולים מולקולריים המעורבים במחלות ניווניות רבות נשמרים בזבוב הפירות מלאנוגסטר, ומודלים של מחלת דרוזוהילה סייעו להבהיר מנגנונים יסודיים בבסיס נוירוניוון5,6. לאחרונה הראינו כי מודלים לטוס של מחלת פרקינסון (PD) ו SpinoSCA3 Bellar האטאקסיה 3 () התערוכה ברורה, שמרו חתימות הליכה הדומות לאלה של מחלות האדם המתאימות1, הוכחת כי המודל לעוף ניתן להשתמש כדי להבין מנגנונים מסוימים תפקוד התנועה בהפרעות ספציפיות התנועה. מארסנל עשיר הגוברת ללא הרף של כלים במודל לטוס לטיפול ממוקד ויזואליזציה של נוירונים ב הגן היחיד ברמה אחת תא7,8,9,10 עושה לטוס מודל אידיאלי אחד כדי לחקור את היחסים בין מסלולים המחלה, המעגלים העצביים התנהגותית פנוטימית התנהגותיים ב vivo. כדי לאפשר מדויק, אוטומטי הילוך ניתוח הליכה, פיתחנו לאחרונה שיטת למידה מחשב, F הספרותלהרוויח מבוססי מגה- בתים מבוסס ושרוט(fllit)1.
FLLIT מורכב אלגוריתם מרובה אוטומטי באופן מלא, כי הראשון מפלחים את הפיקסלים ברגל, אשר משמשים לאחר מכן כדי לאתר ולעקוב אחר ציפורני הרגל המתאימים. Fllit מעסיקה אלגוריתם האצת לפילוח, בניגוד לאלגוריתמים למידה עמוקה המשמש בעבודה האחרונה2,3. יש כמה קווי דמיון עם רשתות עצביות convolutional זה עבור שתי המסגרות, החילוץ תכונה נעשית באופן אוטומטי דרך למידה convolutional גרעינים. הצעד הראשון ב-FLLIT כרוך בשימוש בפעולות מורפולוגיות (קצה ושלד) כדי ליצור באופן אוטומטי חיובי (פיקסלים על הרגליים) ושלילי (רקע או פיקסלים על גוף הזבוב) בדגימות אימון עם ביטחון גבוה. מכאן, FLLIT היא אוטומטית לחלוטין ואינו מחייב משתמשים מסומן דגימות הדרכה. באמצעות דגימות ההדרכה הנ ל, מסווג מאומן לאחר מכן במסגרת אלגוריתם הגברת. הרכב של מסווג חלש למדו בצורה איטרזית, עם כל אחד מורכב מערכת של גרעינים convolutional להפקת תכונה עץ החלטה. המסווג למדו הסופי משמש לאחר מכן לפילוח רגל והוא מסוגל להבחין טוב יותר אזורים קשים/דגימות קשות יותר מאשר פעולות מורפולוגיות, הפקת פילוח כולל הרבה יותר מדויק עבור מעקב1. מתוך הרגליים מקוטע, אנו לאתר את הטיפים ולעקוב אחריהם באמצעות האלגוריתם ההונגרי: על ידי התאמת עצות על פני מסגרות כגון סכום המרחק שהועבר על ידי כל קצה ממוזער. FLLIT יכול להתמודד עם מקרים סגר על ידי זכירת המיקום האחרון שנראה (בתוך לטוס קואורדינטות ממורכז) כך טיפ רגל הוא התאושש ברגע שהוא כבר לא תחת חסימה.
בעבר הראינו כי FLLIT יכול באופן אוטומטי ומדויק לעקוב אחר תנועות הרגל ולנתח הילוך בלתי מסומן, נע בחופשיות לטוס או עכביש מתוך וידאו במהירות גבוהה1; לפיכך, על FLLIT להיות מתאים באופן כללי עבור מעקב הרגל המרגליות. על-ידי חילוץ ערכות אימון למידה ממוחשבת באמצעות פרמטרים מורפולוגיים, FLLIT מרכבות באופן אוטומטי לפלח ולעקוב אחר רגלי החרק ללא צורך ביאור ידני מפרך, אשר נדרש עבור שיטות למידה מעמיקה ביותר. FLLIT מכאן אוטומטית לחלוטין. לאחר פילוח הרגל ומעקב, FLLIT מייצרת באופן אוטומטי תנוחות raw הגוף והרגל מסומנים בכל מסגרת וידאו, 20 הליכה פרמטרים, 5 מגרשים וידאו מסומנים עבור ניתוח הילוך ויזואליזציה של תנועות הליכה. פרוטוקול זה מספק מדריך צעד-אחר-צעד לשימוש ב-FLLIT.
Protocol
Representative Results
Discussion
בכתב יד זה אנו מתארים בפרוטרוט את השלבים הכרוכים בשימוש ב-FLLIT, תוכנית למידה ממוחשבת של מחשב1, לניתוח הילוך בהליכה בלתי מפורטת של דרוזוהילה. לאחר מעקב וניתוח נתונים, FLLIT מייצרת באופן אוטומטי נתונים גולמיים עבור המידע על המיקום של הגוף ואת ציפורני הרגל, הפקת 20 הגוף ותכונות הליכה, כמו גם וידאו של לטוס מסומנים כדי לאפשר הליכה הדמיה.
יש כעת מספר שיטות למעקב אחר תנועת הרגליים של דרוזוהילה ובעלי חיים אחרים1,2,3,4,14,15,16, מתן לחוקרים מגוון רחב של אפשרויות בהתאם ליעדי הניסוי. חלק מאלה הם גישות מבוססות על הדפסה ברגל, אשר מדויקות מאוד אבל אשר מדווחים רק נקודות מגע עם משטח הזיהוי4,14. מצד שני, האחרונות למידה עמוקה גישות2,3,16 הם רב-תכליתי מאוד, המאפשר ניתוח של התנהגויות הדורשות מעקב אחר מישקים ברגל וחלקי גוף אחרים בכל חיה, עם האזהרה כי האלגוריתמים צריך תחילה להיות מאומן עם משתמשים מסומן datasets. סוג שלישי של גישה משתמש בשיטת מורפולוגיה או בשיטות המבוססות על חדות התמונה1,15,17 כדי למצוא את המתאר של כל רגל כדי לזהות תנוחות טופר. באופן כללי, שיטות אלה מתנהלות בצורה גרועה עם התנהגויות שבהן הרגליים מוצלבות (למשל במהלך הטיפוח). FLLIT משלבת את הגישות השנייה והשלישית, באמצעות פרמטרים מורפולוגיים כדי להכשיר אלגוריתם הגברת לפלח הרגל. זה מאפשר FLLIT לעקוף את משימת העמל של הביאור המשתמש כדי ליצור את ערכת הנתונים הדרכה, תוך שיפור הדיוק באמצעות מחשב למידה. שיפורים עתידיים ב-FLLIT יהיו חייבים להתמודד עם מקרים שבהם הרגליים מוצלבות, כדי לאפשר ניתוח של התנהגויות מורכבות יותר.
FLLIT היא חזקה שינויים קלים תאורה, רזולוציית הקלטה מהירות מסגרת1. עם זאת, מהירות מסגרת של קטעי וידאו מוקלטים לא צריך ליפול מתחת 250 fps, ו FLLIT פועל בצורה אופטימלית עבור קטעי וידאו שנרשמו ב 1000 fps. אם יש טשטוש תנועה בתמונות, כך שהוא מאתגר עבור ביאורים אנושיים כדי לזהות את עמדת הרגל, FLLIT לא יוכלו לזהות במדויק עצות הרגל במסגרות אלה. לאור זה, חיוני כי המצלמה תהיה ממוקדת בחדות על קצות הרגל. כדי למנוע העברת חפצים, יש לנקות את הזירה ביסודיות, ואין להעבירו במהלך ההקלטה. עבור חיסור רקע מדויק ומפלח נקי, הזבוב צריך להזיז לפחות אורך גוף אחד במהלך ההקלטה, ללא השהיה. לאחר פילוח אוטומטי ומעקב תיוג של כל הרגליים יש לבדוק. אם ההילוך לטוס לא מעקב או מעקב שלא כראוי, הקובץ צריך להיות מסומנים מחדש באופן ידני באמצעות האפשרות התחל מעקב ידני (שלב 5.2.7 – 5.2.10).
מחלות ניווניות והפרעות תנועה שכיחות יותר ויותר בחברות ההזדקנות שלנו. לטוס מודלים של ניוון נוירולוגי נחקרו במשך יותר מ 2 עשורים, במהלכו התקדמות נעשו לגבי ההיבטים המולקולריים והסלולריים של מחלות פתופסולוגיה. עם זאת, השלכות התנהגותיות ספציפיות של המחלה היו מבחינה טכנית קשה להעריך. לדוגמה, בעוד שדיווחים על תנועות רועדות בזבוב נעשו18,19, אלה לא היו לומדים ללמוד עד לאחרונה1. שיטת הטיפוס הייתה מידה שימושית וכמותית, אך גסה באופן יחסי,6. הגרעון הטכני הזה החזיק באופן דומה בניתוח תנועה ברזולוציה גבוהה במודלים של בעלי חיים אחרים. הופעתו של כלים חדשים לניתוח התנהגותי, ומכאן, יש הבטחה להצעיר את התחום של הפרעות תנועה כדי לאפשר לחוקרים ללמוד כיצד מנגנונים מולקולריים וסלולריים של מחלות נוירולוגיות מובילות לתוצאות התנהגותיות ספציפיות במודלים של בעלי חיים. במאמר זה ובעבודה הקודמת שלנו1, הצגנו באמצעות fllit כי לטוס מודלים של SCA3 התערוכה הילוך היפרקינטי ataxic, בעוד PD לטוס מודלים התערוכה הילוך קשיח היפוקינטי, לכידה הסימנים של התנועה של מחלות האדם המתאים1. ניתוח הילוך איפשר גם לנו לזהות אוכלוסיות עצבי ברורים בבסיס מסוימים התנועה בתפקוד. הולך קדימה, ניתוח התנועה מפורט, בשילוב עם הדמיה רבת עוצמה וכלים פונקציונליים זמין לעוף, יאפשר לנו להשיג תובנה הרומן לתוך מנגנונים של locomotor, להאיר את ההבנה שלנו של מחלות ניווניות ביחס למנגנון מעגלים.
FLLIT צריך להיות החלים באופן נרחב על הליכה לימוד ביצורים פרוקי רגליים קטנים אחרים, כפי שהוא הפגין בעבר להיות מדויק מאוד עבור מעקב אחר תנועות הרגל עכביש1. בעוד אנו מתמקדים כאן על השימוש בפנוטיפים לתנועה מפורטת עבור כימות הילוך פתוגניים המעגלים הבסיסיים שלה, ההתקדמות מעקב התנועה כבר מהפכה, והוא יהיה השפעה מתמשכת על, הבנה של תיאום הליכה נורמלי הילוך והמעגלים הבסיסיים שלה, במיוחד בענפים שונים של העץ האבולוציוני.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות למומיטה צ’מאז ולאליס לו לתמיכה טכנית, ומרכז המניות של בלומינגטון דרוזוהילה (אינדיאנה, ארה ב) להפיכת הזנים הדרוזוניים המשמשים בעבודה זו. עבודה זו נתמכת על ידי המכון לביולוגיה מולקולרית ותאית, סינגפור; מוסד ביואינפורמטיקה, סינגפור; הסוכנות עבור מדעי הטכנולוגיה וארגון המועצה משותף מחקר (מענק מספר 15302FG149 ל SA ו-LC); תוכנית הדגל המחקר הקליני (מחלת פרקינסון) מנוהל על ידי משרד סינגפור המועצה למחקר רפואי לאומי (גרנט מספר NMRC/TCR/013-NNI/2014 כדי SA), אוניברסיטת אלברטה (הפעלה מענק LC), ואת מדעי הטבע והמועצה למחקר הנדסי של קנדה (NMRC) גילוי מענק (גרנט מספר RGPIN-2019-04575 כדי LC).
Materials
| Acrylic Sheets | Dama | 1.6 mm thickness, Clear sheets | Singapore, Singapore |
| Clear Glass slides | Biomedia | BMH 880101 | Singapore, Singapore |
| High speed camera | Photron | Fastcam MC2.1 | Tokyo, Japan. A shutter speed of 1 msec or faster is ideal to reduce motion blur of captured images |
| Infra Red LED | Any – Generic from hardware store | 940nm Infrared Light Board | Singapore, Singapore |
| Kimwipe | Kimberly Clark | 34155-01LS | Irving, Texas, USA |
References
- Wu, S., et al. Fully automated leg tracking of Drosophila neurodegeneration models reveals distinct conserved movement signatures. PLoS Biology. 17 (6), 3000346 (2019).
- Mathis, A., et al. DeepLabCut: markerless pose estimation of user-defined body parts with deep learning. Nature Neuroscience. 19, 1281-1289 (2018).
- Pereira, T. D., et al. Fast animal pose estimation using deep neural networks. Nature Methods. 16 (1), 117-125 (2019).
- Machado, A. S., Darmohray, D. M., Fayad, J., Marques, H. G., Carey, M. R. A quantitative framework for whole-body coordination reveals specific deficits in freely walking ataxic mice. eLife. 4, (2015).
- Lu, B., Vogel, H. Drosophila models of neurodegenerative diseases. Annual Reviews in Pathology. 4, 315-342 (2009).
- McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. Drosophila as an In Vivo Model for Human Neurodegenerative Disease. Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).
- Dionne, H., Hibbard, K., Cavallaro, A., Kao, J. -. C., Rubin, G. M. Genetic reagents for making split-GAL4 lines in Drosophila. bioRxiv. , (2017).
- Cande, J., et al. Optogenetic dissection of descending behavioral control in Drosophila. eLife. 7, (2018).
- Nern, A., Pfeiffer, B. D., Rubin, G. M. Optimized tools for multicolor stochastic labeling reveal diverse stereotyped cell arrangements in the fly visual system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (22), 2967-2976 (2015).
- Xie, T., et al. A Genetic Toolkit for Dissecting Dopamine Circuit Function in Drosophila. Cell Reports. 23 (2), 652-665 (2018).
- Warrick, J. M., et al. Ataxin-3 suppresses polyglutamine neurodegeneration in Drosophila by a ubiquitin-associated mechanism. Molecular Cell. 18 (1), 37-48 (2005).
- Ebersbach, G., et al. Comparative analysis of gait in Parkinson’s disease, cerebellar ataxia and subcortical arteriosclerotic encephalopathy. Brain. 122 (7), 1349-1355 (1999).
- Stolze, H., et al. Typical features of cerebellar ataxic gait. Journal of Neurology, Neurosurgery and Psychiatry. 73 (3), 310-312 (2002).
- Mendes, C. S., Bartos, I., Akay, T., Marka, S., Mann, R. S. Quantification of gait parameters in freely walking wild type and sensory deprived Drosophila melanogaster. eLife. 2, 00231 (2013).
- DeAngelis, B. D., Zavatone-Veth, J. A., Clark, D. A. The manifold structure of limb coordination in walking Drosophila. eLife. 8, (2019).
- Gunel, S., et al. DeepFly3D, a deep learning-based approach for 3D limb and appendage tracking in tethered, adult Drosophila. eLife. 8, (2019).
- Isakov, A., et al. Recovery of locomotion after injury in Drosophila melanogaster depends on proprioception. The Journal of Experimental Biology. 219, 1760-1771 (2016).
- Aw, S. S., Lim, I. K. H., Tang, M. X. M., Cohen, S. M. A Glio-Protective Role of mir-263a by Tuning Sensitivity to Glutamate. Cell Reports. 19 (9), 1783-1793 (2017).
- Eberl, D. F., Duyk, G. M., Perrimon, N. A genetic screen for mutations that disrupt an auditory response in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (26), 14837-14842 (1997).
