تتبع الساق الآلي بالكامل في الحشرات المتحركة بحرية باستخدام ميزة تعلم الساق التقسيم وتتبع (FLLIT)
Summary
نحن نصف بروتوكولات مفصلة لاستخدام FLLIT ، طريقة تعلم آلي بالكامل للحصول على حركة مخلب الساق في نقل Free Drosophila melanogaster والحشرات الأخرى. ويمكن استخدام هذه البروتوكولات لقياس كمية حركات مشية المشي خفية في الذباب نوع البرية، والذباب متحولة ونماذج ذبابة من التنكس العصبي.
Abstract
كان نموذج Drosophila لا يقدر بثمن لدراسة الوظيفة العصبية وفهم الآليات الجزيئية والخلوية التي تكمن وراء التنكس العصبي. في حين أن تقنيات الطيران للتلاعب ودراسة المجموعات الفرعية العصبية قد نمت بشكل متزايد متطورة ، فإن ثراء الأنماط السلوكية الناتجة لم يتم التقاطها بتفصيل مماثل. أن تكون قادرة على دراسة حركات الساق يطير خفية للمقارنة بين المسوخ يتطلب القدرة على قياس تلقائيا وقياس حركات الساق عالية السرعة وسريعة. وبالتالي ، قمنا بتطوير خوارزمية التعلم الآلي لتتبع مخلب الساق الآلي في الذباب المشي بحرية ، ميزة التعلم القائم على أطرافه التقسيم وتتبع (FLLIT). على عكس معظم أساليب التعلم العميقة ، FLLIT مؤتمتة بالكامل وتولد مجموعات التدريب الخاصة بها دون الحاجة إلى شرح المستخدم ، وذلك باستخدام معلمات مورفولوجية مدمجة في خوارزمية التعلم. تصف هذه المقالة بروتوكول متعمق لتنفيذ تحليل المشي باستخدام FLLIT. تفاصيل الإجراءات اللازمة لإعداد الكاميرا ، وبناء الساحة ، وتسجيل الفيديو ، وتجزئة الساق وتتبع مخلب الساق. كما أنه يعطي لمحة عامة عن البيانات التي تنتجها FLLIT ، والتي تشمل الخام تتبع الجسم والساق المواقف في كل إطار الفيديو ، 20 معلمات مشية ، 5 قطع أرض وفيديو متتبعة. لإثبات استخدام FLLIT، ونحن تحديد المعلمات مشية المريضة ذات الصلة في نموذج ذبابة من ترنح سبينوسيلارلا3.
Introduction
في العقود القليلة الماضية، ازدادت الأمراض العصبية واضطرابات الحركة انتشاراً أكبر في سكاننا المسنين. على الرغم من أن فهمنا للعديد من الأمراض العصبية التنكسية قد تقدم على المستوى الجزيئي والخلوي ، فإن السمات الأساسية للدوائر العصبية المصابة الكامنة وراء المرض لا تزال غير مفهومة بشكل جيد. وضعت مؤخرا أدوات تتبع السلوك1،2،3،4 تسمح لنا الآن لدراسة تشوهات الحركة في نماذج الأمراض الحيوانية من أجل تحديد الجزيئية والخلوية والدوائر خلل التنظيم الكامنة وراء المرض.
يتم الحفاظ على المسارات الجزيئية المشاركة في العديد من الأمراض العصبية في ذبابة الفاكهة Drosophila melanogaster، وساعدت نماذج مرض Drosophila لتوضيح الآليات الأساسية الكامنة وراء التنكس العصبي5،6. أظهرنا مؤخرا أن نماذج ذبابة من مرض باركنسون (PD) وSpinocerebellar ترنح 3 (SCA3) معرض متميزة, الحفاظ على التوقيعات مشية التي تشبه تلك الأمراض البشرية المعنية1,مما يدل على أن نموذج يطير يمكن استخدامها لفهم آليات الدائرة الكامنة وراء خلل الحركة في اضطرابات حركة محددة. ترسانة غنية ومتزايدة باستمرار من الأدوات في نموذج ذبابة للتلاعب المستهدف وتصور الخلايا العصبية في جين واحد ومستوى الخلية الواحدة7,8,9,10 يجعل ذبابة نموذج مثالي واحد للتحقيق في العلاقة بين مسارات المرض, الدوائر العصبية ومظاهر النهويف السلوكية في الجسم الحي. لتمكين دقيقة، تحليل مشية الحشرات الآلي، قمنا مؤخرا بتطوير طريقة التعلم الآلي، Feature L كسبالقائم على LI ميغابايت التجزئة وTالاجهاد (FLLIT)1.
FLLIT يتكون من خوارزمية متعددة المراحل مؤتمتة بالكامل أن شرائح الأولى بكسل الساق، والتي تستخدم في وقت لاحق لتحديد موقع وتتبع مخالب الساق المقابلة. FLLIT توظف خوارزمية تعزيز للتجزئة، على النقيض من خوارزميات التعلم العميق المستخدمة في العمل الأخير2،3. هناك بعض أوجه التشابه مع الشبكات العصبية الملتوية في أنه لكلا الإطارين ، يتم استخراج الميزة تلقائيًا من خلال تعلم حبات الالتواء. الخطوة الأولى في FLLIT ينطوي على استخدام العمليات المورفولوجية (الحافة والهيكل العظمي) لتوليد تلقائيا إيجابية (بكسل على الساقين) وسلبية (خلفية أو بكسل على الجسم يطير) عينات التدريب مع ثقة عالية. وبالتالي، FLLIT مؤتمتة بالكامل ولا تتطلب عينات التدريب المشروح المستخدم. باستخدام عينات التدريب المذكورة أعلاه ، يتم تدريب المصنف في إطار خوارزمية تعزيز. يتم تعلم مجموعة من المصنفين الضعفاء بشكل متكرر ، حيث يتكون كل منها من مجموعة من حبات الالتواء لاستخراج الميزات وشجرة القرار. ثم يتم استخدام المصنف المستفاد النهائي لتقسيم الساق وقادر على تمييز أفضل للمناطق الصعبة / العينات الصلبة أفضل من العمليات المورفولوجية ، مما ينتج تجزئة أكثر دقة بشكل عام لتتبع1. من الساقين مجزأة، ونحن تحديد موقع النصائح وتتبع لهم باستخدام الخوارزمية المجرية: عن طريق مطابقة النصائح عبر الإطارات مثل أن يتم تقليل مجموع المسافة التي تحركها كل طرف. FLLIT يمكن التعامل مع حالات الانسداد عن طريق تذكر آخر موقع ينظر (في الإحداثيات محورها ذبابة) بحيث يتم استرداد طرف الساق مرة واحدة لم يعد تحت الانسداد.
أظهرنا سابقا أن FLLIT يمكن تلقائيا وبدقة تتبع حركات الساق وتحليل مشية في ذبابة أو العنكبوت تتحرك بحرية من سرعة عاليةالفيديو 1. FLLIT وبالتالي ينبغي أن تكون قابلة للتطبيق على نطاق واسع لتتبع الساق المفصليبود. من خلال استخراج مجموعات التدريب على التعلم الآلي باستخدام معلمات مورفولوجية ، تقوم FLLIT تلقائيًا بتدريب نفسها على تقسيم وتتبع أرجل الحشرات دون الحاجة إلى شرح يدوي شاق ، وهو مطلوب لأساليب التعلم الأكثر عمقًا. FLLIT وبالتالي مؤتمتة بالكامل. بعد تجزئة الساق وتتبع، FLLIT تنتج تلقائيا الخام الجسم وتتبع مواقف الساق في كل إطار الفيديو، 20 معلمات مشية، 5 قطع أرض وفيديو متتبعلتحليل مشية وتصور حركات مشية. يوفر هذا البروتوكول دليل خطوة بخطوة لاستخدام FLLIT.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه المخطوطة ، نصف بالتفصيل الخطوات التي ينطوي عليها استخدام FLLIT ، وهو برنامج آلي للتعلم الآلي الآلي1، لتحليل المشي في Drosophilaالمشي بحرية. بعد التتبع وتحليل البيانات ، FLLIT تلقائيا بتوليد البيانات الخام للمعلومات الموضعية للجسم والساق مخالب ، وإنتاج عشرين الجسم وميزات المشي ، فضلا عن شريط فيديو من ذبابة متتبعة لتمكين تصور مشية.
هناك الآن عدد من الطرق لتتبع حركة الساق من Drosophila وغيرها من الحيوانات1،2،3،4،14،15،16، مما يعطي الباحثين مجموعة واسعة من الخيارات اعتمادا على أهداف التجربة. بعض هذه هي المناهج القائمة على الطباعة القدم، والتي هي دقيقة للغاية ولكن التي تقرير فقط مخلب نقاط الاتصال مع سطح الكشف4،14. من ناحية أخرى ، فإن أساليب التعلم العميق الأخيرة2،3،16 هي متعددة للغاية ، مما يسمح بتحليل السلوكيات التي تتطلب تتبع مفاصل الساق وأجزاء الجسم الأخرى في أي الحيوان ، مع التحذير من أن الخوارزميات تحتاج أولا إلى التدريب مع مجموعات البيانات المشروحة للمستخدم. يستخدم نوع ثالث من النهج مورفولوجيا أو أساليب قائمة على تباين الصور1،15،17 للعثور على الخطوط العريضة لكل ساق لتحديد مواقف المخالب. بشكل عام ، تتعامل هذه الطرق بشكل سيئ مع السلوكيات حيث تتقاطع الساقين (على سبيل المثال أثناء الاستمالة). FLLIT يجمع بين النهج الثاني والثالث ، وذلك باستخدام المعلمات المورفولوجية لتدريب خوارزمية تعزيز لتقسيم الساق. يسمح هذا FLLIT لتجاوز المهمة الشاقة للتعليق التوضيحي للمستخدم لإنشاء مجموعة بيانات التدريب ، مع تعزيز الدقة باستخدام التعلم الآلي. سيتعين على التحسينات المستقبلية على FLLIT التعامل مع الحالات التي تعبر فيها الساقين ، للسماح بتحليل السلوكيات الأكثر تعقيدًا.
FLLIT قوية لتغييرات طفيفة في الإضاءة، وتسجيل القرار وسرعة الإطار1. ومع ذلك ، يجب ألا تقل سرعة الإطار لمقاطع الفيديو المسجلة عن 250 إطارًا في الثانية ، ويتم تشغيل FLLIT بشكل مثالي لمقاطع الفيديو المسجلة بسرعة 1000 إطارًا في الثانية. إذا كان هناك ضبابية الحركة في الصور ، بحيث أنه من الصعب على المشروح البشري لتحديد موقف الساق ، فلن تتمكن FLLIT من تحديد نصائح الساق بدقة في تلك الإطارات. في ضوء ذلك ، من الضروري أن تركز الكاميرا بشكل حاد على نصائح الساق. لمنع القطع الأثرية التقسيم، يجب تنظيف الساحة جيدا، وينبغي عدم نقل أثناء التسجيل. للحصول على طرح دقيق للخلفية وتجزئة نظيفة ، يجب أن تتحرك الذبابة طول جسم واحد على الأقل أثناء التسجيل ، دون التوقف. بعد تجزئة التلقائي وتتبع وضع العلامات من جميع الساقين يجب التحقق. إذا لم يتم تعقب مشية الذبابة أو تعقبها بشكل خاطئ، يجب إعادة تتبع الملف يدويًا باستخدام خيار بدء التتبع يدويًا (الخطوة 5.2.7 – 5.2.10).
الأمراض العصبية واضطرابات الحركة تنتشر بشكل متزايد في مجتمعاتنا الشيخوخة. وقد درست نماذج ذبابة من التنكس العصبي لأكثر من 2 عقود، والتي تم خلالها التقدم فيما يتعلق بالجوانب الجزيئية والخلوية من الفيزيولوجيا المرضية. ومع ذلك ، كان من الصعب من الناحية الفنية تقييم العواقب السلوكية المحددة للمرض. على سبيل المثال ، في حين أن تقارير الحركات المرتجفة في الذبابة قد قدمت18،19، لم تتم دراسة هذه الكمية حتى وقت قريب1. كان قياس التسلق مقياسًا مفيدًا وكمية ، ولكنه خشن نسبيًا6. وبالمثل، أعاق هذا العجز التقني تحليل الحركة عالية الاستبانة في نماذج الحيوانات الأخرى. وبالتالي، فإن ظهور أدوات جديدة للتحليل السلوكي يبشر بتجديد شباب مجال اضطرابات الحركة لتمكين الباحثين من دراسة كيف تؤدي الآليات الجزيئية والخلوية للأمراض العصبية والعضلية إلى نتائج سلوكية محددة في النماذج الحيوانية. في هذه الورقة وفي عملنا السابق1، أظهرنا استخدام FLLIT التي تطير نماذج SCA3 معرض مشية ataxic hyperkinetic ، في حين أن نماذج ذبابة PD تعرض مشية جامدة hypokinetic ، خلاصة الحركة السمات المميزة للأمراض البشرية المعنية1. كما مكننا تحليل مشية لتحديد مجموعات الخلايا العصبية متميزة الكامنة وراء اختلالات حركة محددة. للمضي قدما، وتحليل الحركة مفصلة، جنبا إلى جنب مع التصوير قوية والأدوات الوظيفية المتاحة في الطاير، وسوف تسمح لنا للحصول على نظرة جديدة في آليات الخلل الحركي، وإلقاء الضوء على فهمنا للأمراض العصبية التنكسية فيما يتعلق بآليات الدائرة.
FLLIT ينبغي أن تكون قابلة للتطبيق على نطاق واسع لدراسة مشية في المفصليات الصغيرة الأخرى، كما ثبت سابقا أن تكون دقيقة للغاية لتتبع حركات ساق العنكبوت1. بينما نركز هنا على استخدام فيوجيب الحركة التفصيلية لتحديد المشية المسببة للأمراض ودوائرها الأساسية ، فإن التقدم في تتبع الحركة قد أحدث ثورة بالفعل ، وسيكون له تأثير مستمر على فهم تنسيق المشي العادي ومشيته والدوائر الأساسية ، خاصة في فروع مختلفة لا تعد ولا تحصى من الشجرة التطورية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفان أن يشكرا موهيتا تشاترجي وأليس ليو على الدعم الفني، ومركز بلومينغتون دروسوفيلا للأسهم (إنديانا، الولايات المتحدة الأمريكية) لتوفيرسلالات دروسوفيلا المستخدمة في هذا العمل. وقد دعم هذا العمل معهد البيولوجيا الجزيئية والخلوية، سنغافورة؛ معهد المعلوماتية الحيوية، سنغافورة؛ منظمة المجلس المشترك لوكالة تكنولوجيا العلوم والبحوث (المنحة رقم 15302FG149 إلى SA وLC)؛ البرنامج الرائد للبحوث السريرية (مرض باركنسون) الذي يديره المجلس الوطني للبحوث الطبية التابع لوزارة الصحة السنغافورية (رقم المنحة NMRC/TCR/013-NNI/2014 إلى SA)، وجامعة ألبرتا (منحة بدء التشغيل إلى LC)، ومجلس العلوم الطبيعية والبحوث الهندسية في كندا (NSERC) منحة الاكتشاف (رقم المنحة RGPIN-2019-04575 إلى LC).
Materials
| Acrylic Sheets | Dama | 1.6 mm thickness, Clear sheets | Singapore, Singapore |
| Clear Glass slides | Biomedia | BMH 880101 | Singapore, Singapore |
| High speed camera | Photron | Fastcam MC2.1 | Tokyo, Japan. A shutter speed of 1 msec or faster is ideal to reduce motion blur of captured images |
| Infra Red LED | Any – Generic from hardware store | 940nm Infrared Light Board | Singapore, Singapore |
| Kimwipe | Kimberly Clark | 34155-01LS | Irving, Texas, USA |
References
- Wu, S., et al. Fully automated leg tracking of Drosophila neurodegeneration models reveals distinct conserved movement signatures. PLoS Biology. 17 (6), 3000346 (2019).
- Mathis, A., et al. DeepLabCut: markerless pose estimation of user-defined body parts with deep learning. Nature Neuroscience. 19, 1281-1289 (2018).
- Pereira, T. D., et al. Fast animal pose estimation using deep neural networks. Nature Methods. 16 (1), 117-125 (2019).
- Machado, A. S., Darmohray, D. M., Fayad, J., Marques, H. G., Carey, M. R. A quantitative framework for whole-body coordination reveals specific deficits in freely walking ataxic mice. eLife. 4, (2015).
- Lu, B., Vogel, H. Drosophila models of neurodegenerative diseases. Annual Reviews in Pathology. 4, 315-342 (2009).
- McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. Drosophila as an In Vivo Model for Human Neurodegenerative Disease. Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).
- Dionne, H., Hibbard, K., Cavallaro, A., Kao, J. -. C., Rubin, G. M. Genetic reagents for making split-GAL4 lines in Drosophila. bioRxiv. , (2017).
- Cande, J., et al. Optogenetic dissection of descending behavioral control in Drosophila. eLife. 7, (2018).
- Nern, A., Pfeiffer, B. D., Rubin, G. M. Optimized tools for multicolor stochastic labeling reveal diverse stereotyped cell arrangements in the fly visual system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (22), 2967-2976 (2015).
- Xie, T., et al. A Genetic Toolkit for Dissecting Dopamine Circuit Function in Drosophila. Cell Reports. 23 (2), 652-665 (2018).
- Warrick, J. M., et al. Ataxin-3 suppresses polyglutamine neurodegeneration in Drosophila by a ubiquitin-associated mechanism. Molecular Cell. 18 (1), 37-48 (2005).
- Ebersbach, G., et al. Comparative analysis of gait in Parkinson’s disease, cerebellar ataxia and subcortical arteriosclerotic encephalopathy. Brain. 122 (7), 1349-1355 (1999).
- Stolze, H., et al. Typical features of cerebellar ataxic gait. Journal of Neurology, Neurosurgery and Psychiatry. 73 (3), 310-312 (2002).
- Mendes, C. S., Bartos, I., Akay, T., Marka, S., Mann, R. S. Quantification of gait parameters in freely walking wild type and sensory deprived Drosophila melanogaster. eLife. 2, 00231 (2013).
- DeAngelis, B. D., Zavatone-Veth, J. A., Clark, D. A. The manifold structure of limb coordination in walking Drosophila. eLife. 8, (2019).
- Gunel, S., et al. DeepFly3D, a deep learning-based approach for 3D limb and appendage tracking in tethered, adult Drosophila. eLife. 8, (2019).
- Isakov, A., et al. Recovery of locomotion after injury in Drosophila melanogaster depends on proprioception. The Journal of Experimental Biology. 219, 1760-1771 (2016).
- Aw, S. S., Lim, I. K. H., Tang, M. X. M., Cohen, S. M. A Glio-Protective Role of mir-263a by Tuning Sensitivity to Glutamate. Cell Reports. 19 (9), 1783-1793 (2017).
- Eberl, D. F., Duyk, G. M., Perrimon, N. A genetic screen for mutations that disrupt an auditory response in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (26), 14837-14842 (1997).
