Summary

Salix alba Leaves'ta Kizobiyotik Metabolizmasının Kütle Spektrometresi Görüntüleme Yoluyla Araştırılması

Published: June 15, 2020
doi:

Summary

Bu yöntem, ksenobiyotiklere maruz kaldığında S. alba yapraklarındaki metabolik süreçleri anlamak için kütle spektrometresi görüntüleme (MSI) kullanır. Yöntem, belirli, bozulmamış dokular içinde ilgi çekici bileşiklerin ve tahmin edilen metabolitlerin mekansal lokalizasyonuna izin verir.

Abstract

Sunulan yöntem, ksenobiyotiklere maruz kaldığında S. alba yapraklarının metabolik profilini oluşturmak için kütle spektrometresi görüntüleme (MSI) kullanır. Hedefsiz bir yaklaşım kullanılarak, bitki metabolitleri ve ilgi çekici ksenobiyotikler, belirli dağılım kalıplarını ortaya çıkarmak için bitki dokularında tanımlanır ve lokalize edilir. Daha sonra, tanımlanan ksenobiyotiklerden potansiyel metabolitlerin (yani katabolitlerin ve konjugelerin) siliko tahmini yapılır. Dokuda bir ksenobiyotik metabolit bulunduğunda, bitki tarafından değiştirilmesinde rol oynayan enzim türü kaydedilir. Bu sonuçlar, yapraklardaki ksenobiyotik birikime yanıt olarak S. alba yapraklarında meydana gelen farklı biyolojik reaksiyon türlerini tanımlamak için kullanılmıştır. Metabolitler iki nesilde tahmin edildi ve art arda gelen biyolojik reaksiyonların belgelenmesine izin vererek yaprak dokularındaki ksenobiyotikleri dönüştürdü.

Introduction

Kizobiyotikler, insan faaliyetleri nedeniyle dünya çapında yaygın olarak dağıtılmaktadır. Bu bileşiklerin bazıları suda çözünür ve toprak1tarafından emilir ve bitki dokularında biriktiklerinde besin zincirine girer 2,3,4. Bitkiler, diğer organizmaların avı olan böcekler ve otçullar tarafından yenir. Bazı ksenobiyotiklerin alımı ve bir bitkinin sağlığı üzerindeki etkileri5, 6,7,8,ancak son zamanlarda doku düzeyinde9olarak tanımlanmıştır. Bu nedenle, ksenobiyotik metabolizmasının nerede veya nasıl oluştuğu veya spesifik bitki metabolitlerinin belirli dokularda ksenobiyotik birikimle ilişkili olup olmadığı hala belirsizdir10. Dahası, çoğu araştırma ksenobiyotiklerin metabolizmasını ve bitkilerdeki metabolitlerini gözden kaçırmıştır, bu nedenle bitki dokularındaki bu reaksiyonlar hakkında çok az şey bilinmektedir.

Burada önerilen, biyolojik örneklerde alt tabakaların ve reaksiyonların ürünlerinin doku lokalizasyonu ile ilişkilendirilebilen enzimmatik reaksiyonları araştırmak için bir yöntemdir. Yöntem, bir deneyde biyolojik bir örneğin tam metabolik profilini çizebilir, çünkü analiz hedefsizdir ve özel ilgi analit listeleri kullanılarak araştırılabilir. Sağlanan, özgün veri kümesinde izlenen adayların bir listesidir. Örnekte bir veya birkaç ilgi analitleri dikkat çekiyorsa, spesifik doku lokalizasyonu ilgili biyolojik süreçler hakkında önemli bilgiler sağlayabilir. İlgi analitleri daha sonra olası ürünleri / metabolitleri aramak için ilgili biyolojik yasalar kullanılarak silikoda değiştirilebilir. Elde edilen metabolitlerin listesi daha sonra ilgili enzimleri tanımlayarak ve dokulardaki reaksiyonları lokalize ederek orijinal verileri analiz etmek için kullanılır, böylece meydana gelen metabolik süreçlerin anlaşılmasına yardımcı olur. Başka hiçbir yöntem, biyolojik örneklerde meydana gelen reaksiyon türleri, ilgi bileşiklerinin lokalizasyonu ve ilgili metabolitleri hakkında bilgi sağlamaz. Bu yöntem, taze ve bozulmamış dokular mevcut olduğunda ve ilgi bileşikleri iyonize edilebilir. Önerilen protokol Villette ve ark.12’de yayınlandı ve bilim topluluğu tarafından kullanılmak üzere burada ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Protocol

1. Numune hazırlama Biyolojik numuneyi alın ve taze ve sağlam tutun (örneğin, bir tüpe zorlamayın) veya dondurun. Önerilen protokol, belirli dokulardaki bileşikleri lokalize etmek için her türlü katı biyolojik örnek (örneğin, bitki, hayvan veya insan dokuları) için geçerlidir. Kriyomikrotom’u -20 °C’ye soğutin. Numune tutucuyu ve bıçağı aynı sıcaklıkta tutun. Gerekirse, kesme sırasında korumak için nesneyi M1 gömme ortamına gömün. Kriyomikrotom oda…

Representative Results

Bu protokol, ortamda ksenobiyotiklere maruz kalan bir S. alba ağacından örneklenen taze yapraklara uygulandı. İşlem Şekil 1’de tasvir edilir. İlk adım, ilgi örneğinin ince dilimlerini hazırlamaktır. Dokular heterojen olduğundan ve su ve/ veya hava içerebildiğinden, bitki örneklerinin kesilmesi genellikle hayvan örneklerinden daha zordur. Bu zorluk, numunenin etrafında homojen bir blok oluşturan gömme ortamı kullanılarak gerçekleştirilendir. Matris birikimi, …

Discussion

Bu protokolün kritik kısmı örnek hazırlamadır: numune yumuşak ve sağlam olmalıdır. Numunenin sıcaklığı ve kalınlığı çalışılan numunenin türüne bağlı olarak değişebileceğinden, kesim en zor kısımdır. Hayvan dokuları genellikle homojendir ve kesilmesi daha kolaydır. Bitki örnekleri genellikle farklı yapılar içerir ve bu nedenle bıçak yumuşak, sert veya boş vasküler dokularla karşılaştığından bozulmadan tutulması daha zordur. Hidrofilik dokularda buz oluşumunu ve yok olmas?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Charles Pineau, Mélanie Lagarrigue ve Régis Lavigne’e bitki örneklerinin MALDI görüntülemesi için numune hazırlığı ile ilgili ipuçları ve püf noktaları için teşekkür ederiz.

Materials

Cover slips Bruker Daltonics 267942
Cryomicrotome Thermo Scientific
Excel Microsoft corporation
flexImaging Bruker Daltonics
ftmsControl Bruker Daltonics
GTX primescan GX Microscopes
HCCA MALDI matrix Bruker Daltonics 8201344
ImagePrep Bruker Daltonics
ITO-coated slides Bruker Daltonics 237001
M1-embedding matrix ThermoScientific 1310
Metabolite Predict Bruker Daltonics
Metaboscape Bruker Daltonics
Methanol Fisher Chemicals No specific reference needed
MX 35 Ultra blades Thermo Scientific 15835682
Plastic molds No specific reference needed
SCiLS Lab Bruker Daltonics
SolariX XR 7Tesla Bruker Daltonics The method proposed is not limited to this instrument
Spray sheets for ImagePrep Bruker Daltonics 8261614
TFA Sigma Aldrich No specific reference needed

References

  1. Zhang, D., Gersberg, R. M., Ng, W. J., Tan, S. K. Removal of pharmaceuticals and personal care products in aquatic plant-based systems: A review. Environmental Pollution. 184, 620-639 (2014).
  2. Adeel, M., Song, X., Wang, Y., Francis, D., Yang, Y. Environmental impact of estrogens on human, animal and plant life: A critical review. Environment International. 99, 107-119 (2017).
  3. Prosser, R. S., Sibley, P. K. Human health risk assessment of pharmaceuticals and personal care products in plant tissue due to biosolids and manure amendments, and wastewater irrigation. Environment International. 75, 223-233 (2015).
  4. Wang, J., et al. Application of biochar to soils may result in plant contamination and human cancer risk due to exposure of polycyclic aromatic hydrocarbons. Environment International. 121, 169-177 (2018).
  5. Marsik, P., et al. Metabolism of ibuprofen in higher plants: A model Arabidopsis thaliana cell suspension culture system. Environmental Pollution. 220, 383-392 (2017).
  6. He, Y., et al. Metabolism of ibuprofen by Phragmites australis: uptake and phytodegradation. Environmental Science and Technology. 51 (8), 4576-4584 (2017).
  7. Huber, C., Bartha, B., Harpaintner, R., Schröder, P. Metabolism of acetaminophen (paracetamol) in plants-two independent pathways result in the formation of a glutathione and a glucose conjugate. Environmental Science and Pollution Research. 16 (2), 206-213 (2009).
  8. Thomas, F., Cébron, A. Short-term rhizosphere effect on available carbon sources, phenanthrene degradation, and active microbiome in an aged-contaminated industrial soil. Frontiers in Microbiology. 7, 1-15 (2016).
  9. Villette, C., et al. In situ localization of micropollutants and associated stress response in Populus nigra leaves. Environment International. 126, 523-532 (2019).
  10. Sandermann, H. Plant metabolism of organic xenobiotics. Status and prospects of the ‘Green Liver’ concept. Plant Biotechnology and In Vitro Biology in the 21st Century. , 321-328 (1999).
  11. Sula, B., Deveci, E., Özevren, H., Ekinci, C., Elbey, B. Immunohistochemical and histopathological changes in the skin of rats after administration of lead acetate. International Journal of Morphology. 34 (3), 918-922 (2016).
  12. Villette, C., Maurer, L., Wanko, A., Heintz, D. Xenobiotics metabolization in Salix alba leaves uncovered by mass spectrometry imaging. Metabolomics. 15, 122 (2019).
  13. Khatib-Shahidi, S., Andersson, M., Herman, J. L., Gillespie, T. A., Caprioli, R. M. Direct Molecular Analysis of Whole-Body Animal Tissue Sections by Imaging MALDI Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 78 (18), 6448-6456 (2006).

Play Video

Cite This Article
Villette, C., Maurer, L., Heintz, D. Investigation of Xenobiotics Metabolism In Salix alba Leaves via Mass Spectrometry Imaging. J. Vis. Exp. (160), e61011, doi:10.3791/61011 (2020).

View Video