Determinazione dell'efficienza dell'inibitore chimico contro la crescita intracellulare del Toxoplasma Gondii utilizzando un saggio di crescita basato su Luciferase
Summary
Presentato qui è un protocollo per valutare l’efficacia dell’inibizione dei composti chimici contro la crescita intracellulare in vitro di Toxoplasma gondii utilizzando un analisi della crescita basata sulla luciferasi. La tecnica viene utilizzata per confermare la specificità dell’inibizione mediante la delezione genetica del gene bersaglio corrispondente. L’inibizione di LHVS contro la proteasi TgCPL viene valutata come esempio.
Abstract
Il toxoplasma gondii è un patogeno protozoo che colpisce ampiamente la popolazione umana. Gli attuali antibiotici utilizzati per il trattamento della toxoplasmosi clinica sono limitati. Inoltre, essi esibiscono effetti collaterali negativi in alcuni gruppi di persone. Pertanto, la scoperta di nuove terapie per la toxoplasmosi clinica è imperativa. Il primo passo dello sviluppo di nuovi antibiotici è quello di identificare composti chimici che mostrano un’elevata efficacia nell’inibizione della crescita dei parassiti utilizzando una strategia di screening ad alto throughput. Come agente patogeno intracellulare obbligato, Toxoplasma può replicarsi solo all’interno delle cellule ospiti, il che vieta l’uso di misurazioni ottiche di assorbimento come indicatore rapido della crescita. Presentato qui è un protocollo dettagliato per un saggio di crescita di luciferasi. Ad esempio, questo metodo viene utilizzato per calcolare il tempo di raddoppio dei parassiti Toxoplasma di tipo selvatico e misurare l’efficacia del morfnurea-leucyl-omofenicolo-vicinquel-vinile sulfone fenil (LHVS, un composto che mira la proteasi cisteina) per quanto riguarda l’inibizione della crescita intracellulare. È stato descritto anche un protocollo di eliminazione genica basato su CRISPR-Cas9 nel Toxoplasma che utilizza regioni omologhe da 50 bp per la ricombinazione dipendente dall’omologia (HDR). Quantificando i efficacidi di inibizione di LHVS in wild-type e TgCPL (Toxoplasma cathepsin L-like protease)-deficiente-deficiente parassiti, è dimostrato che LHVS inibisce la crescita del parassita di tipo selvatico più efficiente rispetto alla crescita zcpl, suggerendo che TgCPL è un obiettivo che LHVS si lega a Toxo. L’elevata sensibilità e il facile funzionamento di questo analisi della crescita di luciferasi lo rendono adatto per monitorare la proliferazione di Toxoplasma e valutare l’efficacia dei farmaci in modo ad alto consumo.
Introduction
Toxoplasma gondii è un parassita intracellulare di grande successo che infetta circa un terzo della popolazione umana. Il suo alto tasso di trasmissione è principalmente dovuto alle sue diverse vie di trasmissione, tra cui il consumo di carne poco cotta, l’esposizione ai serbatoi di mammiferi e la trasmissione congenita durante la nascita. T. gondii provoca principalmente infezioni opportunistiche che possono portare a una grave morbilità e mortalità in individui immunocompromessi1,2,3,4,5,6. Gli antibiotici attualmente utilizzati per il trattamento della toxoplasmosi acuta sono particolarmente inefficienti nel trattamento delle infezioni congenite e latenti e causano gravi reazioni in alcuni individui3,7,8. Pertanto, esiste un’urgente necessità di identificare nuove terapie. Comprendere le differenze nei processi subcellulari all’interno di Toxoplasma e del suo ospite aiuterà a identificare potenziali bersagli farmacologici. Pertanto, sono necessarie tecniche di manipolazione del genoma efficienti e convenienti per studiare i ruoli dei singoli geni all’interno di Toxoplasma. Inoltre, Toxoplasma appartiene al phylum Apicomplexa, che include diversi altri patogeni umani significativi, come Plasmodium spp. e Cryptosporidium spp. Quindi, Toxoplasma può essere utilizzato come organismo modello per aiutare a studiare la biologia di base in altri parassiti apicomplessi.
Per identificare nuovi antibiotici contro gli agenti patogeni microbici, viene inizialmente eseguito lo screening ad alto throughput di una biblioteca di composti chimici per determinarne l’efficacia nella repressione della crescita microbica. Finora, sono stati sviluppati diversi saggi di crescita basati su microplaciper per misurare la crescita intracellulare di T. gondii (cioè, quantificazione radioattiva 3H-uracil basata sull’incorporazione9, rilevamento quantitativa dei parassiti a base di ELISA utilizzando anticorpi specifici T. gondii10,11, misurazione basata sulle proteine dei reporter utilizzando ceppi Toxoplasma che esprimono YFP12,13e un’imaging ad alto contenuto recentemente sviluppata comesay14).
Queste strategie individuali hanno tutti vantaggi unici; tuttavia, alcune limitazioni limitano anche le loro applicazioni. Ad esempio, poiché il toxoplasma può replicarsi solo all’interno di cellule animali nucleate, l’autofluorescenza e il legame non specifico di anticorpi anti-T.gondii per ospitare le cellule causano interferenze nelle misurazioni basate sulla fluorescenza. Inoltre, l’uso di isotopi radioattivi richiede una particolare conformità alla sicurezza e potenziali problemi di sicurezza. Alcuni di questi saggi sono più adatti per valutare la crescita in un unico momento piuttosto che un monitoraggio continuo della crescita.
Presentato qui è un protocollo basato su luciferasi per la quantificazione della crescita intracellulare del Toxoplasma. In uno studio precedente, il gene della luciferasi di NanoLuc è stato clonato sotto il promotore di tubulina Toxoplasma, e questo costrutto di espressione luciferasi è stato transincato in parassiti di tipo selvaggio (RHku80) per creare un RHku80zhxg::ceppo NLuc (chiamato RHku80::NLuc qui dopo)15. Questo ceppo è servito come ceppo parentale per la determinazione della crescita intracellulare e la delezione genica in questo studio. Utilizzando il ceppoRH-ku80::NLuc, la crescita dei parassiti nei fibroblasti prepuzio (HFF) è stata monitorata in un periodo di 96 ore dopo l’infezione per calcolare il tempo di raddoppio del parassita.
Inoltre, l’efficacia dell’inibizione di LHVS contro la crescita dei parassiti può essere determinata tracciando i tassi di crescita di Toxoplasma contro le concentrazioni seriali di LHVS per identificare il valore di IC50. Letteratura precedente ha riferito che TgCPL è un obiettivo principale di LHVS nei parassiti e che il trattamento con LHVS diminuisce lo sviluppo di infezioni toxoplasma acute e croniche16,17,18,19. Inoltre, ilku80ceppo parentale per la modifica del genoma èstato utilizzato come ceppo parentale per generare un ceppo TgCPL-deficiente (RHku80::NLuc), e l’inibizione di LHVS è stata misurata rispetto a questo mutante. Osservando un upshift di valori DiC50 per LHVS nei parassiti carenti di TgCPLrispetto al ceppo WT, è stato convalidato che TgCPL è preso di mira da LHVS in vivo.
In questo protocollo, RHku80::NLuc viene utilizzato come ceppo parentale, che manca di un efficiente percorso di giunzione finale non omologa (NHEJ), facilitando così la ricombinazione dipendente da omologia crossover (HDR)20,21. Inoltre, le regioni omologhe di 50 bp sono affiancate ad entrambe le estremità di una cassetta di resistenza ai farmaci da PCR. Il prodotto PCR funge da modello di riparazione per rimuovere l’intero locus genico tramite HDR utilizzando strumenti di editing del genoma basati su CRISPR-Cas9. Tali regioni omologhe brevi possono essere facilmente incorporate in primer, fornendo una comoda strategia per la produzione del modello di riparazione. Questo protocollo può essere modificato per eseguire la delezione genica universale e l’etichettatura genica endogena.
Ad esempio, nella nostra pubblicazione più recente, tre geni proteasi, TgCPL, TgCPB ( Proteasi a cathepsina B-comeToxoplasma) e TgSUB1 ( proteasi simile allatossoplasma 1), sono stati geneticamente ablati in TgCRT (Toxoplasma cloroleccanter-resistanceer) parassiti carenti utilizzando questo metodo15. Inoltre, TgAMN (aminopeptidase putativo N [TgAMN, TGGT1_221310]) è stato etichettato endogenamente15. Il laboratorio di Lourido ha anche riferito di aver usato brevi regioni omologhe nell’intervallo di 40-43 bp per l’introduzione della mutazione genica diretta dal sito e dell’etichettatura genica endogena nel genoma del Toxoplasma utilizzando un metodo simile22. Queste modifiche del genoma di successo suggeriscono che una regione omologa di 40-50 bp è sufficiente per una ricombinazione efficiente del DNA nel ceppo tgKU80-carente,che semplifica notevolmente la manipolazione del genoma in Toxoplasma gondii.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo descrive un protocollo basato su luciferasi per valutare la crescita intracellulare del Toxoplasma e valutare l’efficacia dell’inibizione dei composti chimici contro la crescita dei parassiti. Rispetto alle strategie esistenti per misurare la crescita intracellulare del Toxoplasma, questo metodo presenta un’elevata sensibilità e specificità. Durante il monitoraggio della crescita del parassita, si raccomanda un saggio fittizio in una micropiastra chiara 96 bene per confermare che il …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare i dottori Sibley e Carruthers per aver condiviso pSAG1-Cas9-sgRNA-TgUPRT plasmid e anticorpi anti-TgCPL e TgActin. Questo lavoro è stato sostenuto dal fondo Clemson Startup (a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell’analisi dei dati, nella decisione di pubblicazione o nella preparazione del manoscritto.
Materials
| Agarose gel extraction kit | New England BioLabs | T1020L | |
| BamHI | New England BioLabs | R0316S | |
| Biotek Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader | BioTek Instuments | ||
| BTX Gemini Twin Waveform Electroporation System | Harvard Apparatus | ||
| Chemically competent E. coli cells | New England BioLabs | C29871 | |
| CloneAmp HiFi PCR premix | Takara Bio | 639298 | |
| Coelenterazine h | Prolume | 301-10 hCTZ | |
| EcoRV | New England BioLabs | R3195S | |
| Phire Tissue Direct PCR Master Mix | Thermo Scientific | F170L | |
| Plasmid miniprep kit | Zymo Research | D4054 | |
| Q5 Site-Directed Mutagenesis kit | New England BioLabs | E0554S | |
| Software | |||
| Geneious software for sgRNA design (version: R11) | |||
| GraphPad Prism software (8th version) | |||
| SnapGene for molecular cloning (version: 4.2.11) |
References
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